Abstract
단백질 - 단백질 상호 작용은 유기체의 살아있는 세포의 항상성 및 제어 공정의 대부분을 매개한다. 장애인 단백질 상호 작용은 단백질 상호 작용에게 중요한 약물 표적을, 질병의 원인이 될 수 있습니다. 이것은 분자 레벨에서의 이러한 상호 작용을 이해하는 것이 매우 중요하다. 단백질 상호 작용은 세포의 생화학 적 분석에서 양적 생물 리 학적 분석법에 이르는 다양한 기술을 이용하여 연구하고 있으며, 이들 도메인은 단백질 또는 펩타이드와, 전체 길이 단백질과 중 수행 될 수있다. 펩타이드는 펩타이드가 용이하게 합성 할 수 있기 때문에 단백질의 상호 작용을 연구하고, 특정 상호 작용 사이트에 집중 할 수 있도록 우수한 도구를 제공합니다. 펩타이드 어레이는 치료 목적 표적 단백질에 결합 펩티드 두 단백질 사이의 상호 작용 위치의 식별뿐만 아니라 스크리닝을 가능하게한다. 그들은 또한 높은 처리량 SAR 연구를 할 수 있습니다. 결합 부위, typi의 식별을위한학적 펩타이드 어레이는 일반적으로 부분적으로 원하는 타겟 단백질의 하나 또는 그 이상의 파트너 단백질의 전체 서열로부터 유도 된 10 내지 20 잔기 펩티드 겹치는 포함. 표적 단백질을 바인딩 어레이 스크리닝 단백질 만 소량 사용 쉽고 빠른 방법에서 파트너 단백질의 결합 부위에 대응하는, 펩티드 결합을 보여준다.
이 문서에서 우리는 목적 단백질과 파트너 사이의 상호 작용 사이트를 매핑하는 펩타이드 배열을 선별하기위한 프로토콜을 설명합니다. 펩티드 배열은 고려 그들의 이차 구조를 고려 파트너 단백질의 서열에 기초하여 설계된다. 이 프로토콜에 사용되는 배열은 INTAVIS 바이오 어낼 리티 컬 인스트루먼트 준비 Celluspots 배열했다. 이 배열은 바인딩 불특정 한 후 연구 단백질 배양 방지하기 위해 차단됩니다. 항체를 이용하여 검출 단백질 간의 특이 적 상호 작용 부위에 대응하는 펩타이드 결합을 보여준다.
Introduction
단백질 - 단백질 상호 작용은 살아있는 세포에서의 처리의 대부분을 매개한다. 장애인 단백질 상호 작용은 단백질 상호 작용에게 중요한 약물 표적을, 질병의 원인이 될 수 있습니다. 이것은 분자 레벨에서의 이러한 상호 작용을 이해하는 것이 매우 중요하다. 단백질 상호 작용은 세포의 생화학 적 분석에서 양적 생물 리 학적 분석법에 이르는 다양한 기술을 이용하여 연구하고 있으며, 이들 도메인은 단백질 또는 펩타이드와, 전체 길이 단백질과 중 수행 될 수있다. 펩타이드는 단백질 상호 작용을 연구하는 우수한 도구를 제공합니다. 펩티드는 쉽게 합성 한 손과 반면 1,2에 고 스루풋 방식으로 다수의 표적 단백질에 특이 적 상호 작용 부위에 초점을 허용 할 수 있기 때문이다. 펩타이드 어레이 스크리닝은 빠르고, 단시간 (3)에 다수의 파트너와 표적 단백질의 상호 작용에 관한 많은 양의 데이터를 획득하기위한 방법을 수행하기 쉬운. 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하고 분석하기위한 다른 생화학 또는 생물 물리학 적 방법과 달리, 펩티드 배열 선별은 단백질의 매우 낮은 농도를 필요로하며, 매우 약한 결합 검출 할 수있다. 펩타이드 배열이 효소의 활동 (6)과 높은 처리량을 연구, 단백질 - 단백질 또는 수용체 - 리간드 상호 작용 사이트 4, 동종 또는 이종 올리고머 인터페이스의 매핑과 같은 펩타이드 - 단백질 상호 작용에 많은 응용 프로그램의 특성 항체를 5 항원 사용할 수있는 구조 - 활동 관계 (SAR)는 7 연구. 펩타이드 배열 검사에 대한 심도있는 검토를 위해 카츠 등을 참조하십시오. 4
펩타이드 어레이의 여러 유형 현재 존재한다. 펩타이드의 합성을 주로 SPOT 기법 4,8를 사용하여, 직접 고체 지지체에 펩티드의 고체 지지체, 또는 합성을 부착하기 전에 : 펩타이드 어레이를 만들기위한 두 가지 주요 합성 전략이있다.펩티드는 9- 플루 오레 닐 옥시 카보 닐 (Fmoc) 화학 (8)에 의해 일반적으로 고체 지지체 상에 합성된다. 일반적인 합성 기법 중 C 말단을 통해 펩타이드 N 말단을 통해 첨부 파일 (예를 들어, JPT의 pepstar 배열 9) 및 펩타이드 첨부 파일은 (예를 들어, PEPSCAN의 pepchip 어레이 (10), JPT의 pepspot 배열 9 INTAVIS의 celluspot 어레이 (11)) 4. 고체 지지체는 다양하며, 그래서 그것에 펩타이드 결합의 화학적 성질을 수행 할 수 있습니다. Cys 또는 말단 펩티드는 티올 기 (12)를 통해 유리 슬라이드에 부착 될 수있다. 펩티드의 N 말단이 공유 결합 된 아미노산의 에스테르 화를 통해 셀룰로오스 막에 수산기에 결합 될 수있는 8 첨부.
