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Chemistry

प्रतिदीप्ति प्रवाह बंद और लेबल nucleotides का प्रयोग Kinesins की एटीपी टर्नओवर साइकिल का विश्लेषण करने के लिए

Published: October 17, 2014 doi: 10.3791/52142
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1School of Life Sciences, University of Nottingham

Summary

Kinesins सूक्ष्मनलिकाएं साथ न्यूक्लियोटाइड निर्भर बातचीत की विशेषता है: microtubule बातचीत का एक चक्र के लिए मिलकर एटीपी कारोबार का एक चक्र. यहाँ, हम fluorescently लेबल nucleotides और बंद कर दिया प्रवाह प्रतिदीप्ति का उपयोग कर एक kinesin की एटीपी कारोबार चक्र में व्यक्ति न्यूक्लियोटाइड संक्रमण के कैनेटीक्स का विश्लेषण करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन.

Abstract

microtubule जुड़े मोटर प्रोटीन की kinesin superfamily दोनों एटीपी hydrolyses और सूक्ष्मनलिकाएं बांध एक विशेषता है जो मोटर डोमेन का हिस्सा. Kinesins एटीपी कारोबार में और microtubule बातचीत में दोनों superfamily भर में मतभेद प्रदर्शित करते हैं. ये मतभेद ऐसे कार्गो परिवहन, microtubule रपट, microtubule depolymerization और microtubule स्थिरीकरण के रूप में विभिन्न कार्यों के लिए विशिष्ट kinesins दर्जी. एक kinesin की कार्रवाई के तंत्र को समझने के लिए यह एटीपी कारोबार की रासायनिक चक्र microtubule बातचीत के यांत्रिक चक्र के लिए युग्मित है कैसे समझने के लिए महत्वपूर्ण है. एटीपी कारोबार चक्र टुकड़े करने के लिए, एक दृष्टिकोण चक्र में अलग अलग चरणों कल्पना करने के लिए fluorescently लेबल nucleotides का उपयोग करने के लिए है. एटीपी कारोबार चक्र में प्रत्येक न्यूक्लियोटाइड संक्रमण के कैनेटीक्स निर्धारण पूरा चक्र पहचाना जा करने के लिए दर सीमित कदम या चरणों की अनुमति देता है. एक kinesin के लिए, उस में, दर सीमित कदम जानना महत्वपूर्ण हैkinesin सूक्ष्मनलिकाएं साथ सूचना का आदान प्रदान जब सूक्ष्मनलिकाएं के अभाव, यह कदम आम तौर पर कई हजार गुना त्वरित है. सूक्ष्मनलिकाएं के अभाव में चक्र तो पूरी तरह से एक kinesin के एटीपी कारोबार चक्र को समझने के लिए सूक्ष्मनलिकाएं की उपस्थिति में उस की तुलना में है. व्यक्तिगत न्यूक्लियोटाइड संक्रमण के कैनेटीक्स आम तौर पर स्वयं को विशेष रूप से सूक्ष्मनलिकाएं की उपस्थिति में, अभिकारकों मिश्रण से निरीक्षण करने के लिए भी तेजी से कर रहे हैं. एक तेजी से मिश्रण डिवाइस, ऐसे कैनेटीक्स कुछ मिसे के रूप में छोटे से timescales पर मनाया जा करने की अनुमति देता है जो एक बंद कर दिया प्रवाह fluorimeter, के रूप में, इस तरह के बदलाव पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यहाँ, हम बंद कर दिया प्रवाह से अभिकर्मकों का तेजी से मिश्रण एक kinesin की एटीपी कारोबार चक्र काटना fluorescently लेबल nucleotides के साथ संयोजन के रूप में प्रयोग किया जाता है, जिसमें प्रोटोकॉल का वर्णन.

Introduction

kinesins एक अत्यधिक संरक्षित मोटर डोमेन 1 द्वारा विशेषता प्रोटीन की एक superfamily हैं. kinesin मोटर डोमेन एक न्यूक्लियोटाइड निर्भर ढंग से सूक्ष्मनलिकाएं साथ सूचना का आदान प्रदान. Kinesin परिवार के सदस्य microtubule गतिशीलता 2,3 विनियमित जो गैर translocating microtubule अंत बाध्यकारी kinesins को सूक्ष्मनलिकाएं साथ एक निर्देशित फैशन में माल ले जो translocating kinesins,,, से कार्यों की एक श्रृंखला प्रदर्शित करते हैं.

Kinesins 4-6 cytoskeleton microtubule के साथ उनकी बातचीत को विनियमित करने के लिए adensosine-5'-triphosphate (एटीपी) के कारोबार का उपयोग करें. एटीपी, ADP, ADP.Pi या कोई न्यूक्लियोटाइड बाध्य किया जा सकता है (चित्रा 1): microtubule के लिए kinesin मोटर डोमेन और इसलिए अपने संबंध की रचना अपने न्यूक्लियोटाइड राज्य पर निर्भर करता है. एक kinesin के आणविक तंत्र को समझने के लिए, एटीपी कारोबार और microtubule बातचीत के बीच के रिश्ते की एक समझ की आवश्यकता है.refore, kinesin क्षेत्र में एक प्रमुख लक्ष्य अलग न्यूक्लियोटाइड राज्यों के कार्यात्मक गुण और सूक्ष्मनलिकाएं की उपस्थिति और अनुपस्थिति में उन दोनों के बीच संक्रमण के कैनेटीक्स चिह्नित करने के लिए है.

