Summary
키네신은 미세 소관과 염기에 의존하는 상호 작용에 의해 특징 : 미세 소관의 상호 작용의주기에 결합 ATP 매출의주기를. 여기서는 형광 표지 뉴클레오티드 및 정지 흐름 형광을 사용 키네신의 ATP 턴 오버주기 개별 뉴클레오티드 천이 동력학을 분석하는 프로토콜을 기술한다.
Abstract
미세 소관 관련 모터 단백질의 키네신 상과는 모두 ATP를 가수 분해하고 미세 소관을 결합하는 특성 모터 도메인을 공유 할 수 있습니다. 키네신은 ATP 매출 및 미세 소관의 상호 작용의 두 거대 집단에서 차이를 표시합니다. 이러한 차이는화물 운송, 미세 소관 슬라이딩, 미세 소관 해중합 및 미세 소관 안정화 등 다양한 기능을 특정 키네신을 조정. 키네신의 작용 기전을 이해하기 위하여는 ATP 회전율의 화학 사이클은 미세 소관의 기계적 상호 작용 사이클에 연결되는 방법을 이해하는 것이 중요하다. ATP 턴 오버주기를 해부, 하나의 접근 방식은주기의 각 단계를 시각화하는 형광 표지 뉴클레오티드를 이용하는 것이다. ATP 회전율주기의 각 염기 전환의 반응 속도를 결정하는 것은 완전한 사이클을 식별 할 수에 대한 속도 제한 단계 또는 단계를 할 수 있습니다. 키네신, 그것은에서 속도 - 제한 단계를 아는 것이 중요키네신은 미세 소관과 함께 상호 작용할 때 미세 소관의 부재는,이 단계는 일반적으로 수천 배로 촉진되어있다. 미세 소관의 부재주기를 완전히 키네신의 ATP 회전율 사이클을 이해하는 미세 소관의 존재 하에서 그와 비교된다. 개별 뉴클레오티드 천이 속도론은 일반적으로 수동 특히 미세 소관의 존재 하에서 반응물을 혼합하여 관찰 너무 빠르다. 급속한 혼합 장치는, 예컨대 동역학은 수 밀리 초만큼 약간의 시간 척도에서 관찰 될 수 있도록 정지 흐름 fluorimeter으로, 그러한 천이를 감시하는데 사용될 수있다. 여기서는 정지 흐름에 의한 시약의 급속 혼합은 키네신의 ATP 턴 오버주기를 해부 형광 표지 뉴클레오티드와 함께 사용되는 프로토콜을 기술한다.
Introduction
키네신은 고도로 보존 된 모터 도메인 한 것을 특징으로하는 단백질의 슈퍼 패밀리이다. 키네신 모터 도메인은 뉴클레오티드 의존적으로 미세 소관과 상호 작용한다. 키네신 가족의 구성원은 미세 소관 역학 2,3를 조절 비 전좌 미세 소관 최종 바인딩 키네신에 미세 소관을 따라 감독 방식으로화물을 운반 전좌 키네신,,,에서 기능의 범위를 표시합니다.
키네신은 4-6 세포 골격 미세 소관 (microtubule)과의 상호 작용을 조절하는 adensosine-5'-삼인산 (ATP)의 매출을 사용합니다. ATP, ADP, ADP.Pi 또는 전혀 염기가 결합 될 수있다 (그림 1) : 미세 소관의 키네신 모터 도메인 때문에 친화력의 형태는 염기 상태에 따라 다릅니다. 키네신의 분자 적 메커니즘을 이해하기 위해, ATP 회전율 미세 소관과 상호 관계의 이해가 필요하다.refore은 키네신 필드의 주요 목적은 상이한 뉴클레오티드 상태의 기능적 특성 및 미세 소관의 존재 및 부재하에 둘 사이에 전환 동력학을 특성화하는 것이다.
키네신에 대한 간단한 ATP 턴 오버주기 그림 1은 네 가지 상태로 구성됩니다. 염기가없는 (Φ) 사 전환의 각각은 순방향 및 특징, ADP.P 내가 -bound, ATP가 바인딩과 ADP가 결합 된 역방향 속도 상수 (K x 및 각각 -x K).