여기서 우리는 단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하기위한 방법으로 펩타이드 어레이 스크리닝 상세한 프로토콜을 제시한다. 우리가 사용하는 배열은 큰 AMO를 포함하는 마이크로 어레이 인 Celluspots 배열입니다유리 슬라이드에서 지원하는 작은 셀룰로오스 막에 점 (384 점 중복)의 UNT. 이 낮은 단백질의 볼륨과 항체 작업과 하나의 실험 당 데이터의 상당한 양을 획득 할 수 있습니다. 이 배열은 또한 바인딩 선호도가 낮은 검출 할 수 있습니다 높은 펩타이드 밀도가 포함되어 있습니다. 어레이는 정상 세포 증식 (13)을 제어하기에 매우 중요하다 STIL-CHFR 상호 작용을 매핑하기 위해 사용되었다. 두 단백질 사이의 상호 작용은 제어되지 않은 암의 발생을 초래할 수있다. 이 상호 작용을 매핑하여 우리는 특정 결합 부위와 잔여 14 바인딩을 발견했다. 이것은이 단백질 - 단백질 상호 작용을 억제하는 억제제 합리적 설계를위한 길을 열어.
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Protocol
1. 펩타이드 어레이 설계
- 부분적으로 10 ~ 20 잔기 펩티드 겹치는에 표적 단백질의 서열을 나눈다. 특정 실험에 오버랩 량과 행하는 실험실 자원 있지만 원칙적 긴 오버랩을 더 다양하다. 펩타이드의 상호 작용에 대한 책임을 질 수있는 단백질 계정 알려진 이차 구조 요소를 고려 설계 할 때.
- 상업 업체를 통해 설계 펩타이드 배열을 주문. 여기서, 사용 펩티드 공유 C 말단을 통해 어레이에 결합.
바인딩 2. 차단 비 특정
- 0.05 % 트윈 -20 (TBST / PBST)를 함유하는 50mM 트리스 또는 포스페이트 완충액을 확인하고 (정확한 이온 강도를 알기 위해)의 HCl 또는 NaOH를 측정 된 양 및 NaCl을 사용하여 원하는 이온 강도와 원하는 pH로 조정 . 여기에서, 7.5의 pH 및 150 mm의 이온 세기를 사용한다.
- 의 블로킹 용액을 만들기2.5 %는 (W / v)의 TBST / PBST에서 탈지유 분말.
- 비특이적 결합을 방지하기 위해, 차단 용액 5ml에 배열 몰입. 2-4 상온에서 시간 또는 하룻밤 진탕 4 ºC에서의 배열을 품어.
3. 단백질과 배양
- 실온에서 진탕 기에서 5 분 동안 5 ㎖를 TBST / PBST 회 30 초 동안 차단 용액과 5 ml의 제 배열을 씻는다.
- (v가 / w) 비특이적 결합을 방지하기 탈지유 분말 2.5 %를 함유하는 그의 태그 된 단백질 용액 5 ㎖로 세척하고 어레이를 부화. 여기서, 설명 블로킹 용액에 용해 된 단백질 용액의 4.5 μM (STIL 500-650)을 사용한다.
