Abstract
प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत जीव की जीवित कोशिका और नियंत्रण homeostasis में प्रक्रियाओं का सबसे मध्यस्थता. बिगड़ा प्रोटीन बातचीत प्रोटीन बातचीत महत्वपूर्ण दवा लक्ष्य बना रही है, बीमारी हो सकती है. यह आणविक स्तर पर इन संबंधों को समझने के लिए इस प्रकार अत्यधिक महत्वपूर्ण है. प्रोटीन बातचीत सेलुलर और जैव रासायनिक assays से मात्रात्मक biophysical assays के लिए लेकर विभिन्न तकनीकों का उपयोग कर अध्ययन कर रहे हैं, और इन प्रोटीन डोमेन के साथ या पेप्टाइड्स के साथ, पूर्ण लंबाई प्रोटीन के साथ या तो किया जा सकता है. पेप्टाइड्स पेप्टाइड्स आसानी से संश्लेषित किया जा सकता है, क्योंकि प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने और विशिष्ट बातचीत साइटों पर ध्यान केंद्रित अनुमति देने के लिए के रूप में उत्कृष्ट उपकरण सेवा करते हैं. पेप्टाइड सरणियों चिकित्सीय उद्देश्यों के लिए लक्ष्य प्रोटीन कि बाँध पेप्टाइड्स के लिए दो प्रोटीन के बीच बातचीत साइटों की पहचान करने के साथ ही स्क्रीनिंग कर सकें. उन्होंने यह भी उच्च throughput एसएआर पढ़ाई अनुमति देते हैं. बाध्यकारी साइटों, एक typi की पहचान के लिएकाल पेप्टाइड सरणी आमतौर पर आंशिक रूप से वांछित लक्ष्य प्रोटीन के एक या एक से अधिक पार्टनर प्रोटीन से भरा दृश्यों से व्युत्पन्न 10-20 अवशेषों पेप्टाइड्स ओवरलैपिंग होता. लक्ष्य प्रोटीन बाध्यकारी के लिए सरणी स्क्रीनिंग प्रोटीन की ही छोटी राशि का उपयोग कर एक आसान और तेजी से विधि में साथी प्रोटीन में बाध्यकारी साइटों, के लिए इसी बाध्यकारी पेप्टाइड का पता चलता है.
इस लेख में हम एक लक्ष्य प्रोटीन और उसके सहयोगियों के बीच बातचीत साइटों मानचित्रण के लिए पेप्टाइड सरणियों स्क्रीनिंग के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. पेप्टाइड सरणी खाते में उनके माध्यमिक संरचनाओं लेने के साथी प्रोटीन के दृश्यों पर आधारित बनाया गया है. इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया सरणियों INTAVIS Bioanalytical साधनों द्वारा तैयार Celluspots सरणियों थे. सरणी बंधन unspecific और फिर अध्ययन प्रोटीन के साथ incubated को रोकने के लिए बंद है. एक एंटीबॉडी का उपयोग कर जांच प्रोटीन के बीच विशिष्ट बातचीत साइटों के लिए इसी बाध्यकारी पेप्टाइड का पता चलता है.
