Summary
Kinesins מתאפיין באינטראקצית נוקלאוטיד תלוי עם microtubules: מחזור של מחזור ATP מצמידים את מעגל האינטראקציה microtubule. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים לנתח את קינטיקה של מעברי נוקלאוטיד בודדים במחזור מחזור ATP של kinesin באמצעות נוקלאוטידים שכותרתו fluorescently והפסיקה זרימת הקרינה.
Abstract
Superfamily kinesin של חלבוני מנוע microtubule הקשורים לשתף תחום מוטורי אופייני ששני hydrolyses ATP ונקשר microtubules. Kinesins להציג הבדלים לאורך superfamily הן במחזור ATP ובאינטראקצית microtubule. הבדלים אלה להתאים kinesins הספציפי לפונקציות שונות, כגון הובלת מטענים, microtubule הזזה, depolymerization microtubule וייצוב microtubule. כדי להבין את מנגנון פעולה של kinesin זה חשוב להבין איך המחזור הכימי של מחזור ATP הוא מצמידים את המחזור המכני של האינטראקציה microtubule. לנתח את מחזור מחזור ATP, גישה אחת היא לנצל נוקלאוטידים שכותרתו fluorescently לדמיין צעדים בודדים במחזור. קביעת קינטיקה של כל מעבר נוקלאוטיד במחזור מחזור ATP מאפשרת צעד שער הגבלה או צעדים למחזור השלם להיות מזוהה. לkinesin, חשוב לדעת את צעד שער הגבלה, בהיעדר microtubules, כצעד זה הנו בדרך כלל מואץ פי כמה וכמה אלף כאשר kinesin אינטראקציה עם microtubules. המחזור בהעדר microtubules השוואה אז לזה בנוכחותו של microtubules להבין מחזור המחזור של kinesin ATP באופן מלא. קינטיקה של מעברי נוקלאוטיד הבודדים היא בדרך כלל מהר מדי להתבונן על ידי ערבוב ידני מגיבים, במיוחד בנוכחות microtubules. מכשיר ערבוב מהיר, כגון הפסיקה זרימת fluorimeter, המאפשר קינטיקה להיות שנצפתה על לוחות זמנים של קטן כמו כמה אלפיות שנייה, ניתן להשתמש בו כדי לפקח על מעברים כאלה. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים שבערבוב מהיר של חומרים כימיים על ידי הפסיקה זרימה משמש יחד עם נוקלאוטידים שכותרתו fluorescently לנתח את מחזור מחזור ATP של kinesin.
Introduction
Kinesins הוא superfamily של חלבונים מאופיינים בתחום מוטורי שמור ביותר 1. תחום המוטורי kinesin אינטראקציה עם microtubules באופן נוקלאוטיד תלוי. בני משפחת kinesin להציג מגוון רחב של פונקציות מkinesins translocating, אשר נושא מטען באופן מכוון לאורך microtubules, לkinesins מחייב סוף microtubule translocating שאינו, המסדיר דינמיקת microtubule 2,3.
Kinesins להשתמש המחזור-5'-טריפוספט adensosine (ATP) כדי לווסת את האינטראקציה שלהם עם microtubule שלד תא 4-6. קונפורמציה של תחום המוטורי kinesin ולכן הזיקה שלה לmicrotubule תלויה במצבו נוקלאוטיד: ATP, יכול להיות מחויב ADP, ADP.Pi או לא נוקלאוטיד (איור 1). כדי להבין את המנגנון המולקולרי של kinesin, נדרשת הבנה של הקשר בין מחזור ATP והאינטראקציה microtubule.refore, מטרה העיקרית בתחום kinesin היא לאפיין את התכונות פונקציונליות של מדינות נוקלאוטיד שונות וקינטיקה של המעברים ביניהם הן בנוכחות והיעדרות של microtubules.
איור 1 מחזור מחזור ATP הפשוט ביותר לkinesin מורכב מארבעה מצבים אפשריים: (Φ) ללא נוקלאוטיד, ATP-מחויב, ADP.P אני -bound וכרוך-ADP כל אחד מארבעת המעברים מאופיין בקדימה ו. קבוע לאחור שיעור (x k וk -x בהתאמה).
