Abstract
Interacções proteína-proteína mediar a maior parte dos processos na célula viva e o controlo da homeostase do organismo. Interacções proteína Deficiência pode resultar em doença, as interacções proteicas importantes alvos de drogas. Assim, é muito importante para compreender essas interações a nível molecular. Interacções entre proteínas são estudados usando uma variedade de técnicas que vão desde os ensaios celulares e bioquímicos para ensaios quantitativos biofísicas, e estas podem ser realizadas tanto com as proteínas de comprimento completo, com domínios de proteína ou com péptidos. Os péptidos servir como excelentes ferramentas para estudar as interacções proteína desde os péptidos podem ser facilmente sintetizadas e permitem que o foco em locais específicos de interacção. Peptídeo matrizes permitem a identificação dos sítios de interacção entre duas proteínas, bem como a despistagem de péptidos que se ligam a proteínas alvo para fins terapêuticos. Eles também permitem alta produtividade estudos de SAR. Para a identificação dos locais de ligação, um TYPIcal matriz peptídica normalmente contém parcialmente sobrepostos 10-20 resíduos de péptidos derivados a partir das sequências completas de uma ou mais proteínas associadas da proteína alvo desejado. O rastreio da matriz para a ligação da proteína alvo revela os péptidos de ligação, o que corresponde aos locais de ligação nas proteínas parceiras, em um método fácil e rápido usando apenas uma pequena quantidade de proteína.
Neste artigo descrevemos um protocolo de triagem de matrizes de peptídeos para mapear os sítios de interação entre uma proteína-alvo e seus parceiros. A matriz péptido foi concebido com base nas sequências das proteínas parceiras, tendo em conta as suas estruturas secundárias. As matrizes utilizadas neste protocolo foram Celluspots matrizes preparadas por INTAVIS bioanalíticos Instruments. A matriz é bloqueada para evitar ligação inespecífica e depois incubadas com a proteína estudada. A detecção utilizando um anticorpo revela os péptidos de ligação correspondentes aos sítios específicos de interacção entre as proteínas.
Introduction
Interacções proteína-proteína mediar a maior parte dos processos na célula viva. Interacções proteína Deficiência pode resultar em doença, as interacções proteicas importantes alvos de drogas. Assim, é muito importante para compreender essas interações a nível molecular. Interacções entre proteínas são estudados usando uma variedade de técnicas que vão desde os ensaios celulares e bioquímicos para ensaios quantitativos biofísicas, e estas podem ser realizadas tanto com as proteínas de comprimento completo, com domínios de proteína ou com péptidos. Peptídeos servir como excelentes ferramentas para estudar interações protéicas. Isto é porque os péptidos podem ser facilmente sintetizadas e permitem que a focagem sobre um sítio de interacção específica de um lado e de vários alvos de proteína de uma forma de alto rendimento, por outro lado 1,2. Rastreio de matriz é um péptido rápido, fácil de executar método para a obtenção de uma grande quantidade de dados sobre as interacções de uma proteína alvo com numerosos parceiros num curto espaço de tempo 3. Ao contrário de outros métodos bioquímicos ou biofísicas para detectar e analisar interacções proteína-proteína, péptido rastreio matriz requer uma concentração muito baixa de proteína e pode detectar ligação muito fraca. Matrizes de péptidos pode ser utilizada para muitas aplicações em interacções péptido-proteína, tais como mapeamento de proteína-proteína ou sítios de interacção ligando-receptor 4, interfaces de homo- ou hetero-oligomerização, anticorpos que caracterizam epitopos 5, 6 estudar as actividades enzimáticas e de alto rendimento estrutura- relação atividade (SAR) estuda 7. Para uma análise aprofundada sobre a seleção matriz peptídeo ver Katz et al. 4
Vários tipos de matrizes de péptidos existem actualmente. Existem duas principais estratégias sintéticas para preparar matrizes de péptidos: síntese dos péptidos antes anexando-os ao suporte sólido, ou a síntese de péptidos directamente no suporte sólido, utilizando principalmente o SPOT 4,8 técnica. Oos péptidos são sintetizados sobre o suporte sólido geralmente por 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) 8 química. Entre os esquemas sintéticos comuns são apego peptídeo através do terminal N (por exemplo, JPT Pepstar matrizes 9) e apego peptídeo através do terminal C (por exemplo, PEPSCAN matrizes pepchip 10, JPT pepspot matrizes 9 e INTAVIS matrizes celluspot 11) 4. O suporte sólido pode variar e assim faz a química do acoplamento de péptidos a ele. Péptidos de Cis-terminados pode ser ligado a lâminas de vidro através do grupo tiol 12. O terminal N de um péptido pode ser ligado covalentemente a um grupo hidroxilo na membrana de celulose através de esterificação do aminoácido ligado 8.