Introduction
प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत जीवित कोशिका में प्रक्रियाओं का सबसे मध्यस्थता. बिगड़ा प्रोटीन बातचीत प्रोटीन बातचीत महत्वपूर्ण दवा लक्ष्य बना रही है, बीमारी हो सकती है. यह आणविक स्तर पर इन संबंधों को समझने के लिए इस प्रकार अत्यधिक महत्वपूर्ण है. प्रोटीन बातचीत सेलुलर और जैव रासायनिक assays से मात्रात्मक biophysical assays के लिए लेकर विभिन्न तकनीकों का उपयोग कर अध्ययन कर रहे हैं, और इन प्रोटीन डोमेन के साथ या पेप्टाइड्स के साथ, पूर्ण लंबाई प्रोटीन के साथ या तो किया जा सकता है. पेप्टाइड्स प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के रूप में उत्कृष्ट उपकरण सेवा करते हैं. पेप्टाइड्स आसानी से संश्लेषित और एक तरफ और दूसरी ओर 1,2 पर एक उच्च throughput ढंग से कई प्रोटीन ठिकानों पर एक विशिष्ट बातचीत साइट पर ध्यान केंद्रित की अनुमति किया जा सकता है क्योंकि यह है. पेप्टाइड सरणी स्क्रीनिंग है एक तेजी से, एक कम समय 3 में कई सहयोगियों के साथ एक लक्ष्य प्रोटीन की बातचीत के बारे में डेटा की एक बड़ी राशि प्राप्त करने के लिए विधि को करने के लिए आसान. प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का पता लगाने और विश्लेषण करने के लिए अन्य जैव रासायनिक या biophysical विधियों के विपरीत, पेप्टाइड सरणी स्क्रीनिंग प्रोटीन की एक बहुत कम एकाग्रता की आवश्यकता है और बंधन बहुत कमजोर पता लगा सकते हैं. पेप्टाइड सरणियों एंजाइम गतिविधियों 6 और उच्च throughput का अध्ययन, ऐसे प्रोटीन-प्रोटीन या रिसेप्टर ligand बातचीत साइटों 4, homo- या असमलैंगिक oligomerization इंटरफेस का मानचित्रण के रूप में पेप्टाइड प्रोटीन बातचीत में कई अनुप्रयोगों के लिए निस्र्पक एंटीबॉडी 5 epitopes इस्तेमाल किया जा सकता संरचना गतिविधि संबंध (एसएआर) 7 अध्ययन करता है. पेप्टाइड सरणी स्क्रीनिंग के बारे में गहराई से समीक्षा के लिए Katz एट अल देखें. 4
पेप्टाइड सरणियों के कई प्रकार वर्तमान में मौजूद हैं. पेप्टाइड्स के संश्लेषण के लिए मुख्य रूप से स्पॉट तकनीक 4,8 का उपयोग, सीधे ठोस समर्थन पर पेप्टाइड्स के ठोस समर्थन, या संश्लेषण के लिए उन्हें संलग्न करने से पहले: पेप्टाइड सरणियों बनाने के लिए दो प्रमुख सिंथेटिक रणनीतियों रहे हैं.पेप्टाइड्स 9 fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) रसायन शास्त्र 8 से आमतौर पर ठोस समर्थन पर संश्लेषित कर रहे हैं. आम सिंथेटिक योजनाओं के अलावा सी टर्मिनस के माध्यम से पेप्टाइड एन टर्मिनस के माध्यम से लगाव (जैसे, जेपीटी pepstar सरणियों 9) और पेप्टाइड लगाव हैं (उदाहरण के लिए, PEPSCAN pepchip सरणियों 10, जेपीटी pepspot सरणियों 9 और INTAVIS celluspot सरणियों 11) 4. ठोस समर्थन भिन्न है और इसलिए इसे करने के लिए पेप्टाइड युग्मन के रसायन शास्त्र करता है सकते हैं. CYS समाप्त पेप्टाइड्स thiol समूह 12 के माध्यम से गिलास स्लाइड से जुड़ा जा सकता है. एक पेप्टाइड के एन टर्मिनस covalently अमीनो एसिड की एस्टरीफिकेशन के माध्यम से सेलूलोज़ झिल्ली पर एक हाइड्रॉक्सिल समूह के लिए बाध्य किया जा सकता है 8 जुड़ी.
यहाँ हम प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के अध्ययन के लिए एक विधि के रूप में पेप्टाइड सरणियों स्क्रीनिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. हम इस्तेमाल सरणी बड़े एमो युक्त एक माइक्रो सरणी है जो Celluspots सरणी, हैएक गिलास स्लाइड द्वारा समर्थित एक छोटे सेलूलोज़ झिल्ली पर धब्बे (अप करने के लिए 384 स्थानों में से डुप्लिकेट) की UNT. यह कम प्रोटीन की मात्रा और एंटीबॉडी के साथ काम कर और ही प्रयोग प्रति डेटा की महत्वपूर्ण राशि प्राप्त करने के लिए सक्षम बनाता है. इस सरणी भी बाध्यकारी कम आत्मीयता का पता लगाने की अनुमति देता है कि उच्च पेप्टाइड घनत्व होता है. सरणी सामान्य सेल प्रसार 13 को नियंत्रित करने के लिए अत्यधिक महत्वपूर्ण है जो STIL-CHFR बातचीत, मानचित्रण के लिए इस्तेमाल किया गया था. दो प्रोटीन के बीच अनियंत्रित बातचीत कैंसर के विकास के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इस बातचीत मानचित्रण द्वारा हम विशिष्ट बाध्यकारी साइट और अवशेषों 14 बाध्यकारी पाया. यह इस प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत को बाधित कि तर्कसंगत अवरोधकों को डिजाइन करने के लिए मार्ग प्रशस्त.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. एक पेप्टाइड ऐरे डिजाइनिंग
- आंशिक रूप से 10-20 अवशेषों पेप्टाइड्स ओवरलैपिंग में लक्ष्य प्रोटीन के अनुक्रम फूट डालो. विशिष्ट प्रयोग पर ओवरलैप की राशि और प्रदर्शन प्रयोगशाला के संसाधनों, लेकिन सिद्धांत रूप में लंबे समय तक ओवरलैप बेहतर बदलती हैं. पेप्टाइड्स बातचीत के लिए जिम्मेदार हो सकता है कि प्रोटीन में खाते में जाना जाता माध्यमिक संरचना तत्वों में ले डिजाइनिंग.