כדי להבין כיצד המחזור הכימי של מחזור ATP הוא מצמידים את המחזור המכני של האינטראקציה microtubule, יש לקבוע שצעד במחזור מחזור ATP הוא שיעור הגבלה בהעדר microtubules ולאחר מכן לקבוע כיצד המחזור משתנה על ידי הנוכחות של microtubules. מחזור מחזור ATP הפשוט ביותר מורכב מארבעת שלבי כימיקלים פרט: (1) ATP מחייב את האתר הריק (Φ מציין את האתר הריק, כלומר kinesin ללא נוקלאוטיד,); מחשוף ATP (2); ניתוק פוספט ו( 4) ניתוק ADP (איור 1) (3). צעד שער הגבלה קובע את השיעור קבוע למחזור מחזור ATP המלא. לכן, כדי לקבוע איזה צעד הוא שיעור הגבלה בכל שינויי הפרט חייב להימדד ובהשוואה לשיעור קבוע למחזור השלם. שיטות למדידה מתמדת שיעור מחזור הכולל מחזור ATP אינם מתוארות כאן, אבל ניתן למצוא בהתייחסות .7 כאן אנו מתארים שיטות שבה ניתן לקבוע קבועי קצב לצעדים כימיים בודדים. ישנן מספר השיטות זמינות ללמוד מעברים בודדים במחזור מחזור של חלבון hydrolyzing נוקלאוטיד. השיטות שהוצגו כאן לקחת advantagדואר של המאפיינים של נוקלאוטידים שכותרתו עם methylanthraniloyl fluorophore, בדרך כלל מכונה mant, המציג שינוי בעוצמת הקרינה על קישור לחלבון 8. קבוצת mant משמשת כי גודלו הקטן אומר ש, כאשר מצמידים לריבוז (איור 2 א), שהוא בדרך כלל יש השפעה מועטת, אם בכלל, על קינטיקה של נוקלאוטיד מחייב או הידרוליזה 9-12. כאן, אנו מציגים פרוטוקולים המתארים את השימוש של נוקלאוטידים שכותרת mant, בשיתוף עם הפסיקה זרימת הקרינה, כדי לאפשר תצפית של נוקלאוטיד מחייב וניתוק במחזור מחזור ATP של kinesin.
Protocol
.1 קביעת שינוי עוצמת הקרינה על הכריכה של נוקלאוטיד שכותרת Mant.
- הוספת נוקלאוטיד שכותרת mant 1 מיקרומטר לkinesin 1 מיקרומטר (ריכוזים סופיים) במאגר תגובה מתאים. בדרך כלל חיץ שיועיל לצמיחת microtubule ויציבות משמש (ראה דיון). חיץ נפוץ מכיל pH6.9 piperazine-BIS-2-ethanesulfonic 80mm חומצה (צינורות), 1 המ"מ MgCl 2 ואתילן גליקול 1 המ"מ-BIS-2 חומצת aminoether-tetraacetic (EGTA).
הערה: הריכוז של kinesin האמור בכל הפרוטוקולים מתייחס לריכוז של אתרי נוקלאוטיד מחייב (כלומר, תחומים מוטוריים). kinesins שונה להתקיים כמונומרים, הדימרים או tetramers וכך יכול להכיל אתר מחייב נוקלאוטיד יותר מאחד לכל מולקולה. - לאחר תקופת דגירה (1-3 דק ') ושימוש בfluorimeter סטנדרטי, למדוד את ספקטרום הפליטה למורכב kinesin-נוקלאוטיד שכותרת mant. השתמש בגל עירור של 365nm ומדד נפלט אור 400-500 ננומטר במרווחי 1nm.
- בצע פתרון של 1 המ"מ נוקלאוטיד שכותרת mant באותו מאגר התגובה המשמש בשלב 1.1.
- מדוד את ספקטרום הפליטה למדגם רק נוקלאוטיד mant, כפי שתואר לעיל (ראה שלב 1.2).
- לנרמל את הספקטרום לאות באורך הגל של עוצמת הקרינה שיא של הספקטרום של נוקלאוטיד mant בפתרון (כלומר, ללא kinesin) על ידי החלוקה דרך על ידי ערך זה.
- העלילה הספקטרום המנורמל (למשל, איור 2) להתבונן הבדלי עוצמת הקרינה בין נכנסים mantATP ו / או נוקלאוטיד kinesin וmant קשור-mantADP בפתרון.
