L'uso di stopped-flow fluorescenza ed etichettati nucleotidi di analizzare il ciclo Fatturato ATP di kinesine

Summary

Kinesine sono caratterizzati dall'interazione nucleotide-dipendente con microtubuli: un ciclo di fatturato ATP accoppiato ad un ciclo di interazione microtubuli. Qui, descriviamo i protocolli di analizzare la cinetica delle singole transizioni nucleotide nel ciclo fatturato ATP di una cinesina utilizzando nucleotidi fluorescente e stopped-flow fluorescenza.

Abstract

La superfamiglia cinesina di microtubuli associati proteine ​​motrici condividono un dominio motore caratteristica che sia idrolizza ATP e lega i microtubuli. Kinesine mostrano differenze tra la superfamiglia sia in fatturato ATP e nell'interazione microtubuli. Queste differenze personalizzare kinesins specifici per varie funzioni, come il trasporto merci, microtubuli scorrevole, depolimerizzazione dei microtubuli e la stabilizzazione dei microtubuli. Per comprendere il meccanismo di azione di un chinesina è importante capire come il ciclo chimica del fatturato ATP è accoppiata al ciclo meccanico di interazione microtubuli. Per sezionare il ciclo di fatturato ATP, un approccio è quello di utilizzare nucleotidi fluorescente di visualizzare singole fasi del ciclo. Determinazione della cinetica di ogni transizione nucleotide nel ciclo di fatturato ATP permette la tappa limitante o passi per il ciclo completo di identificare. Per un chinesina, è importante conoscere la tappa limitante, inl'assenza di microtubuli, in quanto questo passaggio viene generalmente accelerato diverse migliaia di volte quando la cinesina interagisce con i microtubuli. Il ciclo in assenza di microtubuli viene poi confrontata con quella in presenza di microtubuli per comprendere appieno ATP ciclo fatturato di un chinesina. La cinetica di singoli nucleotidi transizioni sono generalmente troppo veloce per osservare mescolando manualmente reagenti, in particolare in presenza di microtubuli. Un dispositivo di miscelazione rapida, ad esempio un fluorimetro stopped-flow, che permette cinetica da osservare su scale temporali di appena qualche millisecondo, può essere utilizzato per monitorare tali transizioni. Qui, descriviamo i protocolli in cui la rapida miscelazione dei reagenti di stopped-flow viene utilizzato in combinazione con nucleotidi fluorescente a sezionare il ciclo fatturato ATP di una cinesina.

Introduction

Le kinesins sono una superfamiglia di proteine ​​caratterizzate da un dominio motore altamente conservata ^1. Il dominio motore cinesina interagisce con i microtubuli in modo nucleotide-dipendente. I membri della famiglia cinesina visualizzano una gamma di funzioni da kinesins translocating, che trasportano merci in modo diretto lungo i microtubuli, a kinesins finali vincolante non translocating microtubuli, che regolano la dinamica dei microtubuli ^2,3.

Kinesine utilizzano il fatturato di adensosine-5'-trifosfato (ATP) per regolare la loro interazione con il citoscheletro dei microtubuli ^4-6. La conformazione del dominio motore chinesina e quindi la sua affinità per il microtubulo dipende dal suo stato di nucleotidi: ATP, ADP, ADP.Pi o nessun nucleotide possono essere vincolati (Figura 1). Per comprendere il meccanismo molecolare di una cinesina, è necessaria una comprensione del rapporto tra il fatturato ATP e l'interazione dei microtubuli. Ilto, è un obiettivo importante nel campo kinesin è quello di caratterizzare le proprietà funzionali dei diversi stati nucleotidi e la cinetica delle transizioni tra di loro sia in presenza che in assenza di microtubuli.

Figura 1 Il più semplice ciclo fatturato ATP per una cinesina si compone di quattro possibili stati: (Φ) libero-nucleotide, ATP-bound, ADP.P _i -bound e ADP-legato Ognuno dei quattro transizioni è caratterizzato da un in avanti e. costante indietro rate (k _x e k _-x, rispettivamente).