ATP 회전율의 화학 사이클 미세 소관의 기계적 상호 작용 사이클에 결합되는 방법을 이해하기 위해서는, 하나의 레이트 microtub 부재 제한 ATP 회전율주기의 어느 단계를 결정해야한다개 모듈은 다음 사이클이 미세 소관의 존재에 의해 변경되는 방식을 결정합니다. 가장 간단한 ATP 턴 오버주기는 네 개별 화학 물질 단계로 구성 : (1) ATP가 빈 사이트에 바인딩 (Φ가 빈 사이트, 즉 염기없는 키네신을 의미한다); (2) ATP 분열; (3) 인산의 해리 및 (4) ADP 해리 (도 1). 속도 제한 단계는 완전한 사이클 ATP 턴 오버에 대한 속도 상수를 설정한다. 따라서, 각각의 천이 각각 측정하고 완전한 사이클에 대한 속도 상수에 비교해야 속도 제한이있는 단계를 결정한다. 방법은 여기서 설명되지 않은 전반적 ATP 회전율 사이클 속도 상수를 측정 할 수 있지만 여기에 참고 7에서 발견 될 수 있고, 우리는 각각의 단계에 대한 화학적 반응 속도 상수를 판별 할 수있는 방법을 설명한다. 염기 가수 분해 단백질의 정점에서 개개의 전환주기를 연구하는 데 사용할 다수의 방법이있다. 여기에 제시된 방법은 advantag을형광 물질로 표지 된 methylanthraniloyl 뉴클레오티드의 특성 예는, 일반적으로 단백질 (8)에 결합시 형광 강도의 변화를 표시 mant, 라. 그것의 작은 크기는 리보오스 (도 2A)에 결합 될 때, 그것은 일반적으로 뉴클레오티드 결합 또는 9-12의 가수 분해 반응 속도에 거의 또는 전혀 효과를 가지고 있음을 의미하기 때문 mant 그룹이 사용된다. 여기서는 키네신의 ATP 턴 오버주기 뉴클레오티드 결합 및 분리의 관찰을 할 수 있도록 정지 흐름과 결합해서 형광 mant-표지 된 뉴클레오티드의 사용을 기술하는 프로토콜을 제시한다.
Protocol
Mant 표지 된 뉴클레오티드의 결합에 따라 형광 강도의 변화의 1 결정.
- 적절한 반응 버퍼에 1 μM의 키네신 (최종 농도)에 1 μM의 mant 표지 뉴클레오티드를 추가합니다. 일반적으로 미세 소관의 성장과 안정성을 혜택을 버퍼 (설명을 참조)이 사용됩니다. 일반적으로 사용되는 버퍼 80MM 피페 라진 비스-2-에탄 술폰산 (PIPES)가 포함 pH6.9, 1mM의 MgCl2를 및 1mM의 에틸렌 글리콜 비스-2-아미노 에테르 디아민 테트라 아세트산 (EGTA).
참고 : 모든 프로토콜에 명시된 키네신의 농도는 염기 결합 부위 (즉, 모터 도메인)의 농도를 의미한다. 다른 키네신은 단량체, 이량 체 또는 테트라로 존재 등 분자 당 하나 이상의 뉴클레오티드 바인딩 사이트를 포함 할 수 있습니다. - 잠복기 (1-3 분) 및 표준 fluorimeter 사용 후 mant 표지 된 뉴클레오티드 키네신 컴플렉스의 발광 스펙트럼을 측정한다. 365NM의 여기 파장을 사용측정 단위는 1nm 400-500 nm의 빛을 방출.
- 단계 1.1에서 사용 된 것과 동일한 반응 완충액가 1mm의 용액 mant 표지 된 뉴클레오티드를 확인.
- 전술 한 바와 같이, mant 뉴클레오티드에만 샘플 발광 스펙트럼을 측정한다 (단계 1.2 참조).
- 이 값을 통해 나누어 (키네신없이 즉,) 용액 mant 뉴클레오티드의 형광 스펙트럼의 피크 강도의 파장에서 신호 스펙트럼을 정규화.
- (예를 들어, 그림 2B)가 mantATP 바인딩 및 / 또는 솔루션 mantADP 바인딩 키네신과 mant 염기 사이의 형광 강도의 차이를 관찰하기 위해 정규화 된 스펙트럼을 그린다.
mantATP 협회 및 해리 속도 상수의 2 측정
- - 무료 버퍼 2 + 적절한 마그네슘 최대 20 μM의 키네신 (설명 참조)의 용액에 (예를 들어, 80MM 파이프 pH6.9, 1mM의 EGTA, 0.1 % 트윈 20) 하나를 추가MM은 (최종 농도) 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 및 1 ㎜ (최종 농도) 디티 오 트레이 톨 (DTT). 참고 :이 감소로 버퍼에 트윈 20의 추가 권장 / 버퍼 교환을 위해 사용되는 열을 키네신 단백질의 손실을 방지하는 단계 (2.3 및 3.3)
- 15 분 동안 25 ° C에서 솔루션을 품어.