2 מדידה של קבועי האגודה ודיסוציאציה המחיר לmantATP
- לפתרון של עד 20 kinesin מיקרומטר (ראה דיון) בכל Mg מתאים 2 + חיץ -חינם (למשל, 80mm צינורות pH6.9, 1mm EGTA, 0.1% Tween20), להוסיף 1dithiothreitol מ"מ חומצה (סופית ריכוז) ethylenediaminetetraacetic (EDTA) ו1 מ"מ (ריכוז סופי) (DTT). שים לב: תוספת של Tween20 למאגר מומלצת שכן הוא מפחית / מונע אובדן חלבון kinesin של בעמודה המשמשת לחילופי חיץ (צעדים 2.3 ו3.3)
- דגירה הפתרון 25 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
- נוקלאוטיד נפרד חופשי וEDTA מkinesin באמצעות טור סינון G-25 ג'ל Sephadex זרימה הכבידה על פי הוראות יצרן (ראה רשימה של חומרים).
- לאזן את הטור עם לפחות 3 כרכי טור של חיץ -חינם מתאים Mg 2 + (ראה שלב 2.1). טען את הפתרון המכיל kinesin על הטור. הכן צינור איסוף על ידי הוספת נפח מתאים של פתרון מגנזיום כלוריד 100mm לצינור הריק, כך שהריכוז הסופי של מגנזיום כלוריד הוא 1 מ"מ לאחר איסוף פתרון kinesin. תוספת מיידית של מגנזיום כלוריד עוזרת stabilise kinesin ללא נוקלאוטיד.
- Elute kinesin באמצעות חיץ -חינם מתאים Mg 2 +. Kinesins אינם יציבים, כאשר ללא נוקלאוטיד ולכן חשוב לעבוד במהירות. אחסן את kinesin ללא נוקלאוטיד על קרח ולהשתמש תוך 1-2 שעות.
- במהלך או לפני הכנת kinesin ללא נוקלאוטיד, להכין סדרת ריכוז mantATP באותו מאגר התגובה כפתרון הסופי של kinesin ללא נוקלאוטיד. לקבוע את טווח ריכוזים של mantATP הנדרשים על פי הריכוז זמין של kinesin עם סדרה טיפוסית נעה 0.1-50 מיקרומטר (ראה שלב 2.5 ודיון).
- הכן סדרת ריכוז kinesin ללא נוקלאוטיד. עבור כל ריכוז של mantATP (שלב 2.4), ריכוז של kinesin ללא נוקליאוטידים צריך להיות מוכן באופן שנוקלאוטיד שכותרת mant הוא ב 5 לעודף טוחנת 10 מתקפל מעל אתרי קישור נוקלאוטיד kinesin.
- קבע את אורך גל העירור על הפסיקה-פלוw fluorimeter ל365 ננומטר ולאסוף נפלט אור ב> 400 ננומטר באמצעות מסנן ארוך לעבור.
- החל מהריכוז הנמוך ביותר של mantATP, לערבב mantATP עם ריכוז מתאים של kinesin ללא נוקלאוטיד ב1: 1 יחס V / V באמצעות הפסיקה זרימת fluorimeter (איור 3 א ו 3 ב הבלעה). הערה: המגיבים הם בדילול על ידי 50% על ערבוב. שמור לעצמך את ריכוז נוקלאוטיד שני ערבוב לפני ואחרי (כלומר, 3.0 / 1.5 מיקרומטר) כדי למנוע בלבול.
- התאם את השינוי בעוצמת הקרינה שנמדדה בכל ריכוז של mantATP לפונקציה מעריכית בתוספת שורה של שיפוע שלילי מתמיד כדי להסביר photobleaching של קבוצת mant (כלומר, הקרינה = .exp 0 (k .t תצפיות) + (מ '. t + ג), שבו 0 הוא משרעת, תצפיות k היא קבועות קצב וt הוא זמן, ראה איור 3 ב ודיון). מהתקפים אלה לקבועלדרג (תצפיות k) קבועות בכל ריכוז של mantATP. כל תצפיות k היא פיתול של מתמיד עמותה ודיסוציאציה שיעור (איור 1, k 1 ו k -1).
- Deconvolve קבועי עמותה ושיעור ניתוק על ידי התוויית תצפיות k נגד ריכוז mantATP (למשל, איור 3 ג). להתאים את הנתונים הללו לפונקציה לינארית (כלומר, תצפיות k = k 1 k [mantATP] + -1) כדי להשיג את יירוט השיפוע וציר y. השיפוע מייצג את השיעור קבוע לעמותת mantATP (איור 1, k 1) עם היחידות M -1 s -1. ליירט מייצג את השיעור קבוע דיסוציאציה (איור 1, k -1) עם יחידות של s -1 (ראה דיון). הערה: גישה זו יכולה להיות מיושמת גם לקבוע את קשר ADP ודיסוציאציהקבועי קצב (איור 1, k -4 וk 4) באמצעות mantADP כנוקלאוטיד.
