Summary
Kinesins er kendetegnet ved nukleotid-afhængig interaktion med mikrotubuli: en cyklus af ATP omsætning koblet til en cyklus af mikrotubulus interaktion. Her beskriver vi protokoller til at analysere kinetikken af enkelte nucleotid-overgange i ATP omsætning cycle kinesin hjælp fluorescensmærkede nukleotider og stoppet-flow-fluorescens.
Abstract
Den kinesin superfamilien af mikrotubuli forbundet motordrevne proteiner deler et karakteristisk motor domæne, der både hydrolyserer ATP og binder mikrotubuli. Kinesins vise forskelle på tværs superfamilien ATP omsætning både i og i mikrotubuli interaktion. Disse forskelle skræddersy specifikke kinesins til forskellige funktioner som godstransport, mikrotubuli glidende, mikrotubuli depolymerisering og mikrotubular stabilisering. For at forstå virkningsmekanismen af en kinesin er det vigtigt at forstå, hvordan den kemiske cyklus af ATP omsætning er koblet til den mekaniske cyklus af mikrotubulus interaktion. For at dissekere ATP omsætning cyklus én tilgang er at anvende fluorescensmærkede nukleotider at visualisere enkelte trin i cyklus. Fastlæggelse kinetikken af hver nukleotid overgang i ATP omsætning cyklus tillader det hastighedsbegrænsende trin eller trin for komplet cyklus kan identificeres. For en kinesin, er det vigtigt at kende den hastighedsbegrænsende trin ifraværet af mikrotubuli, da dette trin er generelt fremskyndet flere tusinde gange, når kinesin interagerer med mikrotubuli. Denne cyklus i fravær af mikrotubuli sammenlignes derefter med den i nærværelse af mikrotubuli til fuldt ud at forstå en kinesin s ATP omsætning cyklus. Kinetikken for individuelle nucleotid overgange er generelt for hurtigt til at observere ved manuelt at blande reaktanterne, især i nærvær af mikrotubuli. En hurtig blanding enhed, såsom en standset flow-fluorimeter, som giver kinetik skal overholdes på tidsskalaer på så lidt som et par millisekunder, kan anvendes til at overvåge sådanne overgange. Her beskriver vi protokoller, hvor hurtig blanding af reagenser ved stopped-flow anvendes i forbindelse med fluorescens-mærkede nukleotider at dissekere ATP omsætning cycle kinesin.
Introduction
De kinesins er en superfamilie af proteiner er kendetegnet ved et højt konserveret motor domæne 1. Den kinesin motor domæne interagerer med mikrotubuli i en nukleotid-afhængig måde. Medlemmer af kinesin familie vise en række funktioner fra translokere kinesins, som bærer last i en rettet måde langs mikrotubuli til ikke-translokation mikrotubul ende-bindende kinesins, som regulerer mikrotubuli dynamikken 2,3.
Kinesins anvende omsætningen adensosine-5'-trifosfat (ATP) for at regulere deres interaktion med mikrotubulus cytoskelettet 4-6. Konformationen af kinesin motor domæne og derfor dets affinitet for mikrotubuli afhænger af dens nukleotid tilstand: ATP, kan ADP ADP.Pi eller ingen nukleotid bundet (figur 1). For at forstå den molekylære mekanisme af en kinesin, er en forståelse af forholdet mellem ATP omsætning og mikrotubuli interaktion kræves. Dencering af et vigtigt mål i kinesin felt er at karakterisere de funktionelle egenskaber af forskellige nukleotidsekvenser stater og kinetikken af overgangene mellem dem både i nærvær og fravær af mikrotubuli.
Figur 1. Den enkleste ATP omsætning cyklus for en kinesin består af fire mulige tilstande: nukleotid-fri (Φ) ATP-bundet ADP.P jeg -bound og ADP-bundne Hver af de fire overgange er kendetegnet ved en frem og. baglæns hastighedskonstant (K x og k -x henholdsvis).
For at forstå, hvordan den kemiske cyklus af ATP omsætning er koblet til den mekaniske cyklus af mikrotubulus interaktion, skal man bestemme, hvilket trin i ATP omsætning cyklus er hastighedsbegrænsende i fravær af microtubmodulerne og derefter afgøre, hvordan cyklussen ændres ved tilstedeværelsen af mikrotubuli. Den enkleste ATP omsætning cyklus består af fire individuelle kemikalier trin: (1) ATP-binding til den tomme stedet (Φ betegner tomt websted, dvs nukleotid-fri kinesin); (2) ATP-spaltning; (3) phosphat dissociering og (4) ADP dissociation (figur 1). Det hastighedsbegrænsende trin indstiller hastighedskonstanten for hele ATP-omsætning cyklus. Derfor, for at afgøre, hvilket trin er hastighedsbegrænsende hver af de enkelte overgange skal måles og sammenlignes med hastighedskonstanten for hele cyklus. Metoder til at måle den samlede ATP-omsætning cyklus hastighedskonstant er ikke beskrevet her, men kan findes i henvisning 7. Her beskriver vi metoder, som hastighedskonstanter for de enkelte kemiske trin kan bestemmes. Der er en række metoder til rådighed til at studere de enkelte overgange i omsætningen cyklus af et nukleotid hydrolyserende protein. De metoder, der præsenteres her tage advantage af egenskaberne af nukleotider mærket med fluoroforen methylanthraniloyl, der normalt betegnes som mant, der viser en ændring i fluorescensintensitet efter binding til protein 8. Den mant-gruppen anvendes, fordi dens lille størrelse betyder, at når den er koblet til ribosen (figur 2A), det generelt har ringe eller ingen virkning på kinetikken af nukleotidbindende eller hydrolyse 9-12. Her præsenterer vi protokoller beskriver brugen af mant-mærkede nukleotider, sammenholdt med stopped-flow-fluorescens, for at tillade observation af nukleotid binding og dissociation i ATP omsætning cyklus af en kinesin.