चित्रा 1
एक kinesin के लिए सबसे सरल एटीपी कारोबार चक्र चित्रा 1 चार संभव राज्यों के होते हैं:. न्यूक्लियोटाइड मुक्त (Φ) चार संक्रमण से हर एक आगे और के द्वारा होती है, ADP.P मैं -bound, एटीपी बाध्य और ADP बाध्य पिछड़े दर लगातार (कश्मीर एक्स और क्रमशः -x कश्मीर).

एटीपी कारोबार की रासायनिक चक्र microtubule बातचीत के यांत्रिक चक्र के लिए युग्मित है कैसे समझने के लिए, एक दर microtub के अभाव में सीमित एटीपी कारोबार चक्र में जो कदम है यह निर्धारित करना चाहिएules और फिर चक्र सूक्ष्मनलिकाएं की उपस्थिति से बदल रहा है कैसे निर्धारित करते हैं. सरल एटीपी कारोबार चक्र चार व्यक्ति रसायन चरणों के होते हैं: (1) एटीपी खाली साइट के लिए बाध्य (Φ खाली साइट, यानी, न्यूक्लियोटाइड मुक्त kinesin अर्थ); (2) एटीपी दरार; (3) फॉस्फेट हदबंदी और (4) ADP हदबंदी (चित्रा 1). दर सीमित कदम पूरा एटीपी कारोबार चक्र के लिए दर लगातार सेट. इसलिए, व्यक्ति संक्रमण के प्रत्येक मापा और पूरा चक्र के लिए दर लगातार की तुलना में किया जाना चाहिए सीमित दर है जो कदम निर्धारित करने के लिए. तरीके यहाँ वर्णित नहीं कर रहे हैं समग्र एटीपी कारोबार चक्र दर लगातार मापने के लिए लेकिन यहाँ संदर्भ 7 में पाया जा सकता है, हम व्यक्तिगत रासायनिक कदम के लिए दर स्थिरांक निर्धारित किया जा सकता है जिसके द्वारा विधियों का वर्णन. एक न्यूक्लियोटाइड hydrolyzing प्रोटीन का कारोबार चक्र में व्यक्ति बदलाव का अध्ययन करने के लिए उपलब्ध तरीकों का एक नंबर रहे हैं. यहाँ प्रस्तुत तरीकों लाभ ले लोफ्लोरोफोरे methylanthraniloyl के साथ लेबल nucleotides के गुणों का ई, आमतौर पर प्रोटीन 8 के लिए बाध्य पर प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन को प्रदर्शित जो mant, के रूप में भेजा. अपने छोटे आकार ribose (2A चित्रा) के लिए युग्मित है, यह आम तौर पर न्यूक्लियोटाइड बाध्यकारी या हाइड्रोलिसिस 9-12 के कैनेटीक्स पर बहुत कम या कोई प्रभाव नहीं है, इसका मतलब है कि क्योंकि mant समूह प्रयोग किया जाता है. यहाँ, हम एक kinesin की एटीपी कारोबार चक्र में न्यूक्लियोटाइड बाध्यकारी और हदबंदी के अवलोकन की अनुमति के लिए बंद कर दिया प्रवाह प्रतिदीप्ति के साथ संयोजन के रूप में mant लेबल nucleotides के उपयोग का वर्णन प्रोटोकॉल, प्रस्तुत करते हैं.

Protocol

Mant लेबल nucleotide के बंधन पर प्रतिदीप्ति तीव्रता परिवर्तन की 1 निर्धारण.

  1. एक उपयुक्त प्रतिक्रिया बफर में 1 माइक्रोन kinesin (अंतिम सांद्रता) के लिए 1 माइक्रोन mant लेबल न्यूक्लियोटाइड जोड़ें. आमतौर पर microtubule विकास और स्थिरता कि लाभ एक बफर (चर्चा देखें) प्रयोग किया जाता है. एक आमतौर पर इस्तेमाल किया बफर 80mm piperazine बीआईएस-2-ethanesulfonic एसिड (पाइप) pH6.9 होता है, 1mm 2 MgCl और 1mm इथाइलीन ग्लाइकॉल बीआईएस -2 aminoether-tetraacetic एसिड (EGTA).
    नोट: सभी प्रोटोकॉल में कहा गया kinesin की एकाग्रता न्यूक्लियोटाइड बाध्यकारी साइटों (यानी, मोटर डोमेन) की एकाग्रता को दर्शाता है. अलग kinesins monomers, dimers या tetramers के रूप में मौजूद है और ऐसा अणु प्रति एक से अधिक न्यूक्लियोटाइड बाध्यकारी साइट शामिल कर सकते हैं.
  2. एक ऊष्मायन अवधि (1-3 मिनट) और एक मानक fluorimeter इस्तेमाल करने के बाद, mant लेबल न्यूक्लियोटाइड-kinesin जटिल के लिए उत्सर्जन स्पेक्ट्रम उपाय. 365nm के एक उत्तेजना तरंग दैर्ध्य का प्रयोग करें औरउपाय 1nm वेतन वृद्धि में 400-500 एनएम से प्रकाश उत्सर्जित.
  3. 1.1 चरण में इस्तेमाल किया ही प्रतिक्रिया बफर में 1 मिमी की एक समाधान mant लेबल न्यूक्लियोटाइड बनाओ.
  4. पहले से वर्णित है, mant न्यूक्लियोटाइड केवल नमूने के लिए उत्सर्जन स्पेक्ट्रम उपाय (1.2 चरण देखें).
  5. इस मान से के माध्यम से विभाजित करके (kinesin बिना यानी,) समाधान में mant न्यूक्लियोटाइड के स्पेक्ट्रम के शिखर प्रतिदीप्ति तीव्रता की तरंग दैर्ध्य में संकेत करने के लिए स्पेक्ट्रा मानक के अनुसार.
  6. (जैसे, चित्रा 2B) mantATP समयबद्ध और / या समाधान में mantADP बाध्य kinesin और mant न्यूक्लियोटाइड के बीच प्रतिदीप्ति तीव्रता मतभेद निरीक्षण करने के लिए सामान्यीकृत स्पेक्ट्रा प्लॉट.