Per capire come il ciclo chimica del fatturato ATP è accoppiata al ciclo meccanico dell'interazione microtubuli, si deve determinare la fase del ciclo fatturato ATP è limitante in assenza di microtubmoduli e quindi determinare come il ciclo è alterata dalla presenza di microtubuli. Il più semplice ciclo di fatturato ATP è costituito da quattro singole fasi chimici: (1) ATP legame al sito vuoto (Φ indica il sito vuoto, cioè, kinesin libero-nucleotide); (2) scissione ATP; (3) dissociazione fosfato e (4) ADP dissociazione (Figura 1). Il fattore limitante imposta la costante di velocità per l'intero ciclo di fatturato ATP. Pertanto, per determinare quale passo è fattore limitante ciascuna delle singole transizioni devono essere misurati e confrontati con la costante di velocità per il ciclo completo. Metodi per misurare il volume d'affari complessivo di ATP costante tasso di ciclo qui non descritti, ma si possono trovare in riferimento 7 Qui, descriviamo i metodi con cui costanti di velocità per i singoli passaggi chimici possono essere determinati. Ci sono un certo numero di metodi disponibili per studiare le singole transizioni nel ciclo di fatturato di una proteina nucleotide idrolizzante. I metodi qui presentati assumono advantage delle proprietà di nucleotidi marcati con il fluoroforo methylanthraniloyl, solitamente indicato come mant, che mostrano un cambiamento di intensità di fluorescenza dopo il legame alla proteina ^8. Il gruppo mant è usato perché la sua piccola dimensione significa che, quando accoppiato al ribosio (Figura 2A), si ha in genere poco o nessun effetto sulla cinetica di legame del nucleotide o idrolisi ^9-12. Qui, vi presentiamo i protocolli che descrivono l'uso di nucleotidi mant-marcato, in combinato disposto con stopped-flow fluorescenza, per consentire l'osservazione del legame nucleotide e dissociazione nel ciclo fatturato ATP di una cinesina.

Protocol

1 Determinazione della fluorescenza intensità Change su Binding di Mant-marcato Nucleotide.

1. Aggiungere 1 mM mant-nucleotide marcato a 1 mM cinesina (concentrazioni finali) in un tampone di reazione adeguato. In genere un buffer che beneficia della crescita dei microtubuli e la stabilità è utilizzato (vedi la discussione). Un buffer comunemente usato contiene 80mm piperazina-bis-2-ethanesulfonic acido (TUBI) pH6.9, 1mM _MgCl2 e 1mM glicole etilenico-bis-2-acido aminoether tetraacetico (EGTA).
   Nota: La concentrazione di chinesina indicato in tutti i protocolli si riferisce alla concentrazione di siti di legame del nucleotide (cioè, domini motore). Esistono diverse kinesins come monomeri, dimeri o tetrameri e così possono contenere più di un sito nucleotide-binding per molecola.
2. Dopo un periodo di incubazione (1-3 min) e utilizzando un fluorimetro standard, di rilevare lo spettro di emissione per il complesso-nucleotide chinesina mant-etichettati. Utilizzare lunghezza d'onda di eccitazione di 365nm emisura emessa luce 400-500 nm con incrementi di 1 nm.
3. Fare una soluzione di 1mM nucleotide Mant-marcato nello stesso tampone di reazione utilizzato nel passaggio 1.1.
4. Misurare lo spettro di emissione per il solo campione mant nucleotide, come precedentemente descritto (vedi punto 1.2).
5. Normalizza gli spettri di segnale alla lunghezza d'onda di picco dell'intensità di fluorescenza dello spettro di mant nucleotide in soluzione (cioè senza chinesina) dividendo per questo valore.
6. Tracciare lo spettro normalizzato (ad esempio, la Figura 2B) per osservare le differenze di intensità di fluorescenza tra il mantATP-bound e / o mantADP-bound cinesina e mant nucleotide in soluzione.