- (물질의 목록 참조) 제조업체의 지침에 따라 중력 흐름 G-25 세파 덱스 겔 여과 컬럼을 사용하여 키네신에서 별도의 무료 염기 및 EDTA.
- 적절한의 Mg 2 + 불 함유 버퍼의 적어도 3 컬럼 부피로 컬럼을 평형화 (단계 2.1 참조). 컬럼 상에 키네신 함유 용액을로드합니다. 염화 마그네슘의 최종 농도는 용액 키네신의 컬렉션 후 1 ㎜가되도록, 빈 튜브 100mm의 염화 마그네슘 용액의 적합한 양을 첨가하여 포집 관을 준비한다. 마그네슘 클로라이드의 직접 첨가 열차 단 도움염기가없는 키네신을 SE는.
- 적절한의 Mg 2 + 불 함유 완충액을 사용하여 용출 키네신. 빠르게 작업 할 때 중요하므로 염기의 무료 키네신은 불안정하다. 얼음에 염기가없는 키네신을 저장하고 1 ~ 2 시간 이내에 사용한다.
- 중이나 종래 뉴클레오티드 프리 키네신의 준비로, 염기 무 키네신의 최종 용액과 동일한 반응 완충액의 농도 mantATP 시리즈를 준비한다. 0.1 ~ 50 μM (단계 2.5 및 설명을 참조)에 이르기까지 전형적인 시리즈 키네신의 사용 가능한 농도에 따라 필요한 mantATP의 농도의 범위를 결정합니다.
- 염기가없는 키네신의 농도 시리즈를 준비합니다. mantATP의 각 농도 (단계 2.4)의 경우, 무 염기 키네신의 농도 mant 표지 된 뉴클레오티드가 키네신 뉴클레오티드 결합 부위 위에 5-10 배 몰 과량이되도록 제조한다.
- 정지-FLO에 여기 파장을 설정365 ㎚에 fluorimeter w 및 긴 - 패스 필터를 사용하여> 400 nm에서 방출 된 광을 수집한다.
- 정지 흐름 fluorimeter (그림 3a 및 3b 삽입 된)를 사용하여 1 V / V 비율 : mantATP의 가장 낮은 농도부터 하나의 염기가없는 키네신의 적절한 농도 mantATP을 섞는다. 참고 : 반응물이 혼합에 50 % 희석된다. 혼동을 피하기 위해 염기 농도 모두 사전 및 사후 혼합 (즉, 3.0 / 1.5 μM)를 기록해 두십시오.
- mant기로 photobleaching에 설명하기 위해, 지수 함수를 더한 일정한 음의 기울기의 선에 mantATP의 각 농도에서 측정 된 형광 강도의 변화를 장착한다 (즉, 형광 공 .EXP (OBS .T를 K) + (m를 =. t + 0 진폭 C), 케이 OBS는 속도 상수이고, t는) 그림 (b)와 토론을 볼 시간입니다. 이러한 맞는에서를 결정mantATP 각각의 농도에서 상수 (k 개의 OBS)를 평가했습니다. 각 케이 OBS는 협회와 해리 속도 상수 (그림 1, K 1과 K-1)의 컨볼 루션이다.
- (예를 들어, 그림 3C) mantATP 농도에 대해 케이 OBS 음모를 꾸미고하여 협회와 해리 속도 상수를 Deconvolve. 기울기와 y 축 절편을 얻기 위해 선형 함수 (즉, 케이 OBS = K 1 [mantATP] + K-1)에이 데이터를 맞 춥니 다. 그라디언트 단위 M -1의 -1과 mantATP 협회 (그림 1, K 1)에 대한 속도 상수를 나타낸다. 절편들 -1 (논의를 참조)의 단위와 해리 속도 상수 (도 1, K -1)을 나타낸다. 이 접근법은 또한 ADP 협회 및 해리를 결정하기 위해 적용될 수있다 : 참고염기로 mantADP를 사용하여 속도 상수 (그림 1, K -4 K 4).
mantADP의 해리 속도의 3 측정 상수
- 적합한 반응 완충액 2 μM의 키네신의 용액에 (예를 들면, 80 밀리미터 PIPES pH6.9, 1mM의 MgCl2를, 1mM의 EGTA는 0.1 % 트윈 20), 50 μM mantADP (최종 농도)를 추가한다.