Aqui é apresentado um protocolo detalhado para o rastreio de matrizes de péptidos como um método para estudar as interacções proteína-proteína. A matriz que é utilizada a matriz Celluspots, que é uma micro-array contendo grande amount de pontos (duplicatas de até 384 pontos) em uma membrana de celulose pequena apoiados por uma lâmina de vidro. Isto permite trabalhar com volumes baixos de proteína e anticorpos e obtenção quantidade significativa de dados por única experiência. Essa matriz também contém alta densidade peptídeo que permite a detecção de baixa afinidade de ligação. A matriz foi utilizado para o mapeamento da interacção Stil-chfr, o que é altamente importante para o controlo da proliferação celular normal 13. Descontrolada interacção entre as duas proteínas pode levar ao desenvolvimento de cancro. Ao mapear essa interação encontramos o sítio de ligação específico e resíduos de 14 vinculativa. Isso abre o caminho para a concepção de inibidores racionais que inibem esta interação proteína-proteína.
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Protocol
1. Criando uma matriz de Peptide
- Dividir a sequência da proteína alvo em parcialmente sobrepostos 10-20 resíduos péptidos. Variar a quantidade de sobreposição no experimento específico e os recursos do laboratório de realização, mas, em princípio, quanto mais tempo a sobreposição da melhor. Ao projetar os peptídeos ter em conta conhecidos elementos da estrutura secundária da proteína que pode ser responsável pela interação.
- Encomende a matriz peptídeo projetado através de fornecedores comerciais. Aqui, o uso péptidos ligados covalentemente à matriz através do C-terminal.
2. Bloqueio de ligação não específica
- Adicione uma solução tampão 50 mM Tris ou fosfato contendo 0,05% de Tween 20 (TBST / PBST) e ajustar ao pH desejado com uma quantidade medida de HCl ou NaOH (para saber a força iónica preciso) e a força iónica desejada com NaCl . Aqui, usar um pH de 7,5 e uma força iónica de 150 mM.
- Adicione uma solução de bloqueio de2,5% (w / v) de leite em pó desnatado em TBST / PBST.
- Para impedir a ligação não específica, imergir a matriz em 5 ml de solução de bloqueio. Incubar a matriz durante 2-4 horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C num agitador.
3. A incubação com a Proteína
- Lava-se a matriz primeiro com 5 ml de solução de bloqueio durante 30 segundos e, em seguida, duas vezes com 5 mL de TBST / PBST, durante 5 min num agitador à temperatura ambiente.
- Incubar a matriz lavada com 5 ml de solução de proteína marcada com His contendo 2,5% (w / v) de leite em pó desnatado para prevenir a ligação não específica. Aqui, utilizar 4,5 ^ M de solução de proteína (STIL 500-650) dissolvido na solução de bloqueio descrito.