MantATP के लिए एसोसिएशन और पृथक्करण दर स्थिरांक की 2 मापन

  1. मुक्त बफर 2 + किसी भी उपयुक्त मिलीग्राम में करने के लिए 20 माइक्रोन kinesin (देखें चर्चा) के एक समाधान के लिए (जैसे, 80mm पाइप pH6.9, 1mm EGTA, 0.1% Tween20), 1 जोड़मिमी (अंतिम एकाग्रता) ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) और 1 मिमी (अंतिम एकाग्रता) dithiothreitol (डीटीटी). नोट: यह कम कर देता है के रूप में बफर करने Tween20 की वृद्धि की सिफारिश की है / बफर विनिमय के लिए इस्तेमाल स्तंभ पर kinesin प्रोटीन के नुकसान से बचाता है (कदम 2.3 और 3.3)
  2. 15 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर समाधान सेते हैं.
  3. (सामग्री की सूची देखें) निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक गुरुत्वाकर्षण प्रवाह जी 25 sephadex जेल निस्पंदन स्तंभ का उपयोग कर kinesin से अलग स्वतंत्र न्यूक्लियोटाइड और EDTA.
    1. एक उपयुक्त 2 मिलीग्राम + मुक्त बफर के कम से कम 3 स्तंभ संस्करणों के साथ स्तंभ संतुलित करना (2.1 कदम देखें). स्तंभ पर kinesin युक्त समाधान लोड. मैग्नीशियम क्लोराइड की अंतिम एकाग्रता kinesin समाधान के संग्रह के बाद 1 मिमी है कि इस तरह के, खाली ट्यूब 100mm मैग्नीशियम क्लोराइड समाधान का एक उचित मात्रा में जोड़कर एक संग्रह ट्यूब तैयार करें. मैग्नीशियम क्लोराइड की तत्काल अलावा stabili मदद करता हैन्यूक्लियोटाइड मुक्त kinesin se.
    2. एक उपयुक्त 2 मिलीग्राम + मुक्त बफर का उपयोग कर kinesin elute. जल्दी से काम करने के लिए जब यह महत्वपूर्ण है ताकि न्यूक्लियोटाइड से मुक्त Kinesins अस्थिर कर रहे हैं. बर्फ पर न्यूक्लियोटाइड मुक्त kinesin स्टोर और 1-2 घंटे के भीतर का उपयोग करें.
  4. के दौरान या पूर्व न्यूक्लियोटाइड मुक्त kinesin की तैयारी करने के लिए, न्यूक्लियोटाइड मुक्त kinesin के अंतिम समाधान के रूप में एक ही प्रतिक्रिया बफर में एक mantATP एकाग्रता श्रृंखला तैयार करते हैं. 0.1 से 50 माइक्रोन (2.5 कदम और चर्चा देखें) से लेकर एक ठेठ श्रृंखला के साथ kinesin के उपलब्ध एकाग्रता के अनुसार आवश्यक mantATP की सांद्रता की सीमा निर्धारित करते हैं.
  5. न्यूक्लियोटाइड मुक्त kinesin की एकाग्रता श्रृंखला तैयार करें. MantATP के प्रत्येक एकाग्रता (2.4 चरण) के लिए, न्यूक्लियोटाइड मुक्त kinesin की एकाग्रता mant लेबल न्यूक्लियोटाइड kinesin न्यूक्लियोटाइड बाध्यकारी साइटों पर 5 से 10 गुना दाढ़ अधिक है कि इस तरह तैयार किया जाना चाहिए.
  6. बंद कर दिया-FLO पर उत्तेजना तरंगदैर्ध्य सेट365 एनएम fluorimeter डब्ल्यू और एक लंबी पास फिल्टर का उपयोग> 400 एनएम पर प्रकाश उत्सर्जित लीजिए.
  7. एक बंद कर दिया प्रवाह fluorimeter (चित्रा 3 ए और 3 बी इनसेट) का उपयोग करते हुए 1 वी / वी अनुपात: mantATP की सबसे कम एकाग्रता के साथ शुरू, एक 1 में न्यूक्लियोटाइड मुक्त kinesin का एक उपयुक्त एकाग्रता के साथ mantATP मिश्रण. नोट: अभिकारकों मिश्रण पर 50% तक पतला कर रहे हैं. भ्रम से बचने के न्यूक्लियोटाइड एकाग्रता दोनों से पहले और बाद मिश्रण (यानी, 3.0 / 1.5 माइक्रोन) का एक नोट रखें.
  8. Mant समूह की photobleaching के लिए खाते में एक घातीय समारोह प्लस लगातार नकारात्मक ढलान की एक पंक्ति को mantATP के प्रत्येक एकाग्रता में मापा प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन फ़िट (यानी, प्रतिदीप्ति ए 0 .exp (OBS टी कश्मीर) + (एम =. टी ए 0 आयाम है जहां सी), कश्मीर OBS दर स्थिर है और टी,) चित्रा 3B और चर्चा को देखने के लिए समय है. इन फिट से एक निर्धारितmantATP के प्रत्येक एकाग्रता में निरंतर (कश्मीर OBS) दर. प्रत्येक कश्मीर OBS एक संघ और हदबंदी दर लगातार (चित्रा 1, कश्मीर 1 और कश्मीर -1) का एक कनवल्शनफ़िल्टर्स है.
  9. (जैसे, चित्रा -3 सी) mantATP एकाग्रता के खिलाफ कश्मीर OBS साजिश रचने के द्वारा संघ और पृथक्करण दर स्थिरांक Deconvolve. ढाल और वाई अक्ष अवरोधन प्राप्त करने के लिए एक रेखीय समारोह (यानी, कश्मीर OBS k = 1 [mantATP] + K -1) को इन डेटा फिट. ढाल इकाइयों एम -1 एस -1 के साथ mantATP एसोसिएशन (चित्रा 1, कश्मीर 1) के लिए दर लगातार प्रतिनिधित्व करता है. अवरोधन एस -1 (चर्चा देखने के लिए) की इकाइयों के साथ हदबंदी दर लगातार (चित्रा 1, कश्मीर -1) का प्रतिनिधित्व करता है. यह दृष्टिकोण भी ADP संघ और पृथक्करण का निर्धारण करने के लिए लागू किया जा सकता: नोटन्यूक्लियोटाइड रूप mantADP का उपयोग कर की दर स्थायी (चित्रा 1, कश्मीर -4 और कश्मीर 4).