- वाणिज्यिक विक्रेताओं के माध्यम से बनाया गया पेप्टाइड सरणी आदेश. इधर, उपयोग पेप्टाइड्स covalently सी टर्मिनस के माध्यम से सरणी के लिए बाध्य.
बाध्यकारी 2. अवरुद्ध गैर-विशिष्ट
- 0.05% के बीच 20 (TBST / PBST) युक्त एक 50 मिमी Tris या फॉस्फेट बफर समाधान करें और (सटीक ईओण ताकत पता करने के क्रम में) एचसीएल या NaOH के एक मापा राशि और सोडियम क्लोराइड के साथ वांछित ईओण ताकत के साथ वांछित पीएच को समायोजित . इधर, 7.5 का एक पीएच और 150 मिमी की एक आयनिक शक्ति का उपयोग करें.
- की एक अवरुद्ध समाधान करें2.5% (w / वी) TBST / PBST में स्किम्ड दूध पाउडर.
- गैर विशिष्ट बंधनकारी रोकने के लिए, अवरुद्ध समाधान के 5 मिलीलीटर में सरणी विसर्जित कर दिया. 2-4 कमरे के तापमान पर घंटा या रात भर एक प्रकार के बरतन पर 4 डिग्री सेल्सियस पर लिए सरणी सेते हैं.
3. प्रोटीन के साथ incubating
- कमरे के तापमान पर एक प्रकार के बरतन पर 5 मिनट के लिए 5 एमएल TBST / PBST के साथ दो बार तो 30 सेकंड के लिए अवरुद्ध समाधान और 5 मिलीलीटर के साथ पहली सरणी धो लें.
- (V / डब्ल्यू) गैर विशिष्ट बंधनकारी को रोकने के लिए स्किम्ड दूध पाउडर में 2.5% से युक्त उनकी टैग प्रोटीन समाधान के 5 मिलीलीटर से धोया सरणी सेते हैं. इधर, वर्णित अवरुद्ध समाधान में भंग प्रोटीन समाधान के 4.5 माइक्रोन (STIL 500-650) का उपयोग करें.
नोट: आमतौर पर 5-10 माइक्रोन प्रोटीन स्क्रीनिंग के लिए उपयोग किया जाता है, लेकिन प्रोटीन एकाग्रता बंधन आत्मीयता और के स्थानीय सरणी पर बाध्य कि पेप्टाइड्स की सांद्रता (दक्षता पर निर्भर करता है, के रूप में भी कम 2-3 के रूप में माइक्रोन हो सकता है संश्लेषण). बफर जो प्रोटीन मेंअलग-अलग हो सकते हैं भंग लेकिन ऊपर वर्णित एक ही अवरुद्ध समाधान का उपयोग प्रोटीन को कमजोर करने के लिए आम है. - कमरे के तापमान पर या रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर 3-8 घंटे के लिए प्रोटीन समाधान में सरणी सेते हैं.
4. एंटीबॉडी के साथ incubating
- 5 एमएल TBST / PBST के साथ सरणी तीन बार धोएं. पहले धो कमरे के तापमान पर एक प्रकार के बरतन पर दो 5 मिनट washes के द्वारा पीछा 30 सेकंड के लिए है.
- कमरे के तापमान पर एक प्रकार के बरतन पर 1 घंटे के लिए, अवरुद्ध समाधान के रूप में ही सांद्रता में एक ही सामग्री शामिल है कि एक ऊष्मायन बफर में: पतला एचआरपी संयुग्मित एंटीबॉडी के 5 मिलीलीटर (1500) 1 से धोया सरणी सेते हैं. एंटीबॉडी लक्ष्य प्रोटीन या टैग या तो बाध्य कर सकते हैं.