- 30 분 동안 25 ℃로 품어.
- G-25 세파 덱스 컬럼을 사용하여 선택한 반응 버퍼에 키네신를 교환 버퍼에 의해 초과 mantADP 및 기타 무료 염기를 제거 제조업체의 지침에 따라 (물질의 목록 참조). 키네신 모터 도메인은 지금 mantADP로드해야합니다.
- 365 ㎚에 정지 흐름 fluorimeter에 여기 파장을 설정하고 긴 통과 필터를 사용하여> 400 nm에서 방출 된 광을 수집한다.
- 50 배 이상 MOLA으로 mantADP.kinesin 단지 (~ 1μM)를 혼합정지 흐름 fluorimeter (그림 4a 및도 4b 삽입 된)를 사용하여 1 V / V 비율 : 1에서 레이블이없는 ATP의 R 초과.
- 단일 지수 함수 플러스 mant 그룹의 광표백를 고려하여 일정한 음의 기울기의 라인에 시간이 지남에 따라 관찰 형광 강도의 감소를 장착한다 (즉, 형광 공 .EXP (OBS .T를 K) + (m.t +를 = 공은 진폭 여기서 c), 케이 OBS는 속도 상수이고, t는 시간,) 그림 (b)와 토론을 참조하십시오. 이 피트로부터 결정된 k 개의 S는 OBS -1 (논의를 참조)의 단위 ADP (도 1, K 4)의 해리에 대한 속도 상수이다.
Representative Results
mant 군의 형광 강도의 증가는 통상적으로 키네신 mant 표지 된 뉴클레오티드의 결합시에 관찰된다. 그러나, 이러한 신호 변화의 크기가 문제가되는 특정 키네신에 의존한다. 따라서, 운동 분석을 진행하기 전에 형광 강도의 변화의 유무와 크기를 모두 확인 평형 측정을 수행하는 것이 유용하다. mantATP 및 mantADP 대표적인 형광 스펙트럼, 솔루션 및 키네신-13, MCAK 복잡한 모두, 그림 (b)에 표시됩니다. 이러한 데이터는 MCAK 바인딩시 mantATP과 mantADP 모두 표시 형광 강도 증가를 강조. 키네신에 mant 염기의 결합에 따라 형광 강도의 변화는 협회와 ATP와 ADP 모두의 해리에보고하는 데 사용됩니다 (제 2 조 및 제 3). MCAK의 경우에는 형광 강도의 차이는 mantATP.kinesin 및 mantADP.kinesin 사이 관찰 도 3a는 뉴클레오티드 프리 mantATP 키네신과 혼합시에 발생하는 반응을 나타낸다. 키네신 mantATP-13의 결합시 발생하는 형광 강도의 증가를 나타내는 데이터는 주제, MCAK는도 3b에 도시된다. 도 3b에 도시 된 형태의 데이터 mantATP 농도의 범위에서 수집된다. mantATP 농도 대 결정된 속도 상수 (k 개의 OBS)의 플롯은 그림 3C에 표시됩니다. 선형 함수에 이러한 데이터를 피팅 (즉, 케이 OBS = K 1 [mantATP] + K -1) OBS를 (2.8 단계) K에 기여 속도 상수의 디컨 볼 루션을 할 수 있습니다. 따라서, 연관 및 mantATP 대한 해리 속도 상수 모두의 결정을 가능하게 (도 1, K 1 및 K 도 4a는 비 표지 ATP의 과량 mantADP.kinesin 혼합시에 발생하는 반응을 나타낸다. 도 4b의 데이터는 키네신-13, MCAK로부터 해리시 mantADP 관찰 형광 강도의 감소를 나타낸다. mantADP의 해리에 대해 (단계 3.6)의 지수 함수에 속도 상수를이 데이터를 피팅하여 결정된다. 