2 Misura delle costanti di associazione e dissociazione Prezzo della mantATP

1. Per una soluzione di fino a 20 mM cinesina (vedi discussione) in qualsiasi appropriata Mg ^{2 +} tampone -free (ad esempio, 80MM TUBI pH6.9, 1mM EGTA, 0,1% Tween20), aggiungere 1mM (concentrazione finale) etilendiamminotetraacetico (EDTA) e 1 mM (concentrazione finale) ditiotreitolo (DTT). Nota: L'aggiunta di Tween20 al buffer è raccomandato in quanto riduce / previene la perdita di proteine ​​cinesina sulla colonna utilizzato per lo scambio di buffer (Piazza di 2.3 e 3.3)
2. Incubare la soluzione a 25 ° C per 15 min.
3. Separata nucleotide libero e EDTA dalla cinesina utilizzando una colonna di filtrazione G-25 gel Sephadex flusso di gravità in base alle istruzioni del produttore (vedere l'elenco dei materiali).
   1. Equilibrare la colonna con almeno 3 volumi di colonna di un adeguato buffer di -free Mg ^{2 +} (vedere il punto 2.1). Caricare la soluzione-cinesina contenente nella colonna. Preparare una provetta di raccolta aggiungendo un volume appropriato di soluzione di cloruro di magnesio 100mM al tubo vuoto, tale che la concentrazione finale di cloruro di magnesio è 1 mM dopo il prelievo della soluzione chinesina. Aggiunta immediata di cloruro di magnesio aiuta StabiliSE il kinesin libero-nucleotide.
   2. Eluire la cinesina utilizzando un apposito tampone -free Mg ^{2 +.} Kinesine sono instabili quando liberi di nucleotide per cui è importante lavorare velocemente. Conservare il kinesin libero-nucleotide su ghiaccio e consumare entro 1-2 ore.
4. Durante o prima della preparazione di kinesin libero-nucleotide, preparare una serie concentrazione mantATP nello stesso tampone di reazione come la soluzione finale di kinesin libero-nucleotide. Determinare l'intervallo di concentrazioni di mantATP necessarie in funzione della concentrazione di cinesina disponibile con una serie tipica che varia 0,1-50 mM (vedere il punto 2.5 e discussione).
5. Preparare una serie concentrazione di kinesin libero-nucleotide. Per ogni concentrazione di mantATP (punto 2.4), una concentrazione di kinesin libero-nucleotide deve essere preparato in modo tale che il nucleotide mant-marcato è da 5 a 10 volte l'eccesso molare rispetto cinesina nucleotidiche siti di legame.
6. Impostare la lunghezza d'onda di eccitazione sul-flo fermatow fluorimetro a 365 nm e raccogliere emessa luce> 400 nm usando un filtro passa-lungo.
7. Partendo con la più bassa concentrazione di mantATP, mescolare il mantATP con una concentrazione adeguata di kinesin libero-nucleotide in un rapporto 1: 1 v / v utilizzando un fluorimetro stopped-flow (Figura 3A e 3B Inset). Nota: I reagenti sono diluiti del 50% al momento della miscelazione. Mantenere una nota della concentrazione nucleotide sia pre che post miscelazione (ad esempio, 3,0 / 1,5 micron) per evitare confusione.
8. Montare la variazione di intensità di fluorescenza misurata ad ogni concentrazione di mantATP ad una funzione esponenziale più una linea di costante pendenza negativa per spiegare photobleaching del gruppo Mant (cioè, Fluorescenza = A ₀ .exp (k .t _obs) + (m. t + c), dove A ₀ è l'ampiezza, _obs k è la costante di velocità e t è il tempo, vedi Figura 3B e discussione). Da questi attacchi determinare untasso costante (k _obs) ad ogni concentrazione di mantATP. Ogni _obs k è una convoluzione di una costante di associazione e di dissociazione frequenza (Figura 1, k ₁ ek _-1).
9. Deconvolve le associazione e dissociazione dei tassi costanti tracciando k _oss contro la concentrazione mantATP (ad esempio, Figura 3C). Montare questi dati ad una funzione lineare (cioè, k _obs = k ₁ [mantATP] + k _-1) per ottenere il gradiente e Y intercetta. Il gradiente rappresenta la costante di velocità di associazione mantATP (Figura 1, k ₁₎ con le unità M ^-1 s ^-1. L'intercetta rappresenta la costante di velocità di dissociazione (Figura 1, k _-1) con unità di s ^-1 (vedi la discussione). Nota: Questo approccio può essere applicato anche per determinare l'associazione ADP e dissociazionecostanti di velocità (Figura 1, k _-4 e ₄ k) utilizzando mantADP come il nucleotide.