NOTE : 보통 5-10 μM 단백질은 선별을 위해 사용되지만, 단백질 농도는 결합 친화력과의 로컬 어레이에 결합 된 펩타이드의 농도 (효율에 따라, 심지어 낮은 2-3 μM 일 수있다 합성). 버퍼있는 단백질다양 할 수 있지만, 상술 한 용해 같은 차단 용액을 사용하여 단백질을 희석하는 것이 일반적이다. - 실온에서 밤새 또는 4 ºC에서 3-8 시간 동안 단백질 용액을 인큐베이션 어레이.
4. 항체와 함께 배양
- 5 ml의 TBST / PBST로 배열을 세 번 씻으십시오. 처음 세탁은 실온에서 진탕에 두 5 분 세척 한 다음 30 초입니다.
- 실온에서 쉐이커상에서 1 시간 동안 블로킹 용액과 동일한 농도에서 동일한 성분을 함유 배양 완충액 : 희석 된 HRP 컨쥬 게이트 된 항체 5 ㎖ (1500 1)로 세정 배열 부화. 항체는 표적 단백질 또는 태그 중 하나를 결합 할 수있다.
- 인트없이 동일한 프로토콜을 반복함으로써 배열 표적 단백질 (예를 들어, 올리고머 화를위한 연구)로부터 펩티드를 포함 특히 어레이 펩타이드 항체의 상호 작용을 시험 대조 실험을 수행P (3), 단백질과 인큐베이션.
- 5 ml의 TBST / PBST로 배열을 세 번 씻으십시오. 처음 세탁은 실온에서 진탕에 두 5 분 세척 한 다음 30 초입니다.
5. 배열을 읽기
- ECL 웨스턴 블로 팅 기판 키트와 함께 발광 개발을 수행하십시오.
- 발광 이미지 분석기로 검출을 수행.
- 결과를 분석합니다. 어레이의 두 중복이 같은 신호를 보여, 그래서 결과를 신뢰할 수 있는지 확인합니다. 파트너 단백질의 구조가 알려지면, 결합 펩티드 구조에서 검색하고 결합 부위를 찾는다. 순서에 멀리있다하더라도 펩타이드는 차 구조에 가깝게하고 구속력있는 사이트를 만들 수 있습니다.
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Representative Results
STIL은 매우 중요 centrosomal 단백질이다. 19 - 그것은 정상적인 세포 분열 및 세포 증식을 13, 15를 제어합니다. STIL 여러 단백질 18,20,21과 상호 작용하고 상호 작용의 대부분은 본질적으로 무질서 지역 (IDR) (14) 자사의 중앙 부분을 통해 발생합니다. 우리는 STIL 결합 단백질 CHFR에서 유래 펩타이드로 구성된 배열을 설계했습니다. CHFR 스트레스 22 유사 분열에 응답하여 유도되는 종양 억제이다. CHFR의 STIL 결합 도메인의 구조가 시간에 알려지지 않았다 때문에 프로토콜의 단계 1.1에 기재된 바와 같이, 우리는 7 잔기의 오버랩으로 15 잔기 긴 펩티드 단백질 도메인을 분할. 전술 한 프로토콜에 설명하고도 1에 도시 된 바와 같이 우리는 CHFR-STIL 결합 부위를 식별하기위한 스크리닝 펩티드 배열을 수행. 우리를 제공 할 수 중복 384 펩티드 이루어지는 INTAVIS Celluspot 어레이를 사용 정보의 엄청난 양의 그림 2에 설명 된대로. 우리는 결합 단백질 CHFR (그림 3)에 STIL에 대한 결합 부위 발견이 펩타이드 배열을 사용. 배열의 각 검은 반점은 STIL 바운드 CHFR 유래 펩타이드를 나타냅니다. 이 결과의 신뢰성을 검증 중복에 존재하므로 각각의 펩타이드가 두 번 표시합니다. STIL과 CHFR 사이의 상호 작용은 이전에 단백질 수준 13, 14에서 시연되었다. 펩타이드 배열 검사가 STIL IDR 바인딩 7 CHFR 유래 펩티드를 밝혀, 500-650 잔류 물 (그림 3, Amartely 등. 14). 이러한 결과는 우리가 CHFR에 STIL의 결합 부위를 매핑 할 수있었습니다. CHFR 차 순서에 이들 7 펩타이드의 거리에도 불구하고 그들은 (그림 4) 14 CHFR에 STIL에 대한 잘 정의 된 결합 부위를 만듭니다.