3 מדידה של קצב דיסוציאציה קבוע לmantADP
- לפתרון של 2 kinesin מיקרומטר במאגר תגובה מתאים (לדוגמא, 80 צינורות מ"מ pH6.9, 1mm MgCl 2, 1mm EGTA, 0.1% Tween20), להוסיף 50 מיקרומטר mantADP (ריכוז סופי).
- לדגור על 25 C o ל30 דקות.
- הסר mantADP עודף ונוקלאוטיד האחר בחינם על ידי חיץ החלפת kinesin למאגר התגובה נבחר באמצעות טור Sephadex G-25 (ראה רשימה של חומרים) על פי הוראות יצרן. תחום המוטורי kinesin צריך עכשיו להיות טעון עם mantADP.
- קבע את אורך גל העירור על הפסיקה זרימת fluorimeter ל365 ננומטר ולאסוף נפלט אור ב> 400 ננומטר באמצעות מסנן ארוך לעבור.
- מערבבים את מורכב mantADP.kinesin (~ 1μM) עם פי 50 או מולה גדולה יותרעודף r של ATP ללא תווית ב1: 1 יחס V / V באמצעות הפסיקה זרימת fluorimeter (איור 4 א ו -4 הבלעה).
- התאם את הירידה בעוצמת הקרינה שנצפתה על פני זמן לפונקציה מעריכית יחידה בתוספת שורה של שיפוע שלילי מתמיד כדי להסביר photobleaching של קבוצת mant (כלומר, הקרינה = .exp 0 (k .t תצפיות) + (m.t + ג), שבו 0 הוא משרעת, תצפיות k היא קבועות קצב וt הוא זמן, ראה איור 4 ב ודיון). תצפיות k נקבעו מכושר זה היא שיעור קבוע לניתוק של ADP (איור 1, k 4) עם יחידות של s -1 (ראה דיון).
Representative Results
עלייה בעוצמת הקרינה של קבוצת mant הוא ציין בדרך כלל על הכריכה של נוקלאוטיד שכותרת mant לkinesin. עם זאת, סדר הגודל של שינוי אות כזה תלוי בkinesin המסוים בשאלה. לכן, כדאי לבצע מדידות שיווי משקל כדי לאשר את שני הנוכחות ועצמה של שינוי עוצמת הקרינה לפני שממשיך למבחנים קינטית. ספקטרום הקרינה נציג לmantATP וmantADP, שניהם בפתרון ובמורכב עם kinesin-13, MCAK, מוצג באיור 2. נתונים אלה מדגישים את עליית עוצמת הקרינה המוצגת על ידי שני mantATP וmantADP על הכריכה לMCAK. השינוי בעוצמת הקרינה על הכריכה של נוקלאוטיד mant לkinesin משמש לדיווח על הקשר והניתוק של שני ATP וADP (סעיפים 2 ו -3). במקרה של MCAK, הבדל עוצמת הקרינה הוא ציין בין mantATP.kinesin וmantADP.kinesin איור 3 א מציג את התגובה המתרחשת על ערבוב mantATP עם kinesin ללא נוקלאוטיד. נציגי נתונים הממחישים את העלייה בעוצמת הקרינה המתרחשת על הכריכה של mantATP לkinesin-13, MCAK מוצג באיור 3 ב. נתונים מהסוג שמוצג באיור 3 ב נאספים בטווח של ריכוזי mantATP. עלילה של קבועי קצב (תצפיות יא) נקבעו לעומת ריכוז mantATP מוצגת באיור 3 ג. התאמת נתונים אלה לפונקציה לינארית (כלומר, תצפיות k = k 1 [mantATP] + K -1) מאפשר deconvolution של קבועי קצב שתורמים לk תצפיות (שלב 2.8). לכן, k 1 ו k מאפשר הקביעה של שתי העמותה והשיעור קבוע דיסוציאציה לmantATP (איור 1, איור 4 א מתאר את התגובה המתרחשת על ערבוב mantADP.kinesin עם עודף של ATP ללא תווית. הנתונים באיור 4 מראה את ירידת עוצמת הקרינה נצפתה עבור mantADP על ניתוק מkinesin-13, MCAK. על ידי התאמת נתונים לפונקציה מעריכית (שלב 3.6) שיעור הקבוע לניתוק של mantADP נקבע ישירות. gether.within-page = "תמיד"> 
נוקלאוטידים איור 2 שכותרתו עם methylanthraniloyl fluorophore (mant) משמשים כדי לבודד את הפעולות בודדות במחזור מחזור ATP. מבנה (A) של mantATP מראה את המיקום של fluorophore mant מצומדת לאו 2 'או 3' עמדה בריבוז. ספקטרום הקרינה מנורמל לmantATP וmantADP בפתרון (mAXP) (ב) וmantATPד mantADP בקומפלקס עם kinesin MCAK (mATP + MCAK וmADP + MCAK). ספקטרום mantATP הם מנורמלים לקרינה על המקסימום לmantATP בפתרון ואת ספקטרום mantADP הם מנורמלים לקרינה על המקסימום לmantADP בפתרון. הספקטרום של נוקלאוטידים mant מעורבבים עם MCAK נאספים בהודעת ערבוב 1 דקות. הריכוז של חומרים כימיים והגדרות fluorimeter כמתואר בפרוטוקול הצעדים 1.1 ו1.2. 