3 Misura della dissociazione Costante per mantADP

1. Ad una soluzione di 2 mM kinesina in un tampone di reazione idoneo (ad esempio, TUBI 80 mm pH6.9, 1mM _MgCl2, 1mM EGTA, 0,1% Tween20), aggiungere 50 mM mantADP (concentrazione finale).
2. Incubare a 25 ^{° C} per 30 min.
3. Rimuovere l'eccesso mantADP e altro nucleotide libero da buffer di scambio la cinesina nel buffer di reazione prescelto utilizzando una colonna Sephadex G-25 (vedere elenco dei materiali) secondo le istruzioni del produttore. Il dominio motore cinesina dovrebbe ora essere caricato con mantADP.
4. Impostare la lunghezza d'onda di eccitazione sul fluorimetro stopped-flow a 365 nm e raccogliere emessa luce> 400 nm usando un filtro passa-lungo.
5. Mescolare il complesso mantADP.kinesin (~ 1μM) con un 50 volte o più molar eccesso di ATP non marcato in un rapporto 1: 1 v / v utilizzando un fluorimetro stopped-flow (Figura 4A e 4B Inset).
6. Montare la diminuzione di intensità di fluorescenza osservata nel tempo per una singola funzione esponenziale più una linea di costante pendenza negativa per spiegare photobleaching del gruppo Mant (cioè, Fluorescenza = A ₀ .exp (k .t _obs) + (m.t + c), dove A ₀ è l'ampiezza, _obs k è la costante di velocità e t è il tempo, vedere la Figura 4B e discussione). Il _obs k determinata da questa forma è la costante di velocità di dissociazione di ADP (figura 1, k ₄₎ con unità di s ^-1 (vedi la discussione).

Representative Results

Un aumento di intensità di fluorescenza del gruppo Mant è tipicamente osservato dopo legame del nucleotide Mant-marcato ad una cinesina. Tuttavia, l'entità di tale cambiamento del segnale dipende dalla particolare chinesina in questione. Pertanto, è utile effettuare misurazioni di equilibrio per confermare sia la presenza e l'entità di un cambiamento di intensità di fluorescenza prima di passare al test cinetici. Rappresentativa spettri di fluorescenza per mantATP e mantADP, sia in soluzione che in complesso con il chinesina-13, MCAK, sono mostrati in Figura 2B. Questi dati evidenziano l'aumento di intensità di fluorescenza visualizzata da entrambe mantATP e mantADP sul legame MCAK. Il cambiamento di intensità di fluorescenza in seguito al legame di Mant nucleotide ad una cinesina viene utilizzato per riferire sulla associazione e dissociazione sia di ATP e ADP (sezioni 2 e 3). Nel caso di MCAK, una differenza di intensità di fluorescenza è osservata tra mantATP.kinesin e mantADP.kinesin

Figura 3A illustra la reazione che si verifica su di miscelazione mantATP con kinesin libero-nucleotide. Dati rappresentativi che illustrano l'aumento di intensità di fluorescenza che si verifica dopo il legame del mantATP al kinesin-13, MCAK è mostrato in Figura 3B. I dati del tipo mostrato in Figura 3B è raccolto in un intervallo di concentrazioni mantATP. Una trama delle costanti di velocità (k _OB) determinato rispetto alla concentrazione mantATP è mostrato in Figura 3C. Montaggio questi dati ad una funzione lineare (cioè, k _obs = k ₁ [mantATP] + k _-1) permette di deconvoluzione delle costanti di velocità che contribuiscono a k _OB (punto 2.8). Pertanto, consentendo di determinare sia l'associazione e la costante di dissociazione per mantATP (Figura 1, k ₁ ek -1 rispettivamente).

Figura 4A illustra la reazione che si verifica al momento miscelazione mantADP.kinesin con un eccesso di ATP non marcato. I dati in figura 4B mostra la diminuzione dell'intensità di fluorescenza osservata per mantADP sulla dissociazione dal kinesin-13, MCAK. Inserendo questi dati a una funzione esponenziale (Passo 3.6) la costante di velocità di dissociazione di mantADP è determinata direttamente.