MantADP के लिए हदबंदी दर का 3 मापन लगातार

  1. एक उपयुक्त प्रतिक्रिया बफर में 2 माइक्रोन kinesin का एक समाधान के लिए (जैसे, 80 मिमी पाइप pH6.9, 1mm 2 MgCl, 1mm EGTA, 0.1% Tween20), 50 माइक्रोन mantADP (अंतिम एकाग्रता) जोड़ें.
  2. 30 मिनट के लिए 25 ओ सी सेते हैं.
  3. जी -25 sephadex स्तंभ का उपयोग चुना प्रतिक्रिया बफर में kinesin का आदान बफर से अतिरिक्त mantADP और अन्य मुक्त न्यूक्लियोटाइड निकालें निर्माता के निर्देशों के अनुसार (सामग्री की सूची देखें). kinesin मोटर डोमेन अब mantADP साथ लोड किया जाना चाहिए.
  4. 365 एनएम के लिए बंद कर दिया प्रवाह fluorimeter पर उत्तेजना तरंगदैर्ध्य सेट और एक लंबी पास फिल्टर का उपयोग> 400 एनएम पर प्रकाश उत्सर्जित लीजिए.
  5. एक 50 गुना या अधिक से अधिक MOLA साथ mantADP.kinesin जटिल (~ 1μM) मिक्सएक बंद कर दिया प्रवाह fluorimeter (चित्रा -4 ए और 4 बी इनसेट) का उपयोग करते हुए 1 वी / वी अनुपात: एक 1 में unlabeled एटीपी के आर अतिरिक्त.
  6. एक एकल घातीय समारोह प्लस mant समूह की photobleaching के लिए खाते में लगातार नकारात्मक ढलान की एक लाइन के लिए समय के साथ मनाया प्रतिदीप्ति तीव्रता में कमी फ़िट (यानी, प्रतिदीप्ति ए 0 .exp (OBS टी कश्मीर) + (m.t + = ए 0 आयाम है जहां सी), कश्मीर OBS दर स्थिर है और टी समय है,) चित्रा 4 बी और चर्चा देखें. इस फिट से निर्धारित कश्मीर OBS एस -1 (चर्चा देखने के लिए) की इकाइयों के साथ ADP (चित्रा 1, कश्मीर 4) की हदबंदी के लिए दर स्थिर है.