מדידת .3 איור של קבוע קצב עמותה של mantATP. (א) סכמטי המתאר את התגובה שלוקחת הודעה מקום ערבוב על ידי הפסיקה זרימה: mantATP (mATP) נקשר לחינם נוקלאוטיד-kinesin. עוצמת הקרינה של עליות קבוצת mant על כריכה לחלבון. (ב) שינוי אות הקרינה (השחורה) שנצפתה על ערבוב mantATP (ז 25) עם MCAK (נו 5 M -Cleotide חופשי,). הנתונים אלה הוא בכושר (אדום המקווקו) לפונקציה אחת מעריכי בתוספת שורה של שיפוע שלילי קבוע, המהווה photobleaching של fluorophore mant (ראה דיון) הבלעה:. תוכן של המזרקים לפני הערבוב על הפסיקה זרימת fluorimeter. קבועים (C) שיעור (תצפיות k) שנקבעו לתגובה של mantATP עם MCAK ללא נוקלאוטיד זממו נגד ריכוז של mantATP. עלילה זו תהיה אזור ליניארי עם השיפוע להיות קבוע שיעור עמותה (איור 1, k 1) עם יחידות של M -1 s -1 וy ליירט להיות קבוע שיעור דיסוציאציה (איור 1, k -1) עם יחידות של s -1. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. 
. איור 4 מדידה של קבוע קצב דיסוציאציה לmantADP () סכמטי המתאר את התגובה שלוקחת הודעה מקום ערבוב על ידי הפסיקה זרימה: kinesin מראש עם mantADP מדולל לעודף של ATP ללא תווית. mantADP מתנער הוא הוחלף על ידי ATP ללא תווית, ובכך למנוע את תגובתו האחורית של עמותת mantADP (ראה דיון). עוצמת הקרינה של קבוצת mant יורדת על ניתוק מהחלבון. ירידת פלואורסצנטי (B) שנצפתה על הניתוק של mantADP מkinesin MCAK. אות הקרינה (השחורה) היא בכושר (אדום המקווקו) לאחד מעריכי בתוספת שורה של שיפוע שלילי מתמיד כדי להסביר photobleaching של קבוצת mant (ראה דיון). קבוע השיעור שנקבע הוא שיעור קבוע לניתוק של mantADP (איור 1, k4) הבלעה:.. תוכן של המזרקים לפני הערבוב על הפסיקה זרימת fluorimeter אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Discussion
כאן, אנו מציגים פרוטוקולים להתבוננות וניתוח של קינטיקה של מעברים בין מדינות נוקלאוטיד לkinesin. פרוטוקולים אלה לנצל את שיטת ערבוב הפסיקה זרימה המהירה בשילוב עם נוקלאוטידים שכותרתו fluorescently. שיטות מסוג זה נעשו שימוש נרחב ללמוד נוקלאוטיד מחייב וניתוק עבור מגוון רחב של kinesins 9-11,13-16. השיטות שתוארו אינו מאפשר תצפית של שחרור פוספט (איור 1, שלב 3). עם זאת, הפסיקה זרימת הקרינה יכולה לשמש כדי לבחון את המעבר הזה על ידי שימוש בחלבון חישת פוספט לזוג הייצור של פוספט לשינוי עוצמת הקרינה 17. השיטות שהוצגו נוקלאוטידים שימוש שכותרתו עם methylanthraniloyl הקטן fluorophore (mant), אשר בדרך כלל מציגים עלייה בעוצמת הקרינה כאשר חייב חלבון. יתר על כן, fluorophore mant, כאשר מצומדת לאו 2 'או 3' העמדה בribose, לעתים קרובות יש השפעה מועטת, אם בכלל, על הכריכה, הניתוק או הידרוליזה של נוקלאוטיד 9-12. נוקלאוטידים שכותרת Mant זמינים ממקורות מסחריים (ראה רשימה של חומרים) וניתנים כתערובות של 2 'ו 3' המצומד כפי שהם מחדש במהירות לאזן כאשר מטוהרים להאיזומר יחיד 8. נוקלאוטידים שכותרת Mant להפוך מולקולות כתב מצוינות שבאמצעותו ניתן לצפות קינטיקה של נוקלאוטיד מחייב וניתוק.