- काएं बिना ही प्रोटोकॉल दोहरा द्वारा सरणी लक्ष्य प्रोटीन (जैसे, oligomerization के लिए अध्ययन) से पेप्टाइड्स शामिल है, खासकर यदि सरणी पर पेप्टाइड्स के साथ एंटीबॉडी की बातचीत का परीक्षण नियंत्रण प्रयोगों प्रदर्शनपी 3, प्रोटीन के साथ incubating.
- 5 एमएल TBST / PBST के साथ सरणी तीन बार धोएं. पहले धो कमरे के तापमान पर एक प्रकार के बरतन पर दो 5 मिनट washes के द्वारा पीछा 30 सेकंड के लिए है.
5. ऐरे पढ़ना
- एक ईसीएल पश्चिमी सोख्ता सब्सट्रेट किट के साथ chemiluminescence विकास के लिए बाहर ले.
- एक luminescent छवि विश्लेषक के साथ की खोज करने के.
- परिणामों का विश्लेषण करें. सरणी पर दोनों डुप्लिकेट ही संकेत दिखा, तो परिणाम विश्वसनीय हैं कि सुनिश्चित करें. प्रोटीन साथी की संरचना में जाना जाता है, तो बंधन पेप्टाइड्स के लिए संरचना पर खोज और बाध्यकारी साइटों के लिए लग रही है. इस क्रम में अब तक कर रहे हैं कि यहां तक कि पेप्टाइड्स तृतीयक संरचना में एक साथ करीब हो सकता है और एक बाध्यकारी साइट बना सकते हैं.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
STIL एक अत्यधिक महत्वपूर्ण centrosomal प्रोटीन है. 19 - यह सामान्य कोशिका विभाजन और सेल प्रसार 13,15 नियंत्रित करता है. STIL कई प्रोटीन 18,20,21 के साथ सूचना का आदान प्रदान, और बातचीत के अधिकांश एक आंतरिक रूप से अव्यवस्थित क्षेत्र (आईडीआर) 14 है जो इसके मध्य भाग, के माध्यम से हो. हम stil बाध्यकारी प्रोटीन CHFR से व्युत्पन्न पेप्टाइड्स से बना एक सरणी बनाया है. CHFR तनाव 22 mitotic के जवाब में प्रेरित किया जाता है कि एक ट्यूमर शमन है. CHFR की STIL बाध्यकारी डोमेन की संरचना समय में अज्ञात था प्रोटोकॉल में कदम 1.1 में वर्णित के रूप में, हम, 7 अवशेषों की ओवरलैप के साथ 15 अवशेषों लंबे पेप्टाइड्स के लिए प्रोटीन डोमेन विभाजित. ऊपर प्रोटोकॉल में विस्तृत और चित्रा 1 में सचित्र के रूप में हम CHFR-STIL बाध्यकारी साइटों की पहचान के लिए स्क्रीनिंग एक पेप्टाइड सरणी प्रदर्शन किया. हम एक प्रदान कर सकते हैं जो डुप्लिकेट में 384 पेप्टाइड्स से बना एक INTAVIS Celluspot सरणी, प्रयोग जानकारी के विशाल राशि चित्रा 2 में प्रदर्शन के रूप में. हम इसकी बाइंडिंग प्रोटीन CHFR (चित्रा 3) में STIL के लिए बाध्यकारी साइटों पाया इस पेप्टाइड सरणी का उपयोग करना. सरणी में प्रत्येक काला टीका STIL बाध्य है कि एक CHFR व्युत्पन्न पेप्टाइड का प्रतिनिधित्व करता है. यह परिणामों की विश्वसनीयता की पुष्टि करता है जो नकली, में मौजूद है, क्योंकि प्रत्येक पेप्टाइड दो बार प्रकट होता है कि ध्यान दें. STIL और CHFR के बीच बातचीत पहले से प्रोटीन स्तर 13,14 पर प्रदर्शन किया गया. पेप्टाइड सरणी स्क्रीनिंग STIL आईडीआर के लिए बाध्य है कि 7 CHFR व्युत्पन्न पेप्टाइड्स पता चला, 500-650 अवशेषों (चित्रा 3, Amartely एट अल. 14). इन परिणामों से हमें CHFR पर STIL की बाध्यकारी साइट मैप करने के लिए अनुमति दी. CHFR प्राथमिक अनुक्रम पर इन 7 पेप्टाइड्स की दूरी के बावजूद वे (चित्रा 4) 14 CHFR में STIL के लिए एक अच्छी तरह से परिभाषित बाध्यकारी साइट बनाएँ.