형광 물질의 methylanthraniloyl (mant)로 표지 그림 2 뉴클레오티드는 ATP 턴 오버주기의 각 단계를 분리하는 데 사용됩니다. 리보오스에 위치 2 '또는 3'중 하나에 접합 mant의 형광 물질의 위치를 보여주는 mantATP의 (A)의 구조. (B) 용액 (있는 no)에 대한 mantATP 및 mantADP 노멀라이징 형광 스펙트럼과 mantATP키네신 MCAK (mATP + MCAK 및 mADP + MCAK) 복잡한에서 D mantADP. mantATP 스펙트럼은 용액에 mantADP에 최대에 형광성 표준화 된 솔루션 mantATP에 대한 최대의 형광 mantADP 스펙트럼 정규화되어 있습니다. MCAK와 혼합 mant 뉴클레오티드의 스펙트럼은 1 분 후 혼합시 징수됩니다. 같은 프로토콜에 설명되어 시약 및 fluorimeter 설정의 농도는 1.1 및 1.2 단계를 반복합니다. 
mantATP의 연결 속도 상수의 그림 3 측정. (A) 중단 흐름에 의해 장소 후 혼합한다 반응 묘사 설계도 : mantATP (mATP하는) 뉴클레오티드 무료로 키네신 결합. 단백질에 결합시 mant 그룹 증가 형광 강도. (B) 형광 신호 변화 (검정)과 mantATP MCAK (25 M) (5 M의 뉴 혼합시 관찰cleotide 무). 이 데이터는 (토론 참조) mant의 형광의 photobleaching에 대한 계정을 하나의 지수 함수 플러스 일정한 음의 기울기의 라인에 적합 (빨간색 점선)는 삽입 된 :. 전에 중지 흐름 fluorimeter에 혼합에 주사기의 내용. 염기가없는 MCAK와 mantATP의 반응에 대해 결정 (C) 속도 상수 (k 개의 OBS)는 mantATP의 농도 역모를 꾸몄다. 이 그래프는 M -1 (S)의 단위와 연관 속도 상수 (도 1, K, 1) 인 구배 -1 y 절편은 해리 속도 상수 인 (도 1, K-1)와 함께 선형 영역을 갖 의 단위 -1. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
. mantADP 미리로드 키네신은 레이블이없는 ATP의 과잉으로 희석 : mantADP의 해리 속도 상수의 그림 4 측정 (A) 도식이 중지 흐름으로 자리 포스트 혼합 걸리는 반응을 묘사. 해리 mantADP함으로써 mantADP 협회 (논의를 참조)의 위로 반응을 예방, 비 표지 ATP에 의해 대체된다. mant 군의 형광 강도는 단백질로부터 해리 따라 감소한다. 키네신 MCAK mantADP로부터의 분리시에 관찰 (B) 형광 감소. 형광 신호 (블랙) (설명을 참조) mant기로 photobleaching에 대해 고려하여 단일의 지수 플러스 일정한 음의 기울기의 선에 맞는 (점선 적색)이다. 결정 속도 상수 mantADP (그림 1, K의 해리에 대한 속도 상수4) 삽입 된 :.. 중지 흐름 fluorimeter에 혼합하기 전에 주사기의 내용 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
여기에, 우리는 키네신에 대한 염기 상태 사이의 전환 역학의 관찰 및 분석을위한 프로토콜을 제시한다. 이러한 프로토콜은 형광 표지 뉴클레오티드와 함께 급속 혼합 방법 정지 흐름을 이용한다. 이 유형의 방법은 키네신 9-11,13-16의 다양한 뉴클레오티드가 결합 및 해리 공부 광범위하게 사용되어왔다. 인산 릴리스 (그림 1, 3 단계)의 관찰을 허용하지 설명하는 방법. 그러나, 정지 흐름 형광은 형광 강도의 변화 (17)에 결합하도록 인산염의 인산염 생산을 감지 단백질을 이용하여 이러한 전환을 관찰하기 위해 사용될 수있다. 단백질에 결합 할 때, 일반적으로 형광 강도의 증가를 나타내는 작은 형광 단 methylanthraniloyl (mant)로 표지 뉴클레오티드를 이용 제시 방법. 또한, mant의 형광체는, 경우에 R 2 '또는 3'위치 중 하나에 접합ibose 종종 염기 9-12의 결합, 분해 또는 가수 분해에 거의 또는 전혀 효과가 있습니다. Mant 표지 뉴클레오티드는 상업 소스 (재료의 목록 참조)에서 쉽게 사용할 수있는 단일 이성질체 8 정제 할 때 빠르게 다시 평형으로 2 '및 3'복합체의 혼합물로 제공됩니다. Mant 표지 뉴클레오티드는 염기 결합과 분해의 반응 속도를 관찰 할 수있는 훌륭한 기자 분자를 확인합니다.