Representative Results

Mant समूह के प्रतिदीप्ति तीव्रता में वृद्धि आम तौर पर एक kinesin को mant लेबल न्यूक्लियोटाइड के बंधन पर मनाया जाता है. हालांकि, इस तरह के एक संकेत परिवर्तन की भयावहता प्रश्न में विशेष kinesin पर निर्भर है. इसलिए, यह गतिज assays के लिए प्रगति से पहले एक प्रतिदीप्ति तीव्रता परिवर्तन की उपस्थिति और परिमाण दोनों पुष्टि करने के लिए संतुलन माप प्रदर्शन करने के लिए उपयोगी है. MantATP और mantADP के लिए प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा, समाधान में और kinesin-13, MCAK साथ परिसर में दोनों, चित्रा 2B में दिखाए जाते हैं. इन आंकड़ों MCAK के लिए बाध्य पर mantATP और mantADP दोनों द्वारा प्रदर्शित प्रतिदीप्ति तीव्रता में वृद्धि पर प्रकाश डाला. एक kinesin को mant न्यूक्लियोटाइड के बंधन पर प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन संघ और एटीपी और ADP दोनों की हदबंदी पर रिपोर्ट करने के लिए प्रयोग किया जाता है (धारा 2 और 3). MCAK के मामले में, एक प्रतिदीप्ति तीव्रता अंतर mantATP.kinesin और mantADP.kinesin के बीच मनाया जाता है

चित्रा 3A न्यूक्लियोटाइड मुक्त kinesin साथ mantATP मिश्रण पर होती है कि प्रतिक्रिया दर्शाया गया है. Kinesin-13 के लिए mantATP के बंधन पर होती है कि प्रतिदीप्ति तीव्रता में वृद्धि illustrating प्रतिनिधि डेटा, MCAK चित्रा 3B में दिखाया गया है. चित्रा 3B में दिखाया प्रकार का डाटा mantATP सांद्रता की एक श्रृंखला में एकत्र किया जाता है. MantATP एकाग्रता बनाम निर्धारित दर स्थिरांक (कश्मीर OBS) का एक भूखंड चित्रा -3 सी में दिखाया गया है. एक रेखीय कार्य करने के लिए इन आंकड़ों फिटिंग (यानी, कश्मीर OBS k = 1 [mantATP] + K -1) OBS (2.8 चरण) कश्मीर में योगदान दर स्थिरांक की deconvolution अनुमति देता है. इसलिए, संघ और mantATP के लिए हदबंदी दर लगातार दोनों के निर्धारण को सक्षम (चित्रा 1, कश्मीर 1 और कश्मीर -1 क्रमशः).

चित्रा -4 ए unlabeled एटीपी की एक अतिरिक्त के साथ mantADP.kinesin मिश्रण पर होती है जो प्रतिक्रिया दर्शाया गया है. चित्रा 4 बी में डेटा kinesin-13, MCAK से हदबंदी पर mantADP के लिए मनाया प्रतिदीप्ति तीव्रता में कमी को दर्शाता है. MantADP की हदबंदी के लिए (3.6 कदम) एक घातीय समारोह के लिए दर लगातार इस डेटा फिटिंग द्वारा सीधे निर्धारित किया जाता है.

चित्रा 2
फ्लोरोफोरे methylanthraniloyl (mant) के साथ लेबल चित्रा 2 न्यूक्लियोटाइड एटीपी कारोबार चक्र में अलग अलग चरणों को अलग करने के लिए उपयोग किया जाता है. Ribose पर स्थिति 2 'या 3' या तो संयुग्मित mant फ्लोरोफोरे की स्थिति दिखा mantATP (ए) संरचना. (बी) समाधान (mAXP) में mantATP और mantADP लिए सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा और mantATP एकkinesin MCAK (mATP + MCAK और mADP + MCAK) के साथ परिसर में डी mantADP. mantATP स्पेक्ट्रा समाधान में mantADP के लिए अधिकतम पर प्रतिदीप्ति के लिए सामान्यीकृत समाधान में mantATP के लिए अधिकतम पर प्रतिदीप्ति और mantADP स्पेक्ट्रा के लिए सामान्यीकृत कर रहे हैं. MCAK साथ मिश्रित mant nucleotides के स्पेक्ट्रा 1 मिनट पद मिश्रण में एकत्र कर रहे हैं. के रूप में प्रोटोकॉल में वर्णित हैं अभिकर्मकों और fluorimeter सेटिंग्स की एकाग्रता 1.1 और 1.2 कदम.

चित्रा 3
MantATP के सहयोग की दर लगातार की चित्रा 3 मापन. (ए) बंद कर दिया प्रवाह द्वारा जगह पोस्ट मिश्रण लेता है जो प्रतिक्रिया चित्रण योजनाबद्ध: mantATP (mATP) न्यूक्लियोटाइड से मुक्त करने के लिए kinesin बांधता है. प्रोटीन के लिए बाध्य पर mant समूह बढ़ जाती है की प्रतिदीप्ति तीव्रता. (बी) प्रतिदीप्ति संकेत परिवर्तन (काला) MCAK साथ mantATP (25 एम) (5 एम परमाणु मिश्रण पर मनायाcleotide मुक्त,). इस डेटा (चर्चा देखें) mant फ्लोरोफोरे की photobleaching के लिए खातों जो एक एकल घातीय समारोह प्लस लगातार नकारात्मक ढलान की एक लाइन, के लिए फिट (धराशायी लाल) है इनसेट:. पूर्व बंद कर दिया प्रवाह fluorimeter पर मिश्रण को सीरिंज की सामग्री. न्यूक्लियोटाइड मुक्त MCAK साथ mantATP की प्रतिक्रिया के लिए निर्धारित (सी) दर स्थिरांक (कश्मीर OBS) mantATP की एकाग्रता के खिलाफ साजिश रची है. इस साजिश एम -1 एस की इकाइयों के सहयोग की दर लगातार (चित्रा 1, कश्मीर 1) जा रहा ढाल -1 और y-अवरोधन हदबंदी दर लगातार किया जा रहा है (चित्रा 1, कश्मीर -1) के साथ साथ एक रेखीय क्षेत्र होगा एस की इकाइयों -1. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.