7 / 52097fig1highres.jpg "/>
चित्रा 1: पेप्टाइड सरणी स्क्रीनिंग की योजना अ-, एक या एक से अधिक पार्टनर प्रोटीन से व्युत्पन्न आंशिक रूप से अतिव्यापी पेप्टाइड्स के होते हैं कि एक पेप्टाइड सरणी डिजाइनिंग खाते उनके माध्यमिक संरचनाओं में ले;. लक्ष्य प्रोटीन के साथ incubating बी; पता लगाने के लिए एक एंटीबॉडी के साथ incubating सी; डी जांच (chemiluminescence, प्रतिदीप्ति, आदि के द्वारा किया जा सकता है); ई परिणामों का विश्लेषण साइटों बाध्यकारी प्रोटीन प्रकट करने के लिए. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 2:. पेप्टाइड सरणी स्क्रीनिंग जांच का एक उदाहरण chemiluminescence का प्रयोग कर प्राप्त स्लाइड डुप्लिकेट के रूप में दो समान सरणियों में शामिल है..तों / ftp_upload / 52097 / 52097fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 3: CHFR प्रोटीन को STIL आईडीआर के बंधन के लिए एक पेप्टाइड सरणी स्क्रीनिंग: 4.5 माइक्रोन उनकी टैग STIL 500-650 सरणी बंधन के लिए जांच की गई थी. प्रत्येक काला टीका STIL टुकड़ा और CHFR व्युत्पन्न पेप्टाइड 14 के बीच बंधन को इंगित करता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 4: CHFR Cys अमीर डोमेन की संरचना पर दिखाया CHFR में STIL बाध्यकारी साइट (अवशेषों 424-661, PDB आईडी: 2XPO) सात.पेप्टाइड सरणी स्क्रीनिंग में STIL बाध्य कि पेप्टाइड्स प्राथमिक अनुक्रम में दूर हैं लेकिन एक बाध्यकारी साइट बनाने के लिए 3 डी संरचना में एक साथ बंद जो गुलाबी, नारंगी और लाल रंग के तीन क्षेत्रों को विभाजित किया जा सकता है. इस पूरे क्षेत्र डिमर CHFR 14 में STIL के लिए एक बाध्यकारी जेब रूपों. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
पेप्टाइड सरणी स्क्रीनिंग उसके सहयोगियों में एक लक्ष्य प्रोटीन की बाध्यकारी साइटों की पहचान करने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण है. इस परख प्रदर्शन करने के लिए तेजी से और आसान है और परिणाम एक या दो कार्य दिवसों में प्राप्त किया जा सकता है. पेप्टाइड सरणी स्क्रीनिंग बहुमुखी है और कई उद्देश्यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह ऐसी फास्फारिलीकरण के रूप में पद अनुवाद संशोधनों निस्र्पक और kinases की substrates के पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए: माइलॉयड ल्यूकेमिया तीव्र से संबंधित है जो FLT3 काइनेज, एक पेप्टाइड सरणी 6 स्क्रीनिंग द्वारा पाया Tyr युक्त सब्सट्रेट पेप्टाइड्स phosphorylates. tyrosine kinase अवरोधकों pazopanib और lapatinib की निरोधात्मक गुणों 23 स्क्रीनिंग पेप्टाइड सरणी का उपयोग कर परीक्षण किया गया था. पेप्टाइड्स सरणी प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत में मध्यस्थता करने वाली साइटों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस पद्धति का उपयोग हमारी प्रयोगशाला में अध्ययन इस तरह के प्रोटीन के उदाहरण हैं: एचआईवी -1 VIF प्रोटीन और सेलुलर A3G प्रोटीन के बीच बातचीत हमें विशेषता थीएक पेप्टाइड सरणी 24 आईएनजी; पेप्टाइड सरणी स्क्रीनिंग समर्थक apoptotic ASPP2 प्रोटीन 25 के साथ विरोधी apoptotic बीसीएल -2 परिवार के संबंधों का अध्ययन करने के लिए और mitochondrial प्रोटीन MTCH2 26 के साथ, tBID, बीसीएल -2 परिवार के एक सदस्य के बंधन अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था; मायोसिन सेंटर डोमेन के बीच अंतर-आणविक बातचीत 27 स्क्रीनिंग पेप्टाइड सरणी का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था. यहाँ हम हम stil-CHFR बातचीत, प्रसार और कैंसर 14 में महत्वपूर्ण एक प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत में मध्यस्थता करने वाली साइटों की पहचान के लिए स्क्रीनिंग पेप्टाइड सरणी प्रयोग किया जाता का एक उदाहरण प्रस्तुत करते हैं. सटीक बाध्यकारी साइट खुलासा अध्ययन बातचीत के अवरोधकों के तर्कसंगत डिजाइन के लिए आधार के रूप में सेवा कर सकते हैं.