השימוש בנוקלאוטידים שכותרתו fluorescently אומר שקרא מתוך מבחני שתוארו הוא שינוי בזמן אמת בעוצמת הקרינה. זה עושה את מבחני הללו אידיאליים לפסיקת זרימת הקרינה, המאפשרת ערבוב מהיר של חומרים כימיים ותצפית בזמן אמת של שינויים בקרינה קשורים בתגובה שלאחר מכן. השילוב של הפסיקה זרימה כטכניקת ערבוב והקרינה כשיטה לגילוי מייצר מערכת שהיא EF מדגם יחסית ficient. לדוגמה, כדי לרכוש את הנתונים שמוצגים באיור 3 ג דורש .8-1.0 מ"ג של kinesin-13 המטוהר, MCAK, ולרכוש את הנתונים שמוצגים באיור 4 דורש ~ 0.3 מ"ג של kinesin-13 המטוהר, MCAK. חסרון אחד של השימוש בmant כfluorophore הוא שהוא נוטה photobleaching. זה יכול להיות שנצפה בבידוד מkinesin קינטיקה תגובה על ידי ערבוב תמיסה של נוקלאוטיד שכותרת mant עם חיץ תגובה, בהעדר kinesin, בפסיקת הזרימה. ירידה איטית בעוצמת הקרינה הוא ציין כקבוצת mant הופכת מולבנת. על פני הטווח של לוחות זמנים בשימוש בפרוטוקולים המתוארים photobleaching של קבוצת mant מתוארת היטב על ידי פונקציה לינארית. לכן, דרך פשוטה לתקן את הנתונים עבור photobleaching היא כדי להתאים לפונקציה מעריכית עם בסיס שתואר על ידי פונקציה לינארית (כלומר, הר + ג) ולא בנקודת ההתחלה שטוחה נפוצה יותר, שתואר על ידי פרמטר אחד.
התחת = "jove_content"> mantATP מחייב
כאשר מודדים קבועי קצב לעמותה וניתוק של mantATP (סעיף 2) ADP, אשר נשאר קשור עם האתר מחייב נוקלאוטיד kinesin בהעדר microtubules, יש להסיר. זה מאפשר לי עמותת mantATP וניתוק (איור 1, שלב 1) כדי לצפות בבידוד מניתוק ADP. כדי להשיג זאת kinesin הוא מודגרות עם לפחות עודף של פי 50 של EDTA על אתרי קישור נוקלאוטיד (שלב 2.1). EDTA sequesters יוני Mg 2 + גורמים Mg 2 + לנתק מהכיס מחייב נוקלאוטיד, וכתוצאה מכך שחרורו של נוקלאוטיד 11. לכן, בעת ביצוע צעדים 2.1-2.3, הוא חיוני, להשתמש במאגר חופשי של Mg 2 +. חלבון kinesin ללא נוקלאוטיד הוא חיץ החליף להפריד אותו משני נוקליאוטידים חופשיים ומEDTA. כדי להשיג את ההפרדה הזאת, הכבידה זרימה חד פעמית geטור סינון l מספיק והוא פשוט ומהיר לשימוש (ראה רשימה של חומרים). האינטראקציה של mantATP עם kinesin החופשי נוקלאוטיד מתבצעת בטווח של ריכוזי mantATP (שלב 2.4) כדי לאפשר deconvolution של קבועי קצב העמותה ודיסוציאציה (שלב 2.8). התאוריה מאחורי ניסויים מסוג זה מתואר היטב בהתייחסות 18. בביצוע ניסויים אלה אחד מתחיל בריכוז הנמוך ביותר של mantATP. זה מסיר את הצורך בצעדים לשטוף בין ריכוזים שונים. סביר להניח שזה יהיה צורך להתאים את הרגישות של הפסיקה זרימת fluorimeter כריכוז mantATP הוא גדל. ריכוז mantATP חייב תמיד להיות בעודף לפחות פי 5 יותר מהריכוז של אתרי קישור נוקלאוטיד kinesin לשמור על תנאים מסדר הראשונים פסאודו. עם זאת, כריכוז של mantATP הוא גדל, שינוי האות יכול להפוך מוצף כחלק של נוקלאוטיד שנקשר לkinesin ירידות. Therefoמחדש, הריכוז של kinesin הוא גדל גם עבור כל ריכוז חדש של mantATP כך שהריכוז של mantATP הוא לא גדול יותר מעודף טוחנת פי 10 על אתרי קישור נוקלאוטיד (שלב 2.6).