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도 1 : 펩티드 어레이 스크리닝 방식 A-, 하나 또는 그 이상의 파트너 단백질 유래의 부분적으로 중첩 된 펩티드로 구성 펩타이드 어레이 설계 계정 그들의 이차 구조를 고려;. 표적 단백질과 인큐베이션 B-; 검출 항체와 배양 C-; D- 검출은 (화학 발광, 형광 등을 수행 할 수 있습니다) E- 결과를 분석하는 사이트를 결합 단백질을 표시 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 :. 펩타이드 배열 검사 탐지의 예는 발광을 사용하여 달성 슬라이드 중복으로 두 개의 동일한 배열을 포함하고 있습니다..ES / ftp_upload / 52097 / 52097fig2large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : CHFR 단백질 STIL IDR의 결합에 대한 펩타이드 배열을 선별 : 4.5 μM 그의-태그 STIL 500-650 배열을 바인딩 상영되었다. 각각의 검은 점은 STIL 조각과 CHFR 유래 펩타이드 (14) 사이의 바인딩을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : CHFR Cys이고 풍부한 도메인의 구조에 표시 CHFR의 STIL 결합 부위 (잔류 물 424-661, PDB ID : 2XPO) 일곱.펩타이드 배열 검사에 STIL을 결합 펩타이드는 기본 순서 먼하지만 한 바인딩 사이트를 만드는 3 차원 구조에서 함께 닫습니다 핑크, 오렌지와 레드 컬러 세 지역으로 나눌 수 있습니다. 이 전체 영역이 이합체 CHFR 14 STIL에 대한 바인딩 주머니를 형성한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
펩타이드 어레이 스크리닝 파트너에서 표적 단백질의 결합 부위를 식별하기위한 훌륭한 도구이다. 상기 분석을 수행하기 쉽고 빠르게 결과는 하나 또는 두 개의 일 얻을 수있다. 펩타이드 어레이 스크리닝 다재다능 많은 목적을 위해 사용될 수있다. 그것은 예컨대 인산화와 같은 번역 후 변형을 특성화하고 키나제의 기판을 식별하는데 사용될 수있다. 예 : 급성 골수성 백혈병 관련이 FLT3 키나제, 펩티드 배열 (6) 스크리닝에 의해 발견 티르 - 함유 기질 펩티드를 인산화. 티로신 키나제 억제제의 파 조파 닙과 라파티닙의 억제 특성은 23 스크리닝 펩타이드 어레이를 사용하여 테스트 하였다. 펩티드 배열은 단백질 - 단백질 상호 작용을 중개 사이트를 식별하기 위해 사용될 수있다. 이 방법을 사용하여 우리의 실험실에서 연구 단백질의 예는 다음과 같습니다 HIV-1 VIF 단백질 및 세포 A3G 단백질 사이의 상호 작용이 우리를 특징으로했다펩타이드 어레이 (24)를 보내고; 펩타이드 어레이 검사는 친 사멸 ASPP2 단백질 25 자멸 억제 BCL-2 패밀리의 상호 작용을 연구하고 미토콘드리아 단백질 MTCH2 26, tBID, BCL-2 패밀리의 구성원의 결합을 연구하기 위해 사용되었다; 미오신 IIC 도메인간에 분자 내 상호 작용은 27 스크리닝 펩타이드 어레이를 사용하여 분석 하였다. 여기서 우리는 STIL-CHFR 상호 작용, 증식 및 암 (14)에 중요한 단백질 - 단백질 상호 작용을 매개하는 사이트를 식별하기위한 스크리닝 펩타이드 어레이를 사용하는 방법의 예를 제시한다. 정확한 결합 부위를 공개하는 것은 연구의 상호 작용 억제제의 합리적인 설계를위한 기초 역할을 할 수 있습니다.