पेप्टाइड सरणी स्क्रीनिंग एक मात्रात्मक परख नहीं है. सरणी पर प्रत्येक स्थान में पेप्टाइड की राशि संश्लेषण उपज और पेप्टाइड शुद्धता में अंतर की वजह से भिन्न होता है के बाद से यह अर्द्ध मात्रात्मक है. बदले में यह pept पर निर्भर करता हैआदि भी झूठी नकारात्मक या झूठी सकारात्मक परिणाम के लिए कभी कभी नेतृत्व कर सकते हैं उपज और पवित्रता में भिन्नता आईडीई अनुक्रम, लंबाई,. एक ही सरणी के भीतर तीव्रता के बीच तुलना अर्द्ध मात्रात्मक रैंकिंग में जिसके परिणामस्वरूप बनाया जा सकता है. एक ही सरणी के साथ विभिन्न सरणियों या विभिन्न प्रयोगों के बीच हालांकि इस तरह की तुलना में विश्वसनीय नहीं है. बंधन यों, पेप्टाइड सरणी स्क्रीनिंग में पाया पेप्टाइड आदि ऐसे assays हैं प्रतिदीप्ति anisotropy, इज़ोटेर्माल अनुमापन उष्मामिति (आईटीसी), सतह plasmon अनुनाद (एसपीआर), के रूप में biophysical तरीकों का उपयोग कर लक्ष्य प्रोटीन बाध्यकारी के लिए संश्लेषित और परीक्षण किया जाना चाहिए वे इस तरह के बंधन पता लगाने के लिए प्रोटीन की एक उच्च एकाग्रता की आवश्यकता होती है, क्योंकि बंधन कमजोर करने के लिए हमेशा संवेदनशील नहीं. पेप्टाइड सरणी स्क्रीनिंग, दूसरी ओर, कमजोर बंधन को बहुत ही संवेदनशील है. इस प्रकार, सरणी स्क्रीनिंग में मनाया बातचीत के कुछ ऐसे प्रतिदीप्ति anisot रूप तरीकों का उपयोग कर मनाया या मात्रा निर्धारित नहीं किया जा सका 14 रस्से. पेप्टाइड सरणी स्क्रीनिंग परख की उच्च संवेदनशीलता के साथ संयुक्त प्रोटीन की बहुत कम मात्रा की आवश्यकता है कि इस तथ्य पेप्टाइड सरणी समानताएं की एक विस्तृत रेंज में प्रोटीन पेप्टाइड बातचीत स्क्रीनिंग के लिए एक उपयोगी विधि बनाने.
झूठी नकारात्मक परिणाम भी रैखिक पेप्टाइड्स ठीक से प्रोटीन में बाध्यकारी साइट की 3 डी संरचना का प्रतिनिधित्व नहीं हो सकता है कि इस तथ्य के कारण हो सकता है. हालांकि यह अच्छी तरह से पेप्टाइड्स द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे हैं जो आंतरिक रूप से अव्यवस्थित प्रोटीन, के साथ एक समस्या नहीं है. झूठी सकारात्मक परिणाम भी सरणी के लिए एंटीबॉडी के बंधन के कारण हो सकता है. ये प्रोटोकॉल खंड 4.3 में वर्णित के रूप में एक नियंत्रण प्रयोग के माध्यम से पता लगाया जा सकता है. एंटीबॉडी द्वारा मान्यता प्राप्त है कि प्रोटीन मिलान पेप्टाइड सरणी के लिए बाध्य पर unexposed बन अगर झूठी नकारात्मक परिणाम भी प्राप्त किया जा सकता है. यह समस्या आम नहीं है लेकिन प्रोटीन के खिलाफ एक पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग करके हल किया जा सकता है.