형광 표지 된 뉴클레오티드의 사용은 기재된 분석에서 형광 강도의 실시간 변경을 판독한다는 것을 의미한다. 이는 시약의 신속한 혼합과 후속 반응과 관련된 형광의 변화를 실시간 관찰을 허용 정지 흐름 형광, 이러한 분석에 적합하다. 검출의 방법으로서 혼합 기술과 같은 형광 정지 흐름의 조합이 상대적으로 샘플 EF 인 시스템을 생산ficient. 예를 들어, 0.8 필요도 3c에 도시 된 데이터를 획득하기 위해 - 정제 키네신-13 1.0 mg의, MCAK는,도 4b에 도시 된 데이터를 획득하는 것은 ~ 정제 키네신-13, MCAK 0.3 밀리그램을 필요로한다. 형광 물질로서 mant의 사용의 한 가지 단점은 photobleaching에 경향이 있다는 것이다. 이것은 정지 흐름에서, 키네신의 부재 하에서, 반응 완충액 mant 표지 된 뉴클레오티드의 용액을 혼합하여, 반응 동력학을 키네신 분리하여 관찰 될 수있다. mant 그룹이 표백 된대로 형광 강도의 느린 감소는 관찰된다. mant 그룹의 광표백을 설명한 프로토콜에 사용되는 시간의 척도의 범위에서 잘 선형 함수에 의해 설명된다. 따라서, 광표백에 대한 데이터를 보정하는 방법은 단순한 하나의 파라미터에 의해 설명 된 선형 함수 (즉, MT + c)가 아닌 일반적인 평평한 기준선에 의해 설명 기준선 지수 함수로 적합 할 것이다.
mantATP 바인딩
mantATP 협회와 해리에 대한 속도 상수 미세 소관의 부재에서 키네신 뉴클레오티드 바인딩 사이트와 연결된 상태를 유지 (2 절) ADP를 측정 할 때 제거해야합니다. 이 mantATP 협회와 해리 (그림 1, 1 단계) ADP 해리 분리하여 관찰 할 수 있습니다. 이 키네신은 뉴클레오티드 결합 부위 (단계 2.1)를 통해 EDTA의 적어도 50 배 과량 인큐베이션 달성했다. EDTA는 마그네슘 2 + 이온은 염기 (11)의 방출을 초래 염기 결합 주머니에서 해리의 Mg 2 +를 일으키는 원인이 담즙산. 수행은 2.1 단계 때 따라서, - 2.3, 그것은 2 +의 Mg 무료 버퍼를 사용하는 것이 매우 중요합니다. 염기가없는 키네신 단백질은 버퍼가 무료 염기로부터 EDTA에서 모두를 분리하는 교환이다. 이 분리, 일회용 중력 흐름 GE를 달성하기리터의 여과 열은 충분하며, 간단하고 (물질의 목록 참조)를 사용하는 것이 빠르다. 자유 염기와 mantATP 키네신의 상호 작용과 연관 해리 속도 상수 (단계 2.8)의 컨벌루션 있도록 mantATP 농도 (단계 2.4)의 범위에서 수행된다. 이러한 유형의 실험 뒤에 이론은 잘 하나 mantATP의 낮은 농도로 시작이 실험을 수행하는 참고 문헌 18에 기재되어있다. 이것은 다른 농도 사이의 세척 단계의 필요성을 제거합니다. 그것은 가능성 mantATP 농도가 증가함에 따라 중지 흐름 fluorimeter의 감도를 조정하는 것이 필요하다. mantATP 농도는 항상 의사 일차 조건을 유지하기 키네신 뉴클레오티드 결합 부위의 농도에서 최소한 5 배를 초과해야한다. mantATP의 농도가 증가함에 그러나, 신호 변화가 감소 키네신에 결합 뉴클레오티드의 분수로 일손이 될 수있다. Therefo, 키네신의 농도는 각각의 새로운 mantATP 농도 증가 mantATP 재 등의 농도는 뉴클레오티드 결합 부위 (단계 2.6) 이상으로 10 배 몰 과량보다 결코 크다고.