. MantADP साथ preloaded kinesin unlabeled एटीपी की एक अतिरिक्त में पतला है: mantADP के लिए हदबंदी दर लगातार की 4 चित्र मापन (ए) योजनाबद्ध बंद कर दिया प्रवाह द्वारा जगह पोस्ट मिश्रण लेता है जो प्रतिक्रिया चित्रण. अलग कर mantADP जिससे mantADP एसोसिएशन (चर्चा देखने के लिए) की पीठ प्रतिक्रिया को रोकने, unlabeled एटीपी द्वारा बदल दिया है. mant समूह के प्रतिदीप्ति तीव्रता प्रोटीन से हदबंदी पर कम हो जाती है. kinesin MCAK से mantADP की हदबंदी पर मनाया (बी) प्रतिदीप्ति कमी. प्रतिदीप्ति संकेत (काला) (चर्चा देखें) mant समूह की photobleaching के लिए खाते में एक भी घातीय प्लस लगातार नकारात्मक ढलान की एक लाइन के लिए फिट (धराशायी लाल) है. निर्धारित दर लगातार mantADP (चित्रा 1, कश्मीर की हदबंदी के लिए दर स्थिर है4) इनसेट:.. एक बंद कर दिया प्रवाह fluorimeter पर मिश्रण करने से पहले सीरिंज की सामग्री इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Discussion

यहाँ, हम एक kinesin के लिए न्यूक्लियोटाइड राज्यों के बीच संक्रमण के कैनेटीक्स का अवलोकन और विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. इन प्रोटोकॉल fluorescently लेबल nucleotides के साथ संयोजन के रूप में तेजी से मिश्रण विधि बंद कर दिया प्रवाह का उपयोग. इस प्रकार के तरीके kinesins 9-11,13-16 की एक किस्म के लिए न्यूक्लियोटाइड बाध्यकारी और हदबंदी अध्ययन करने के लिए बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है. फॉस्फेट रिलीज (चित्रा 1, चरण 3) के अवलोकन की अनुमति नहीं देते वर्णित विधि. हालांकि, बंद कर दिया प्रवाह प्रतिदीप्ति एक प्रतिदीप्ति तीव्रता परिवर्तन करने के लिए 17 जोड़े को फॉस्फेट का उत्पादन एक फॉस्फेट संवेदन प्रोटीन का उपयोग करके इस संक्रमण का निरीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. प्रोटीन के लिए बाध्य है जब आम तौर पर प्रतिदीप्ति तीव्रता में वृद्धि दिखा रहे हैं जो छोटे फ्लोरोफोरे methylanthraniloyl (mant) के साथ लेबल उपयोग न्यूक्लियोटाइड, प्रस्तुत तरीकों. इसके अलावा, mant फ्लोरोफोरे, जब आर पर 2 'या 3' की स्थिति या तो संयुग्मितibose, अक्सर न्यूक्लियोटाइड 9-12 के बंधन, हदबंदी या हाइड्रोलिसिस पर बहुत कम या कोई प्रभाव नहीं है. Mant लेबल nucleotides वाणिज्यिक स्रोतों (सामग्री की सूची देखें) से आसानी से उपलब्ध हैं और एक भी isomer 8 शुद्ध करने के लिए जब वे जल्दी से फिर से संतुलित करना ही 2 'और 3' साधना के मिश्रण के रूप में प्रदान की जाती हैं. Mant लेबल nucleotides न्यूक्लियोटाइड बाध्यकारी और पृथक्करण की कैनेटीक्स मनाया जा सकता है जिसके द्वारा उत्कृष्ट संवाददाता अणु बनाते हैं.

fluorescently लेबल nucleotides के उपयोग वर्णित assays के बाहर प्रतिदीप्ति तीव्रता में एक वास्तविक समय परिवर्तन है कि पढ़ने का मतलब है. इस अभिकर्मकों की तेजी मिश्रण और बाद में प्रतिक्रिया के साथ जुड़े प्रतिदीप्ति में परिवर्तन की वास्तविक समय अवलोकन की अनुमति देता है, जो बंद कर दिया प्रवाह प्रतिदीप्ति, के लिए इन assays आदर्श बनाता है. पता लगाने की विधि के रूप में मिश्रण तकनीक और प्रतिदीप्ति के रूप में बंद कर दिया प्रवाह के संयोजन अपेक्षाकृत नमूना एफई है कि एक प्रणाली का उत्पादनficient. उदाहरण के लिए, 0.8 की आवश्यकता चित्रा -3 सी में दिखाया गया डेटा प्राप्त करने के लिए - शुद्ध kinesin-13 की 1.0 मिलीग्राम, MCAK, और चित्रा 4 बी में दिखाया गया डेटा प्राप्त करने के लिए ~ शुद्ध kinesin-13, MCAK की 0.3 मिलीग्राम की आवश्यकता है. एक फ्लोरोफोरे रूप mant के उपयोग की एक खामी यह photobleaching होने का खतरा है. यह बंद कर दिया प्रवाह में, kinesin के अभाव में, प्रतिक्रिया बफर के साथ mant लेबल न्यूक्लियोटाइड के समाधान के मिश्रण से प्रतिक्रिया कैनेटीक्स kinesin से अलगाव में मनाया जा सकता है. Mant समूह प्रक्षालित हो जाता है प्रतिदीप्ति तीव्रता में एक धीमी गति से कमी मनाया जाता है. Mant समूह की photobleaching वर्णित प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया timescales की सीमा से अधिक अच्छी तरह से एक रेखीय समारोह से वर्णन किया गया है. इसलिए, photobleaching के लिए डेटा को ठीक करने के लिए एक सरल तरीका है एक एकल पैरामीटर द्वारा वर्णित एक रेखीय समारोह (यानी, मीट्रिक टन + C) के बजाय अधिक आम फ्लैट आधारभूत द्वारा वर्णित एक आधार रेखा के साथ एक घातीय समारोह को फिट करने के लिए है.