mantADP דיסוציאציה
למרות קבועי עמותה ושיעור הניתוק לmantADP ניתן לקבוע באותה השיטה שתוארה לmantATP (סעיף 2). ניתוק של ADP מkinesin ניתן לצפות ישירות על ידי טעינה מוקדמת אתר נוקלאוטיד מחייב עם mantADP (צעדים 3.1-3.3) המורכב mantADP.kinesin הוא מעורב אז עם עודף של ATP ללא תווית (שלב 3.5). ATP ללא התווית העודפת מונע rebinding של mantADP לkinesin ובכך מאפשר תגובת דיסוציאציה (איור 1, k 4) כדי לצפות במנותק מקשר של mantADP. ב assay זה הריכוז של ATP ללא תווית חייב להיות לפחות עודף טוחנת פי 50 של nucleotide אתרי קישור. התאוריה מאחורי assay זה מתואר היטב בהתייחסות 18. שיטה ישירה זה נותנת ערך מדויק יותר לשיעור הניתוק הקבוע מאשר אקסטרפולציה לציר y שתואר בשלב 2.8.
הכללת microtubules
גם השיטות שתוארו ניתן להשתמש כדי לקבוע את קינטיקה של נוקלאוטיד מחייב וניתוק בנוכחות microtubules. Microtubules מתוודע למזרק המכיל נוקליאוטידים לפני הערבוב בפסיקת הזרימה: המזרק התחתון באיור 3 ו -4 (ריבועים). בתצורה זו, kinesin יפגוש נוקלאוטיד באותו הזמן כפי שהוא פוגש את microtubules. microtubules התייצב משמש, שבו חייו של פולימר טובולין הוארך על ידי השימוש בשני כימי ייצוב, כגון טקסול, או אנלוגי GTP nonhydrolysable, כגון guanosine-5 '- [(α, β) -methyleno] אדנוזין (GMPCPP, ראה רשימה של חומרים). ניתן להשתמש בשני מחזורים של פילמור טובולין עם GMPCPP לעשות microtubules שיכול להיות מאוחסן במשך חודשים רבים ב9,19 חנקן נוזליים. השימוש בmicrotubules מוכן מראש מקטין באופן משמעותי את הקשיים המעשיים בביצוע מבחני אלה. כדי לכלול microtubules במבחנים, זה חשוב להשתמש במאגר תגובה מתאים ליציבות microtubule. החיץ של בחירה הוא צינורות מבוססים, עם החיץ הנפוץ ביותר המכיל 80 pH מ"מ צינורות 6.9, 1 מ"מ MgCl 2 ו 1 מ"מ EGTA (המכונה BRB80) 20,21.
השיטות שתוארו אינן מוגבלות לשימוש עם kinesins, אך יכולות להיות מותאמת ומיושמות על כל חלבון מחייב נוקלאוטיד. לדוגמא, בשיטות דומות הוחלו על מחזור מחזור ATP של בני משפחת שרירן של מנועים מולקולריים 12,22 והשימוש בנוקליאוטידים guanosine mant שכותרתו משתרע נוסףשיטות מסוג זה לGTP hydrolyzing חלבונים 23,24.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי ביוטכנולוגיה ומחקר מדעי הביולוגיה המועצה (BBSRC), החברה המלכותית ואוניברסיטת נוטינגהם.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2’/3’-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5’triphosphate | Jena Biosciences | # NU-202 | mantATP |
| 2’/3’-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5’-diphosphate | Jena Biosciences | # NU-201 | mantADP |
| Mg-ATP | Roche | # 10519979001 | The disodium salt of ATP is made to a concentration of 100 mM in 100 mM MgCl2. Concentration should be verified by absorption at 260 nm (e = 15,400 M-1cm-1). Solution stored in aliquots at -20 oC. |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP120-500 | 0.5 M stock solution in water, pH 8.0. HAZARD: powder harmful if inhaled. |
| Dithiothreitol (DTT) | Melford | MB1015 | 1 M stock solution in water made fresh for use on the same day. HAZARD: powder harmful if inhaled or in contact with the skin. |
| NAP-5 column | GE Healthcare | # 17-0853 | G-25 sephadex resin gravity-flow gel filtration column |
| GMPCPP | Jena Biosciences | # NU-405 | nonhydrolysable analogue of GTP |
| Stopped-flow fluorimeter | Applied Photophysics | SX20 | A fluorimeter with some plumbing attached, which allows reagents to be rapidly mixed in the observation cuvette. Thereby allowing the kinetics of reactions on timescales of ~0.1 - 100 sec to be monitored. |
References
- Marx, A., Hoenger, A., Mandelkow, E.
- Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 682-696 (2009).
- Friel, C. T., Howard, J. Coupling of kinesin ATP turnover to translocation and microtubule regulation: one engine, many machines. J. Muscle Res. Cell Motil. 33, 377-383 (2012).
- Yun, M., Zhang, X., Park, C. G., Park, H. W., Endow, S. A. A structural pathway for activation of the kinesin motor ATPase. EMBO J. 20, 2611-2618 (2001).
- Hirose, K., Akimaru, E., Akiba, T., Endow, S. A., Amos, L. A. Large conformational changes in a kinesin motor catalyzed by interaction with microtubules. Mol. Cell. 23, 913-923 (2006).
- Kikkawa, M., et al.
- Friel, C. T., Bagshaw, C. R., Howard, J. Analysing the ATP turnover cycle of microtubule motors. Methods Mol. Biol. 777, 177-192 (2011).
- Bagshaw, C. ATP analogues at a glance. J. Cell Sci. 114, 459-460 (2001).
- Friel, C. T., Howard, J. The kinesin-13 MCAK has an unconventional ATPase cycle adapted for microtubule depolymerization. EMBO J. 30, 3928-3939 (2011).
- Gilbert, S. P., Webb, M. R., Brune, M., Johnson, K. A. Pathway of processive ATP hydrolysis by kinesin. Nature. 373, 671-676 (1995).
- Sadhu, A., Taylor, E. W.
- Woodward, S. K., Eccleston, J. F., Geeves, M. A. Kinetics of the interaction of 2'(3')-O-(N-methylanthraniloyl)-ATP with myosin subfragment 1 and actomyosin subfragment 1: characterization of two acto-S1-ADP complexes. Biochemistry. 30, 422-430 (1991).
- Hackney, D. D. Pathway of ADP-stimulated ADP release and dissociation of tethered kinesin from microtubules. Implications for the extent of processivity. Biochemistry. 41, 4437-4446 (2002).
- Lockhart, A., Cross, R. A. Kinetics and motility of the Eg5 microtubule motor. Biochemistry. 35, 2365-2373 (1996).
- Chen, C. J., Porche, K., Rayment, I., Gilbert, S. P. The ATPase pathway that drives the kinesin-14 Kar3Vik1 powerstroke. J. Biol. Chem. 287, 36673-36682 (2012).
- Moyer, M. L., Gilbert, S. P., Johnson, K. A. Pathway of ATP hydrolysis by monomeric and dimeric kinesin. Biochemistry. 37, 800-813 (1998).
- Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E., Direct Webb, M. R. real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase. Biochemistry. 33, 8262-8271 (1994).
- Goodrich, J. A., Kugel, J. F. Chapter 4. Binding and Kinetics for Molecular Biologists. 4, Cold Spring Harbour Laboratory Press. Cold Spring, NY. 69-97 (2006).
- Gell, C., et al. Microtubule dynamics reconstituted in vitro and imaged by single-molecule fluorescence microscopy. Methods Cell Biol. 95, 221-245 (2010).
- Olmsted, J. B., Borisy, G. G. Ionic and nucleotide requirements for microtubule polymerization in vitro. Biochemistry. 14, 2996-3005 (1975).
- Brinkley, W. Microtubules: a brief historical perspective. J. Struct Biol. 118, 84-86 (1997).
- Ostap, E. M., Pollard, T. D. Biochemical kinetic characterization of the Acanthamoeba myosin-I ATPase. J. Cell Biol. 132, 1053-1060 (1996).
- Eccleston, J. F., Moore, K. J., Brownbridge, G. G., Webb, M. R., Lowe, P. N. Fluorescence approaches to the study of the p21ras GTPase mechanism. Biochem. Soc. Trans. 19, 432-437 (1991).
- Ahmadian, M. R., Wittinghofer, A., Herrmann, C. Fluorescence methods in the study of small GTP-binding proteins. Methods Mol. Biol. 189, 45-63 (2002).