mantADP 해리
mantADP 협회 및 해리 속도 상수는 mantATP (섹션 2)에서 기술 한 바와 동일한 방법에 의해 측정 될 수 있지만. 키네신로부터 ADP의 해리 직접 mantADP.kinesin 착체이어서 비 표지 ATP (단계 3.5)의 과량 혼합 mantADP (단계 3.1-3.3)와 뉴클레오티드 결합 부위를 미리로드에 의해 관찰 될 수있다. 초과 레이블이없는 ATP는 키네신에 mantADP의 리 바인딩을 방지함으로써 mantADP 협회에서 분리에서 관찰 할 수있는 해리 반응 (그림 1, K 사)를 할 수 있습니다. 이 분석에서, 비 표지 ATP의 농도는 NUC의 적어도 50 배 몰 과량이어야결합 부위를 leotide. 이 분석 배후 이론은 잘 이러한 직접적인 방법은 단계 2.8에서 설명 된 Y-축에 외삽 상수보다 해리 속도에 대한 정확한 값을 제공 레퍼런스 18에서 설명된다.
미세 소관의 포함
설명 된 방법은 또한 미세 소관의 존재하에 염기의 결합 및 해리 동력학을 결정하는데 사용될 수있다. 미세 소관 전에 중지 흐름에 혼합에 염기가 포함 주사기 소개 : 그림 (b)와 (b)에서 낮은 주사기 (인 세트). 이 미세 소관을 만족시키는이 구성에서, 키네신은 동시에 뉴클레오티드를 만날 것이다. 안정화 된 미세 소관은 튜 불린 중합체의 수명은 안정화 화학, 하나의 사용에 의해 확장되는 경우, 사용되는 예컨대 '구아노 신-5와 같은 탁솔 또는 nonhydrolysable GTP 유사체뿐만 - [(α, β) -methyleno] 삼인산 (GMPCPP는 물질의 목록 참조). 이는 액체 질소 9,19에서 수개월 동안 저장 될 수 있도록 미세 소관 GMPCPP와 튜 불린 중합의 2 사이클을 사용하는 것이 가능하다. 미리 제조 된 미세 소관의 사용은 상당히 이러한 분석을 수행하기에 실용적 어려움을 감소시킨다. 분석에서 미세 소관을 포함하기 위해, 미세 소관 안정에 적합한 반응 완충액을 사용하는 것이 중요하다. 선택의 버퍼 (BRB80라고도 함) 80 mM의 PIPES의 pH를 6.9, 1 mM의 MgCl2를 1 mM의 EGTA (20, 21)을 포함하는 가장 일반적으로 사용되는 버퍼 기반 PIPES이다.
설명 된 방법은 키네신과 사용이 제한되지 않지만, 구성된 모든 뉴클레오티드 결합 단백질에 적용될 수있다. 예를 들어, 유사한 방법 분자 모터 (12,22)의 미오신 가족 mant 구아노 신 표지 된 뉴클레오티드의 사용의 상기 연장 부재의 ATP 회전율 사이클에 적용된이 유형의 방법은 단백질 23,24 GTP 가수 분해한다.
Disclosures
저자는 그들이 더 경쟁 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 생명 공학 및 생물 과학 연구 협의회 (BBSRC), 왕립 학회와 노팅엄 대학에서 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2’/3’-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5’triphosphate | Jena Biosciences | # NU-202 | mantATP |
| 2’/3’-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5’-diphosphate | Jena Biosciences | # NU-201 | mantADP |
| Mg-ATP | Roche | # 10519979001 | The disodium salt of ATP is made to a concentration of 100 mM in 100 mM MgCl2. Concentration should be verified by absorption at 260 nm (e = 15,400 M-1cm-1). Solution stored in aliquots at -20 oC. |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP120-500 | 0.5 M stock solution in water, pH 8.0. HAZARD: powder harmful if inhaled. |
| Dithiothreitol (DTT) | Melford | MB1015 | 1 M stock solution in water made fresh for use on the same day. HAZARD: powder harmful if inhaled or in contact with the skin. |
| NAP-5 column | GE Healthcare | # 17-0853 | G-25 sephadex resin gravity-flow gel filtration column |
| GMPCPP | Jena Biosciences | # NU-405 | nonhydrolysable analogue of GTP |
| Stopped-flow fluorimeter | Applied Photophysics | SX20 | A fluorimeter with some plumbing attached, which allows reagents to be rapidly mixed in the observation cuvette. Thereby allowing the kinetics of reactions on timescales of ~0.1 - 100 sec to be monitored. |
References
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