mantATP बंधन

MantATP की एसोसिएशन और पृथक्करण के लिए दर स्थिरांक सूक्ष्मनलिकाएं के अभाव में kinesin न्यूक्लियोटाइड बाध्यकारी साइट के साथ संबद्ध रहता है जो (खंड 2) ADP, जब मापने, हटा दिया जाना चाहिए. इस mantATP एसोसिएशन और हदबंदी (चित्रा 1, चरण 1) ADP हदबंदी से अलगाव में मनाया जा सकता है. इस kinesin न्यूक्लियोटाइड बाध्यकारी साइटों (2.1 चरण) से अधिक EDTA के कम से कम 50 गुना अधिक के साथ incubated है को प्राप्त करने के लिए. EDTA 2 मिलीग्राम + आयनों न्यूक्लियोटाइड 11 के रिलीज में जो परिणाम न्यूक्लियोटाइड बाध्यकारी जेब से अलग कर देना 2 मिलीग्राम + पैदा sequesters. बाहर ले जा 2.1 कदम इसलिए, जब - 2.3, यह 2 + मिलीग्राम से मुक्त एक बफर का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है. न्यूक्लियोटाइड मुक्त kinesin प्रोटीन बफर मुक्त न्यूक्लियोटाइड से और EDTA से दोनों इसे अलग करने के लिए विमर्श किया है. इस जुदाई, एक डिस्पोजेबल गुरुत्व प्रवाह जीई पूरा करने के लिएएल निस्पंदन स्तंभ पर्याप्त है और सरल और (सामग्री की सूची देखें) का उपयोग करने के लिए तेजी से है. न्यूक्लियोटाइड मुक्त kinesin साथ mantATP की बातचीत संघ और पृथक्करण दर स्थिरांक (2.8 चरण) के deconvolution सक्षम करने के लिए mantATP सांद्रता (2.4 चरण) के एक रेंज में किया जाता है. इस प्रकार के प्रयोगों के पीछे सिद्धांत अच्छी तरह से एक mantATP की सबसे कम एकाग्रता के साथ शुरू होता है इन प्रयोगों प्रदर्शन में संदर्भ 18 में वर्णित है. यह अलग सांद्रता के बीच धोने कदम के लिए आवश्यकता को हटा. यह संभावना mantATP एकाग्रता बढ़ जाती है के रूप में बंद कर दिया प्रवाह fluorimeter की संवेदनशीलता को समायोजित करने के लिए आवश्यक हो जाएगा. mantATP एकाग्रता हमेशा छद्म पहले के आदेश की स्थिति बनाए रखने के लिए kinesin न्यूक्लियोटाइड बाध्यकारी साइटों की एकाग्रता पर कम से कम 5 गुना अधिक होना चाहिए. MantATP की एकाग्रता बढ़ जाती है लेकिन, जैसा कि संकेत परिवर्तन घटने kinesin को बांधता है कि न्यूक्लियोटाइड के अंश के रूप में सैलाब बन सकता है. Therefo, kinesin की एकाग्रता भी mantATP के प्रत्येक नए एकाग्रता के लिए बढ़ जाती है फिर से इस तरह के mantATP की एकाग्रता न्यूक्लियोटाइड बाध्यकारी साइटों (2.6 चरण) पर 10 गुना दाढ़ अतिरिक्त तुलना में कभी नहीं अधिक है.

mantADP हदबंदी

MantADP के लिए संघ और पृथक्करण दर स्थिरांक mantATP (खंड 2) के लिए वर्णित एक ही विधि द्वारा निर्धारित किया जा सकता है. एक kinesin से ADP की हदबंदी सीधे mantADP.kinesin जटिल तो unlabeled एटीपी (3.5 कदम) के एक अतिरिक्त के साथ मिलाया जाता है mantADP (कदम 3.1-3.3) के साथ न्यूक्लियोटाइड बाध्यकारी साइट preloading द्वारा मनाया जा सकता है. अतिरिक्त unlabeled एटीपी kinesin को mantADP की rebinding रोकता है और इस तरह mantADP के सहयोग से अलगाव में मनाया जा हदबंदी प्रतिक्रिया (चित्रा 1, कश्मीर 4) की अनुमति देता है. इस परख में unlabeled एटीपी की एकाग्रता NUC के कम से कम 50 गुना दाढ़ अतिरिक्त होना चाहिएबाध्यकारी साइटों leotide. इस परख के पीछे सिद्धांत अच्छी तरह से यह प्रत्यक्ष विधि कदम 2.8 में वर्णित शाफ़्ट को एक्सट्रपलेशन से निरंतर हदबंदी दर के लिए एक अधिक सटीक मूल्य देता संदर्भ 18 में वर्णित है.