Figura 2. nucleotidi marcati con il methylanthraniloyl fluoroforo (Mant) vengono utilizzati per isolare le singole fasi del ciclo di fatturato ATP. (A) Struttura del mantATP che mostra la posizione del fluoroforo mant coniugato sia al 2 'o 3' posizione sul ribosio. (B) normalizzato spettri di fluorescenza per mantATP e mantADP in soluzione (maxp) e un mantATPd mantADP in complesso con la cinesina MCAK (MATP + MCAK e MADP + MCAK). Gli spettri mantATP sono normalizzati per la fluorescenza al massimo per mantATP in soluzione e spettri mantADP sono normalizzati a fluorescenza a _max per mantADP in soluzione. Gli spettri dei nucleotidi mant mescolati con MCAK sono raccolti in 1 min dopo la miscelazione. La concentrazione dei reagenti e delle impostazioni fluorimetro sono come descritto nel protocollo passi 1.1 e 1.2.

Figura 3 Misura della costante di velocità associazione di mantATP. (A) Schema raffigurante la reazione che avviene dopo miscelazione da stopped-flow: mantATP (MATP) si lega a-nucleotide libero cinesina. L'intensità di fluorescenza del gruppo Mant aumenti su legame alla proteina. (B) variazione del segnale di fluorescenza (nero) osservato dopo la miscelazione mantATP (25 M) con MCAK (5 M nulibero-cleotide,). Questo dato è in forma (rossa tratteggiata) per una singola funzione esponenziale più una linea di costante pendenza negativa, che rappresenta photobleaching del fluoroforo Mant (vedi discussione) Inserto:. Contenuto delle siringhe prima della miscelazione sul fluorimetro stopped-flow. (C) costanti di velocità (k _OB) stabiliti per la reazione di mantATP con MCAK libero-nucleotide rilevate in concentrazioni di mantATP. Questo terreno avrà una regione lineare con il gradiente è la costante di associazione (Figura 1, k ₁₎ con unità di M ^-1 s ^-1 e l'intercetta y è la costante di velocità di dissociazione (Figura 1, k _-1) con unità di s ^-1. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

. Figura 4 Misura della costante di velocità di dissociazione per mantADP (A) Schema raffigurante la reazione che avviene dopo miscelazione da stopped-flow: cinesina precaricato con mantADP viene diluito in un eccesso di ATP senza etichetta. Dissociare mantADP è sostituito dal senza etichetta ATP, impedendo così la reazione posteriore di associazione mantADP (vedi la discussione). L'intensità di fluorescenza del gruppo Mant scende sulla dissociazione dalla proteina. Diminuzione (B) fluorescenza osservata sulla dissociazione del mantADP dalla cinesina MCAK. Il segnale di fluorescenza (nero) è in forma (rossa tratteggiata) per un singolo esponenziale più una linea di costante pendenza negativa per spiegare photobleaching del gruppo Mant (vedi la discussione). La costante di velocità determinato è la costante di velocità di dissociazione di mantADP (figura 1, k₄₎ Nel riquadro:.. Contenuto delle siringhe prima della miscelazione su un fluorimetro stopped-flow Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

Qui, vi presentiamo i protocolli per l'osservazione e l'analisi della cinetica delle transizioni tra gli stati nucleotidiche per una cinesina. Questi protocolli utilizzano il metodo rapida miscelazione stopped-flow in combinazione con nucleotidi fluorescente. Metodi di questo tipo sono stati ampiamente utilizzati per studiare nucleotide vincolante e dissociazione per una varietà di kinesins ^9-11,13-16. I metodi descritti non consentono l'osservazione di rilascio fosfato (Figura 1, punto 3). Tuttavia, stopped-flow fluorescenza può essere utilizzata per osservare questa transizione utilizzando una proteina di rilevamento fosfato di accoppiare la produzione di fosfato ad una variazione di intensità di fluorescenza ^17. I metodi presentati uso nucleotidi marcati con il piccolo methylanthraniloyl fluoroforo (Mant), che in genere mostrano un aumento di intensità di fluorescenza quando si lega alle proteine. Inoltre, il fluoroforo mant, quando coniugato sia al 2 'o 3' la posizione sulla ribose, spesso ha poco o nessun effetto sulla vincolante, dissociazione o idrolisi del nucleotide ^9-12. Nucleotidi Mant-marcati sono facilmente reperibili da fonti commerciali (vedere l'elenco dei materiali) e sono forniti come miscele del 2 'e 3' coniugato quanto rapidamente riequilibrare quando purificato di un singolo isomero ^8. Nucleotidi Mant-marcato fare ottimi molecole giornalista con cui si possono osservare le cinetiche di legame del nucleotide e di dissociazione.