NOTA: Normalmente de 5-10 uM de proteína são usados para o rastreio, mas a concentração de proteína pode ser mesmo tão baixa como 2-3 uM, dependendo da afinidade de ligação e as concentrações locais de péptidos que se ligaram na matriz (a eficiência da síntese). O tampão no qual a proteínaé dissolvido pode variar, mas é comum para diluir a proteína utilizando a mesma solução de bloqueio descrito acima. - Incubar a matriz na solução de proteína de 3-8 horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ºC.
4. A incubação com o anticorpo
- Lava-se a matriz três vezes com 5 mL de TBST / PBST. A primeira lavagem é de 30 seg seguido por duas lavagens de 5 min no agitador, à temperatura ambiente.
- Incubar a matriz lavada com 5 ml de anticorpo conjugado com HRP diluída (1: 1500) em um tampão de incubação que contém os mesmos ingredientes nas mesmas concentrações como a solução de bloqueio, durante 1 h num agitador à temperatura ambiente. O anticorpo pode ligar-se quer a proteína alvo, ou a etiqueta.
- Realizar experiências de controlo testar a interacção do anticorpo com os péptidos sobre a matriz, especialmente se a matriz contém péptidos da proteína alvo (por exemplo, para estudos de oligomerização) através da repetição do mesmo protocolo sem step 3, a incubação com a proteína.
- Lava-se a matriz três vezes com 5 mL de TBST / PBST. A primeira lavagem é de 30 seg seguido por duas lavagens de 5 min no agitador, à temperatura ambiente.
5. Leitura da Matriz
- Realizar desenvolvimento de quimiluminescência com um kit de substrato western blotting ECL.
- Realizar a detecção com um analisador de imagem luminescente.
- Analisar os resultados. Certifique-se de que ambos os duplicados na matriz apresentam os mesmos sinais, por isso os resultados são confiáveis. Se a estrutura do parceiro de proteína é conhecido, pesquisa sobre a estrutura para os péptidos de ligação e procurar os locais de ligação. Mesmo os péptidos que estão longe na sequência podem estar próximos uns dos outros na estrutura terciária e criar um local de ligação.
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Representative Results
STIL é uma proteína centrosomal altamente importante. Ele controla a divisão celular normal e proliferação celular 13,15 - 19. STIL interage com várias proteínas 18,20,21, e a maior parte das interacções ocorrer através da sua parte central, que é uma região intrinsecamente desordenados (IDR) 14. Concebemos uma matriz composta de péptidos derivados da proteína de ligação STIL chfr. Chfr é um supressor de tumor que é induzida em resposta ao estresse 22 mitóticas. Uma vez que a estrutura do domínio de ligação de STIL chfr era desconhecida na altura, dividiu-se o domínio de proteína de 15 resíduos de comprimento péptidos com sobreposição de 7 resíduos, tal como descrito na etapa 1.1 do protocolo. Foi realizada uma série de péptidos triagem para identificar os locais de ligação chfr-Stil, como detalhado no protocolo acima e ilustrado na Figura 1. Utilizou-se uma matriz INTAVIS Celluspot composto por 384 péptidos em duplicados, o que pode proporcionar uma enorme quantidade de informações, como demonstrado na Figura 2. Utilizando essa matriz peptídeo encontramos os sítios de ligação para STIL em sua proteína chfr ligação (Figura 3). Cada mancha preta na matriz representa um chfr peptídeo derivado que ligava STIL. Note-se que cada péptido é exibida duas vezes, uma vez que existe em duplicado, que verifica a fiabilidade dos resultados. A interação entre STIL e chfr foi demonstrado anteriormente no nível de proteína 13,14. O rastreio de matriz péptido revelado 7-chfr péptidos derivados que se ligam STIL IDR, os resíduos 500-650 (Figura 3, Amartely et al. 14). Estes resultados permitiram mapear o sítio de ligação da STIL em chfr. Apesar da distância destes péptidos em 7 chfr sequência primária eles criam um local de ligação bem definidos para STIL em chfr (Figura 4) 14.