jove_content "> पेप्टाइड सरणी स्क्रीनिंग भी, सीसा पेप्टाइड्स सुधार Alanine स्कैन और खोज एवं बचाव 7 अध्ययन सहित के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. लक्ष्य का बाध्यकारी साइट में जाना जाता है एक बार, अपने क्रम पर आधारित एक सरणी प्रत्येक के प्रतिस्थापन सहित कई संशोधनों के साथ तैयार किया जा सकता है Alanine (अला स्कैन) करने के अवशेषों बातचीत के लिए महत्वपूर्ण अवशेषों की पहचान करने के लिए. एक समान तरीके में, खोज एवं बचाव पढ़ाई बंधन पेप्टाइड्स के विभिन्न गुणों को बदल कर किया जा सकता है. ये पेप्टाइड की लंबाई बदलती इसी डी द्वारा अवशेषों की जगह शामिल -amino एसिड और इस तरह के गैर प्राकृतिक एमिनो एसिड से मेथिलिकरण, ग्लाइकोसिलेशन और स्थानापन्न के रूप में अन्य संशोधनों. इस तरह संशोधित पेप्टाइड्स, सब एक लक्ष्य अनुक्रम के आधार पर, एक सरणी पर संश्लेषित किया जा सकता है और एक तेज और आसान प्रयोग में लक्ष्य प्रोटीन बाध्यकारी के लिए जांच एक संभावित अवरोध सुधार और बातचीत के आणविक तंत्र को समझने के लिए जानकारी का खजाना प्रदान करते हैं.4 अलग एंटीबॉडी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस के साथ साथ वर्णित पेप्टाइड सरणी केवल एकल उपयोग के लिए है और पुन: उपयोग नहीं किया जा सकता.
यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल पेप्टाइड सरणियों की व्यापक उपयोगिता को दर्शाता है. एक सही ढंग से तैयार सरणी का उपयोग करना, दो प्रोटीन के बीच बाध्यकारी साइटों विस्तार से पहचाना जा सकता है. बाध्यकारी साइट अच्छी तरह से विशेषता है एक बार यह प्रासंगिक प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत में बाधा के लिए एक दवा लक्ष्य साइट के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. सरणी स्क्रीनिंग में पाया बंधन पेप्टाइड्स के आधार पर निरोधात्मक छोटे अणुओं बनाया जा सकता है और दवा सुराग के रूप में जांच की.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
वायुसेना यूरोपीय समुदाय के सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम के तहत यूरोपीय अनुसंधान परिषद से एक प्रारंभिक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था (FP7 / 2007-2013) / ईआरसी अनुदान समझौता एन 203413 ° और जटिल systems.HA जैव संकर और एअर इंडिया के लिए मिनर्वा केंद्र से समर्थन कर रहे हैं जेरूसलम के हिब्रू विश्वविद्यालय में उन्नत डिग्री छात्रों के लिए डालिया और दान Maydan फैलोशिप द्वारा.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peptide array | INTAVIS Bioanalytical Instruments | ||
| His-probe Antibody (H-3) HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-8036 HRP | |
| EZ-ECL Kit | Biological industries | 20-500-120 | |
| Skim Milk | Becton, Dickinson and Company | 232100 | |
| LAS-3000 camera | FUJI film |
References
- Benyamini, H., Friedler, A. Using peptides to study protein–protein interactions. Future Medicinal Chemistry. 2 (6), 989-1003 (2010).
- Geysen, H. M., Wagner, C. D. Isotope or mass encoding of combinatorial libraries. Chemistry & Biology. 3 (8), 679-688 (1996).
- Frank, R. Spot-synthesis: an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support. Tetrahedron. 48 (42), 9217-9232 (1992).
- Katz, C., Levy-Beladev, L., Rotem-Bamberger, S., Rito, T., Rudiger, S. G., Friedler, A. Studying protein-protein interactions using peptide arrays. Chem Soc Rev. 40 (5), 2131-2145 (2011).
- Hansen, L. B., Buus, S., Schafer-Nielsen, C. Identification and Mapping of Linear Antibody Epitopes in Human Serum Albumin Using High-Density Peptide Arrays. PLoS ONE. 8 (7), (2013).
- Uecker, A. A substrate peptide for the FLT3 receptor tyrosine kinase. British Journal of Haematology. 144 (1), 127-130 (2009).