L'uso di nucleotidi fluorescente significa che la lettura dei saggi descritti è un cambiamento in tempo reale di intensità di fluorescenza. Ciò rende questi saggi ideale per stopped-flow fluorescenza, che permette una rapida miscelazione dei reagenti e l'osservazione in tempo reale delle variazioni di fluorescenza associate alla reazione successiva. La combinazione di stopped-flow come la tecnica di miscelazione e fluorescenza come metodo di rilevamento produce un sistema che è ef relativamente campioneficiente. Ad esempio, per acquisire i dati mostrati nella Figura 3C richiede 0,8-1,0 mg di purificato kinesin-13, MCAK, e di acquisire i dati mostrati nella Figura 4B richiede ~ 0,3 mg di purificato kinesin-13, MCAK. Uno svantaggio dell'uso di mant come fluoroforo è che è incline a photobleaching. Ciò può essere osservato in isolamento da chinesina cinetica di reazione miscelando una soluzione di mant nucleotide marcato con tampone di reazione, in assenza di chinesina, nel flusso fermato. Una lenta diminuzione di intensità di fluorescenza si osserva come il gruppo mant diventa sbiancato. Oltre la gamma di tempi utilizzati nei protocolli descritti photobleaching del gruppo Mant è ben descritto da una funzione lineare. Pertanto, un modo semplice per correggere i dati per fotoscolorimento è per adattarsi ad una funzione esponenziale con una linea di base descritto da una funzione lineare (cioè, m + c) anziché la linea di base piatta più comune, descritto da un singolo parametro.

vincolante mantATP

Quando si misura costanti di velocità di associazione e dissociazione di mantATP (Sezione 2) l'ADP, che rimane associato al sito nucleotide-binding kinesina in assenza di microtubuli, deve essere rimosso. Questo permette associazione mantATP e dissociazione (Figura 1, punto 1), da osservare in isolamento da dissociazione ADP. Per raggiungere questo obiettivo la chinesina è incubato con almeno un eccesso di 50 volte di EDTA su siti di legame del nucleotide (Passo 2.1). L'EDTA sequestra Mg ^{2 +} ioni causando Mg ^{2 +} a dissociarsi dalla tasca nucleotide-binding, che si traduce nel rilascio del nucleotide ^11. Pertanto, nello svolgimento passaggi 2,1-2,3, è indispensabile utilizzare un buffer libero di Mg ^{2 +.} La proteina kinesin libero-nucleotide è buffer di scambio per separarlo sia dal nucleotide libero e da EDTA. Per realizzare questa separazione, un usa e getta a caduta gecolonna l filtrazione è sufficiente ed è semplice e rapido da usare (vedere l'elenco dei materiali). L'interazione di mantATP con nucleotide cinesina libera viene effettuata in un intervallo di concentrazioni mantATP (Passo 2.4) per consentire deconvoluzione delle costanti di associazione e dissociazione dei tassi (punto 2.8). La teoria alla base di esperimenti di questo tipo è ben descritto nel riferimento 18 In esecuzione di questi esperimenti si comincia con la più bassa concentrazione di mantATP. Ciò elimina la necessità di fasi di lavaggio tra diverse concentrazioni. Probabilmente sarà necessario regolare la sensibilità del fluorimetro stopped-flow come concentrazione mantATP viene aumentata. La concentrazione mantATP deve essere sempre superiore di almeno 5 volte rispetto alla concentrazione di cinesina nucleotidiche siti di legame per mantenere condizioni di pseudo primo ordine. Tuttavia, poiché la concentrazione di mantATP viene aumentata, la variazione del segnale può diventare inondato come frazione di nucleotide che si lega a chinesina diminuisce. Therefore, la concentrazione della chinesina è anche aumentato per ogni nuova concentrazione di mantATP tale che la concentrazione di mantATP è mai superiore a 10 volte l'eccesso molare rispetto siti di legame del nucleotide (Passo 2.6).