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Figura 1: Um esquema de triagem matriz peptídeo A- Projetando uma matriz peptídeo que consiste parcialmente sobrepostas peptídeos derivados de uma ou mais proteínas parceiras, tendo em conta as suas estruturas secundárias;. B- A incubação com a proteína alvo; C- A incubação com um anticorpo para a detecção; Detecção de D- (pode ser feito por quimioluminescência, a fluorescência, etc.); E- Analisando os resultados para revelar a sítios de ligação da proteína. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2:. Um exemplo de matriz peptídica triagem Detecção conseguido usando quimiluminescência O slide contém dois arrays idênticos como duplicatas..es / ftp_upload / 52097 / "target =" _ 52097fig2large.jpg blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Rastreio de uma matriz para a ligação do péptido STIL IDR a proteína chfr: 4,5 uM His-tag STIL 500-650 foi pesquisada quanto à ligação da matriz. Cada mancha preta indica ligação entre o fragmento STIL eo peptídeo derivado chfr-14. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: O local de ligação STIL em chfr mostrado na estrutura do domínio rico chfr Cys (resíduos 424-661, PDB ID: 2XPO) A sete.peptídeos que prendiam STIL na triagem matriz peptídeo pode ser dividido para três regiões coloridas rosa, laranja e vermelho, que são distantes na seqüência primária, mas próximos entre si na estrutura 3D criando um sítio de ligação. Esta região cheia forma uma cavidade de ligação para STIL no chfr dímero 14. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Rastreio de matriz péptido é uma excelente ferramenta para identificar os locais de ligação de uma proteína alvo nos seus parceiros. Este ensaio é rápido e fácil de realizar e os resultados podem ser obtidos em um ou dois dias de trabalho. Rastreio de matriz péptido é versátil e pode ser usado para muitas finalidades. Ele pode ser usado para a caracterização de modificações pós-tradução, tais como a fosforilação e identificação de substratos de quinases. Por exemplo: a quinase FLT3, que está relacionada com leucemia mielóide aguda, Tyr fosforila péptidos contendo substrato encontrados por uma matriz de rastreio de péptido 6. As propriedades inibidoras da pazopanib inibidores da tirosina quinase e lapatinib foi testado usando peptídeo matriz de rastreio 23. Os péptidos matriz pode ser utilizada para identificar os locais que medeiam as interacções proteína-proteína. Exemplos de tais proteínas estudadas no nosso laboratório utilizando este método são: a interacção entre a proteína Vif do HIV-1 e proteína celular foi A3G nos caracterizadoing uma matriz peptídeo 24; triagem matriz peptídeo foi usado para estudar as interações do anti-apoptótica da família BCL-2 com a proteína pró-apoptótica ASPP2 25 e estudar a ligação do tBID, membro da família Bcl-2, com a proteína mitocondrial MTCH2 26; a interacção intra-molecular entre os domínios Miosina CII foi analisada utilizando péptido matriz de rastreio 27. Aqui apresentamos um exemplo de como nós usamos peptídeo gama de triagem para identificar os locais que medeiam a interação Stil-chfr, uma interação proteína-proteína importante na proliferação e câncer 14. Revelando o site exacto de ligação pode servir como base para a concepção racional de inibidores da interacção estudada.