펩타이드 배열 검사는 정량적 인 분석이 아니다. 어레이상의 각 지점에서의 펩티드의 양이 합성 수율 및 순도 펩티드의 차이에 따라 변화 이후 반 정량적이다. 차례로 이것은 pept에 따라 달라집니다등 또한 위음성 또는 위양성 결과에 가끔 발생할 수 수율과 순도의 변화 IDE 순서, 길이,. 동일한 어레이 내의 강도를 비교 한 반 정량적 랭킹 결과 할 수있다. 같은 배열에 다른 배열이나 다른 실험 사이 그러나 이러한 비교는 신뢰할 수 없습니다. 결합을 정량화하기 위해, 펩티드 어레이 검사에서 발견 된 펩타이드 등과 같은 분석은 형광 이방성, 등온 적정 열량 측정법 (ITC), 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 등의 생물 물리학 적 방법을 이용하여 표적 단백질을 결합에 대해 합성 및 시험되어야한다 그들은 이러한 바인딩을 검출하는 단백질의 높은 농도를 필요로 보낸 바인딩 약한 항상 민감하지. 펩타이드 어레이 스크리닝, 반면에, 약한 결합에 매우 민감하다. 따라서, 어레이 검사에서 관찰 상호 작용의 일부는 형광 anisot 등의 방법을 사용하여 관찰되거나 정량화 될 수 없었다 14 끈적 끈적. 펩타이드 어레이 스크리닝 분석의 높은 감도와 결합 단백질의 매우 낮은 농도가 필요하다는 사실은 펩타이드 어레이 친화 광범위 단백질 상호 작용 펩티드를 스크리닝하는 방법에 유용하게 만든다.
위음성은 선형 펩티드가 적절히 단백질의 결합 부위의 3 차원 구조를 표현하지 않을 수도 있다는 사실에 기인 할 수있다. 그러나 이것은 잘 펩티드로 표시된다 본질적 무질서 단백질로 문제가되지 않는다. 가양 성 결과는 배열 된 항체의 결합에 의해 야기 될 수있다. 이러한 프로토콜 섹션 4.3에 기재된 바와 같이 대조 실험을 수행함으로써 검출 될 수있다. 항체에 의해 인식되는 단백질 에피토프 펩티드 배열에 결합시 미노 될 경우 위음성 결과를 얻을 수있다. 이 문제는 일반적인 것은 아니지만 단백질에 대하여 폴리 클로 날 항체를 사용하여 해결 될 수있다.
jove_content "> 펩타이드 어레이 스크리닝은 또한, 리드 펩티드를 향상 알라닌 스캔 및 SAR 7 연구 포함 위해 사용될 수있다. 타겟의 결합 위치가 알려지면, 그 시퀀스에 기초하여 어레이가 각각의 여분 포함하는 다수의 변형으로 디자인 될 수있다 알라닌 (알라 스캔)에 잔류 상호 작용을 위해 중요한 잔기를 확인한다. 유사한 방식으로, SAR 연구가 결합 펩티드의 상이한 속성을 변경함으로써 수행 될 수있다. 이러한 펩티드의 길이를 변화 대응 D에 의해 잔류 물을 교체 포함 아미노 산과 같은 비 천연 아미노산에 의해 메틸화, 글리코 실화 및 교체와 같은 다른 변형. 이러한 변형 된 펩티드, 모두 하나의 표적 서열에 기초하여, 하나의 어레이에서 합성 될 수 있으며, 하나를 빠르고 손쉽게 실험에서 표적 단백질 결합에 대해 스크리닝 잠재적 인 억제제를 개선하고 상호 작용의 분자 메커니즘을 이해하기위한 풍부한 정보를 제공한다.(4)와 같은 다른 항체에 사용될 수있다. 본원에 기재된 펩티드 배열은 단일 용도로 재사용 될 수 없다.
여기에 제시된 프로토콜은 펩타이드 어레이의 넓은 유용성을 보여준다. 정확하게 설계된 배열하여, 2 단백질 사이의 결합 부위를 상세히 확인할 수있다. 결합 부위가 잘 특징으로 일단은 관련 단백질 - 단백질 상호 작용을 억제하기위한 약물의 표적 부위로서 사용될 수있다. 어레이 검사에서 발견되는 펩타이드 결합에 기초하여, 억제 소분자 도모 할 수 있고, 약물 스크리닝으로서 리드.
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Acknowledgments
AF는 유럽 공동체의 일곱 번째 프레임 워크 프로그램에서 유럽 연구위원회에서 시작 기금에 의해 지원되었다 (FP7 / 2007-2013) / ERC 부여 계약 N 203413을 ° 복잡한 systems.HA 바이오 하이브리드 및 AI에 대한 미네르바 센터가 지원됩니다 예루살렘의 히브리 대학에서 고급 학위 학생을위한 달리아 댄 Maydan 원정대에 의해.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peptide array | INTAVIS Bioanalytical Instruments | ||
| His-probe Antibody (H-3) HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-8036 HRP | |
| EZ-ECL Kit | Biological industries | 20-500-120 | |
| Skim Milk | Becton, Dickinson and Company | 232100 | |
| LAS-3000 camera | FUJI film |
References
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