mantADP Dissociazione

Sebbene associazione e dissociazione dei tassi costanti per mantADP possono essere determinati con lo stesso metodo descritto per mantATP (sezione 2). La dissociazione di ADP da una cinesina può essere osservata direttamente dal precarico del sito nucleotide-binding con mantADP (Passi 3,1-3,3) Il complesso mantADP.kinesin viene poi mescolato con un eccesso di ATP senza etichetta (punto 3.5). L'eccesso senza etichetta ATP impedisce la rilegatura del mantADP alla cinesina e quindi permette la reazione di dissociazione (Figura 1, k ₄₎ da osservare in isolamento da un'associazione di mantADP. In questo test la concentrazione di ATP non marcato deve essere almeno un eccesso molare di 50 volte di NUCleotide siti di legame. La teoria alla base di questo saggio è ben descritta in riferimento 18. Questo metodo diretto fornisce un valore più preciso per il tasso costante di dissociazione rispetto alla estrapolazione per l'asse y descritto al punto 2.8.

Inclusione di microtubuli

I metodi descritti possono essere utilizzati per determinare la cinetica di legame nucleotidico e dissociazione in presenza di microtubuli. I microtubuli vengono introdotti alla siringa nucleotide contenente prima della miscela nel flusso fermato: la siringa inferiore nella Figura 3B e 4B (Inserti). In questa configurazione, la chinesina incontrerà il nucleotide allo stesso tempo se corrisponde ai microtubuli. Microtubuli stabilizzati sono utilizzati, in cui la durata del polimero tubulina viene esteso mediante l'uso di una sostanza chimica o stabilizzante, come taxolo, o un analogo GTP nonhydrolysable, come guanosina-5 '- [(α, β) -methyleno] trifosfato (GMPCPP, vedere l'elenco dei materiali). E 'possibile utilizzare due cicli di polimerizzazione della tubulina con GMPCPP fare microtubuli che possono essere conservati per molti mesi a ^9,19 azoto liquido. L'uso di microtubuli pre-preparati riduce in modo significativo le difficoltà pratiche di esecuzione di tali test. Per includere microtubuli nei saggi, è importante utilizzare un tampone di reazione adatta per la stabilità dei microtubuli. Il buffer di scelta è TUBI based, con il buffer più comunemente usato contenente 80 mM pH 6.9 TUBI, 1 MgCl ₂ e 1 EGTA mm mm (noto come BRB80) ^20,21.

I metodi descritti non sono limitati da utilizzare con kinesins, ma possono essere adattati e applicati a qualsiasi proteina di legame nucleotide. Ad esempio, i metodi simili sono stati applicati al ciclo fatturato ATP dei membri della famiglia miosina di motori molecolari ^12,22 e l'uso di mant etichettato nucleotidi guanosina estende ulteriormenteMetodi di questo tipo di idrolizzare proteine ​​GTP ^23,24.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2’/3’-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5’triphosphate	Jena Biosciences	# NU-202	mantATP
2’/3’-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5’-diphosphate	Jena Biosciences	# NU-201	mantADP
Mg-ATP	Roche	# 10519979001	The disodium salt of ATP is made to a concentration of 100 mM in 100 mM MgCl2. Concentration should be verified by absorption at 260 nm (e = 15,400 M-1cm-1). Solution stored in aliquots at -20 oC.
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Fisher Scientific	BP120-500	0.5 M stock solution in water, pH 8.0. HAZARD: powder harmful if inhaled.
Dithiothreitol (DTT)	Melford	MB1015	1 M stock solution in water made fresh for use on the same day. HAZARD: powder harmful if inhaled or in contact with the skin.
NAP-5 column	GE Healthcare	# 17-0853	G-25 sephadex resin gravity-flow gel filtration column
GMPCPP	Jena Biosciences	# NU-405	nonhydrolysable analogue of GTP
Stopped-flow fluorimeter	Applied Photophysics	SX20	A fluorimeter with some plumbing attached, which allows reagents to be rapidly mixed in the observation cuvette. Thereby allowing the kinetics of reactions on timescales of ~0.1 - 100 sec to be monitored.