- Gabizon, R., Faust, O., Benyamini, H., Nir, S., Loyter, A., Friedler, A. Structure-activity relationship studies using peptide arrays: the example of HIV-1 Rev-integrase interaction. Med. Chem. Commun. 4 (1), 252-259 (2013).
- Frank, R. The SPOT-synthesis technique: Synthetic peptide arrays on membrane supports—principles and applications. Journal of Immunological Methods. 267 (1), 13-26 (2002).
- Innovative Peptide Solutions. , http://www.jpt.com (2014).
- PEPSCAN shaping peptides to perfection. , http://www.pepscan.com (2014).
- Intavis Bioanalytical Instruments. , http://www.intavis.com (2014).
- Falsey, J. R., Renil, M., Park, S., Li, S., Lam, K. S. Peptide and Small Molecule Microarray for High Throughput Cell Adhesion and Functional Assays. Bioconjugate Chemistry. 12 (3), 346-353 (2001).
- Castiel, A., Danieli, M. M. The Stil protein regulates centrosome integrity and mitosis through suppression of Chfr. Journal of Cell Science. 124 (4), 532-539 (2011).
- Amartely, H., David, A., Lebendiker, M., Benyamini, H., Izraeli, S., Friedler, A. The STIL protein contains intrinsically disordered regions that mediate its protein-protein interactions. Chemical Communications. 50, Cambridge, England. 5245-5247 (2013).
- Izraeli, S., Lowe, L. A. The SIL gene is required for mouse embryonic axial development and left-right specification. Nature. 399 (6737), 691-694 (1999).
- Izraeli, S., Colaizzo-Anas, T., Bertness, V. L., Mani, K., Aplan, P. D., Kirsch, I. R. Expression of the SIL gene is correlated with growth induction and cellular proliferation. Cell Growth Differ. 8 (11), 1171-1179 (1997).
- Arquint, C., Sonnen, K. F., Stierhof, Y. -D., Nigg, E. a Cell-cycle-regulated expression of STIL controls centriole number in human cells. Journal of Cell Science. 125 (5), 1342-1352 (2012).
- Tang, C. J., Lin, S. Y. The human microcephaly protein STIL interacts with CPAP and is required for procentriole formation. Embo J. 30 (23), 4790-4804 (2011).
- Vulprecht, J., David, A. STIL is required for centriole duplication in human cells. Journal of Cell Science. 125 (5), 1353-1362 (2012).
- Campaner, S., Kaldis, P., Izraeli, S., Kirsch, I. R. Sil phosphorylation in a Pin1 binding domain affects the duration of the spindle checkpoint. Mol Cell Biol. 25 (15), 6660-6672 (2005).
- Kasai, K., Inaguma, S., Yoneyama, A., Yoshikawa, K., Ikeda, H. SCL/TAL1 interrupting locus derepresses GLI1 from the negative control of suppressor-of-fused in pancreatic cancer cell. Cancer Res. 68 (19), 7723-7729 (2008).
- Chaturvedi, P., Sudakin, V. Chfr regulates a mitotic stress pathway through its RING-finger domain with ubiquitin ligase activity. Cancer Res. 62 (6), 1797-1801 (2002).
- Olaussen, K. a, Commo, F. Synergistic proapoptotic effects of the two tyrosine kinase inhibitors pazopanib and lapatinib on multiple carcinoma cell lines. Oncogene. 28 (48), 4249-4260 (2009).
- Reingewertz, T. H., Britan-Rosich, E. Mapping the Vif–A3G interaction using peptide arrays: A basis for anti-HIV lead peptides. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 21 (12), 3523-3532 (2013).
- Katz, C., Benyamini, H. Molecular basis of the interaction between the antiapoptotic Bcl-2 family proteins and the proapoptotic protein ASPP2. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (34), 12277-12282 (2008).
- Katz, C., Zaltsman-Amir, Y., Mostizky, Y., Kollet, N., Gross, A., Friedler, A. Molecular Basis of the Interaction between Proapoptotic Truncated BID (tBID) Protein and Mitochondrial Carrier Homologue 2 (MTCH2) Protein: KEY PLAYERS IN MITOCHONDRIAL DEATH PATHWAY. Journal of Biological Chemistry. 287 (18), 15016-15023 (2012).
- Rosenberg, M. M., Ronen, D., Lahav, N., Nazirov, E., Ravid, S., Friedler, A. High resolution characterization of myosin IIC tailpiece and its effect on filament assembly. Journal of Biological Chemistry. 288 (14), 9779-9789 (2013).