O rastreio de matriz não péptido é um ensaio quantitativo. É semi-quantitativa uma vez que a quantidade de péptido em cada ponto na matriz varia, devido à diferença no rendimento de síntese de péptidos e pureza. Isto por sua vez depende da peptídicaide sequência, comprimento, etc. A variação em rendimento e pureza, por vezes, também pode levar a resultados falsos negativos ou falsos positivos. A comparação entre as intensidades dentro da mesma matriz pode ser feita, resultando em classificação semi-quantitativa. No entanto tal comparação entre matrizes diferentes ou diferentes experimentos com a mesma matriz não é confiável. Para quantificar a ligação, os péptidos encontrados no rastreio de matriz péptido deve ser sintetizados e testados quanto à ligação à proteína alvo usando métodos biofísicos tais como a anisotropia de fluorescência, calorimetria de titulação isotérmica (ITC), a ressonância de plasmon de superfície (SPR), etc. Tais ensaios são nem sempre sensível a ligação fraca, uma vez que requerem uma elevada concentração da proteína para detectar tal ligação. O rastreio de matriz péptido, por outro lado, é muito sensível a ligação fraca. Assim, algumas das interacções observadas no rastreio de matriz não podia ser observada ou quantificada utilizando métodos tais como fluorescência anisot ropy 14. O facto de rastreio de matriz peptídica requer concentrações muito baixas de proteína combinada com a elevada sensibilidade do ensaio de fazer a matriz peptídica um método útil para o rastreio de interacções proteína-péptido em uma ampla gama de afinidades.
Os resultados falsos negativos também pode ser devido ao facto de péptidos lineares pode não representar correctamente a estrutura 3D do local de ligação na proteína. Esta não é, contudo, um problema com as proteínas intrinsecamente desordenadas, que são bem representados pelos péptidos. Os resultados falsos positivos também pode ser causada pela ligação do anticorpo para a matriz. Estes podem ser detectados através da realização de uma experiência de controlo como se descreveu na secção protocolo 4.3. Os resultados falsos negativos também podem ser obtidos, se o epitopo da proteína que é reconhecido pelo anticorpo se tornar não exposta após a ligação à matriz péptido. Este problema não é comum, mas pode ser resolvido por meio de um anticorpo policlonal contra a proteína.
jove_content "> O rastreio de matriz péptido também pode ser utilizado para melhorar o chumbo péptidos, incluindo alanina digitalizar e SAR estuda 7. Uma vez que o local de ligação do alvo é conhecida, uma matriz com base na sua sequência pode ser concebido com várias modificações incluindo substituição de cada resíduo de alanina (Ala varredura) para identificar os resíduos importantes para a interacção. De um modo semelhante, estudos SAR pode ser realizada alterando diferentes propriedades dos péptidos de ligação. Estes incluem a variação do comprimento do péptido, substituindo os resíduos de pelo correspondente D -aminoácidos e outras modificações, tais como a metilação, glicosilação e substituição por aminoácidos não-naturais. Tais peptídeos modificados, todos baseados em uma sequência alvo, podem ser sintetizados em uma matriz e rastreadas quanto à ligação à proteína alvo em uma experiência simples e rápido , proporcionando uma riqueza de informações para melhorar um inibidor potencial e compreensão do mecanismo molecular da interação.4. A matriz peptídeo aqui descrito é apenas para uso único e não pode ser reutilizado.
O protocolo aqui apresentado demonstra a grande utilidade dos arrays de péptidos. Usando uma matriz correctamente concebida, locais de ligação entre duas proteínas pode ser identificado em detalhe. Uma vez que o local de ligação está bem caracterizado que pode ser usado como um sítio alvo da droga para inibir a interacção proteína-proteína relevante. Com base nos péptidos de ligação encontradas no rastreio de matriz, pequenas moléculas inibidoras podem ser concebidos e rastreados como derivações de drogas.
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Acknowledgments
AF foi apoiado por uma bolsa a partir do Conselho Europeu de Investigação no âmbito do Sétimo Programa-Quadro da Comunidade Europeia (FP7 / 2007-2013) / acordo de subvenção CEI n ° 203413 e pelo Centro Minerva de Bio-híbrido systems.HA complexo e AI são suportadas pelo Dalia e Dan Maydan Fellowship para estudantes avançados de graduação na Universidade Hebraica de Jerusalém.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peptide array | INTAVIS Bioanalytical Instruments | ||
| His-probe Antibody (H-3) HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-8036 HRP | |
| EZ-ECL Kit | Biological industries | 20-500-120 | |
| Skim Milk | Becton, Dickinson and Company | 232100 | |
| LAS-3000 camera | FUJI film |
References
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