सूक्ष्मनलिकाएं समावेशन

वर्णित विधि भी सूक्ष्मनलिकाएं की उपस्थिति में न्यूक्लियोटाइड बाध्यकारी और पृथक्करण की कैनेटीक्स निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. सूक्ष्मनलिकाएं से पहले बंद कर दिया प्रवाह में मिश्रण करने के न्यूक्लियोटाइड युक्त सिरिंज के लिए पेश कर रहे हैं: चित्रा 3B और 4 बी में कम सिरिंज (Insets). यह सूक्ष्मनलिकाएं मिलता है के रूप में इस विन्यास में, kinesin एक ही समय में न्यूक्लियोटाइड मिलेंगे. स्थिर सूक्ष्मनलिकाएं ट्यूबिलिन बहुलक का जीवनकाल एक स्थिर रासायनिक, या तो का उपयोग करके बढ़ाया है, जहां इस्तेमाल किया जाता है जैसे 'ग्वानोसिन-5 के रूप में taxol, या एक nonhydrolysable जीटीपी अनुरूप, के रूप में - [(α, β) -methyleno] ट्राईफास्फेट (GMPCPP, सामग्री की सूची देखें). यह तरल नाइट्रोजन 9,19 में कई महीनों के लिए भंडारित किया जा सकता है कि सूक्ष्मनलिकाएं बनाने के लिए GMPCPP साथ ट्यूबिलिन polymerization के दो चक्रों का उपयोग संभव है. पूर्व तैयार सूक्ष्मनलिकाएं का उपयोग काफी इन assays प्रदर्शन में व्यावहारिक कठिनाइयों को कम करता है. Assays में सूक्ष्मनलिकाएं में शामिल करने के लिए, यह microtubule स्थिरता के लिए उपयुक्त प्रतिक्रिया बफर का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है. चुनाव के बफर (BRB80 के रूप में जाना जाता है) 80 मिमी पाइप पीएच 6.9, 1 मिमी 2 MgCl और 1 मिमी EGTA 20,21 युक्त सबसे अधिक इस्तेमाल किया बफर के साथ आधारित पाइप, है.

वर्णित विधियों kinesins के साथ उपयोग करने के लिए ही सीमित नहीं हैं, लेकिन अनुकूलित और किसी भी न्यूक्लियोटाइड बंधनकारी प्रोटीन के लिए लागू किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, इसी तरह के तरीकों आणविक मोटर्स 12,22 के मायोसिन- परिवार और mant लेबल ग्वानोसिन nucleotides के उपयोग के आगे फैली के सदस्यों की एटीपी कारोबार चक्र के लिए लागू किया गया हैइस प्रकार के तरीकों प्रोटीन 23,24 hydrolyzing जीटीपी को.

Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषणा.

Acknowledgments

इस काम जैव प्रौद्योगिकी और जैव विज्ञान अनुसंधान परिषद (बीबीएसआरसी), रॉयल सोसाइटी और नॉटिंघम विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2’/3’-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5’triphosphate  Jena Biosciences # NU-202 mantATP
2’/3’-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5’-diphosphate  Jena Biosciences # NU-201 mantADP
Mg-ATP Roche # 10519979001 The disodium salt of ATP is made to a concentration of 100 mM in 100 mM MgCl2. Concentration should be verified by absorption at 260 nm (e = 15,400 M-1cm-1). Solution stored in aliquots at -20 oC.  
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Fisher Scientific BP120-500 0.5 M stock solution in water, pH 8.0. HAZARD: powder harmful if inhaled.
Dithiothreitol (DTT) Melford MB1015 1 M stock solution in water made fresh for use on the same day. HAZARD: powder harmful if inhaled or in contact with the skin.
NAP-5 column GE Healthcare # 17-0853 G-25 sephadex resin gravity-flow gel filtration column
GMPCPP Jena Biosciences # NU-405 nonhydrolysable analogue of GTP
Stopped-flow fluorimeter  Applied Photophysics SX20 A fluorimeter with some plumbing attached, which allows reagents to be rapidly mixed in the observation cuvette. Thereby allowing the kinetics of reactions on timescales of ~0.1 - 100 sec to be monitored.

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रसायन विज्ञान अंक 92 kinesin एटीपी कारोबार mantATP mantADP बंद कर दिया प्रवाह प्रतिदीप्ति सूक्ष्मनलिकाएं एंजाइम कैनेटीक्स न्यूक्लियोटाइड
प्रतिदीप्ति प्रवाह बंद और लेबल nucleotides का प्रयोग Kinesins की एटीपी टर्नओवर साइकिल का विश्लेषण करने के लिए
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Patel, J. T., Belsham, H. R., Rathbone, A. J., Friel, C. T. Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins. J. Vis. Exp. (92), e52142, doi:10.3791/52142 (2014).

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