Protocol
1. Bestemmelse af fluorescensintensitet ændres ved binding af Mant-mærket nukleotid.
- Tilsæt 1 uM mant-mærket nukleotid til 1 uM kinesin (slutkoncentrationer) i en egnet reaktionsbuffer. Typisk en buffer, der gavner mikrotubuli vækst og stabilitet anvendes (se diskussionen). En almindeligt anvendt puffer indeholder 80MM piperazin-bis-2-ethansulfonsyre (PIPES) pH6.9, 1 mM MgCl2 og 1 mM ethylenglycol-bis-2 aminoether-tetraeddikesyre (EGTA).
Bemærk: Koncentrationen af kinesin erklærede i alle protokoller refererer til koncentrationen af nukleotid-bindende sites (dvs. motoriske domæner). Der findes forskellige kinesins som monomerer, dimerer eller tetramerer og kan indeholde mere end en nukleotid-bindende sted pr molekyle. - Efter en inkubationstid (1-3 min) og ved hjælp af en standard fluorimeter, måle emissionsspektret for MANT-mærket nukleotid-kinesin kompleks. Brug en excitationsbølgelængde på 365 nm ogforanstaltning udsendte lys fra 400 til 500 nm i intervaller på 1 Nm.
- Lav en opløsning af 1 mM mant-mærket nukleotid i den samme reaktion puffer anvendes i trin 1.1.
- Mål emissionsspektret for mant nukleotid kun prøve, som tidligere beskrevet (se trin 1.2).
- Normalisere spektre til signalet ved bølgelængden med maksimal fluorescensintensitet af spektret af mant nukleotid i opløsning (dvs. uden kinesin) ved at dividere igennem med denne værdi.
- Plot den normaliserede spektre (fx figur 2B) at observere fluorescensintensitets forskelle mellem mantATP-bundne og / eller mantADP bundet kinesin og MANT nukleotid i opløsning.
2. Måling af foreningen og dissociationshastighedskonstanter til mantATP
- Til en opløsning af op til 20 uM kinesin (se diskussionen) i et passende Mg2 + fri buffer (f.eks 80mm RØR pH6.9, 1 mM EGTA, 0,1% Tween 20), der tilsættes 1mM (slutkoncentration) ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) og 1 mM (slutkoncentration) dithiothreitol (DTT). Bemærk: Det anbefales Tilsætning af Tween 20 til bufferen, da det reducerer / forhindrer tab af kinesin protein på søjlen bruges til pufferudveksling (trin 2.3 og 3.3)
- Inkuberes opløsningen ved 25 ° C i 15 min.
- Separat frit nukleotid og EDTA fra kinesin hjælp af en tyngdestrømning G-25 Sephadex-gelfiltreringssøjle i henhold til producentens anvisninger (se listen af materialer).
- Ækvilibrer søjlen med søjlevolumener af en passende Mg2 + fri buffer mindst 3 (se trin 2.1). Læg kinesin-indeholdende opløsning på søjlen. Forbered en samling rør ved tilsætning af et passende volumen af 100 mM magnesiumchloridopløsning til de tomme rør, således at den endelige koncentration af magnesiumchlorid 1 mM efter opsamling af kinesin opløsning. Øjeblikkelig tilsætning af magnesiumchlorid hjælper stabilisatorSE nukleotid-fri kinesin.
- Eluere kinesin anvendelse af en passende Mg2 + fri buffer. Kinesins er ustabile, når fri for nukleotid så det er vigtigt at arbejde hurtigt. Opbevar nukleotid-fri kinesin på is og anvendes inden for 1-2 timer.
- Under eller før forberedelse af nukleotid-fri kinesin, udarbejde en mantATP koncentration serie i samme reaktion buffer som den endelige løsning af nukleotid-fri kinesin. Bestem række koncentrationer af mantATP kræves i henhold til den tilgængelige koncentration af kinesin med en typisk serie spænder fra 0,1 til 50 m (se trin 2.5 og diskussion).
- Forbered en koncentration række nukleotid-fri kinesin. For hver koncentration af mantATP (trin 2.4), bør koncentrationen af nukleotid-fri kinesin fremstilles således, at mant-mærket nukleotid er 5 til 10 gange molært overskud i forhold kinesin nucleotid bindingssteder.
- Indstil excitationsbølgelængden den stoppet-Flow fluorimeter til 365 nm og indsamle udsendte lys ved> 400 nm med en lang-pass-filter.
- Startende med den laveste koncentration af mantATP, blande mantATP med en passende koncentration af nukleotid-fri kinesin i en 1: 1 v / v-forholdet ved hjælp af en stopped-flow-fluorimeter (figur 3A og 3B indsat). Bemærk: Reaktanterne fortyndes med 50% ved blanding. Holde et notat af koncentrationen nukleotid både før og efter blanding (dvs. 3,0 / 1,5 uM) for at undgå forvirring.
- Monter ændring i fluorescens intensitet målt ved hver koncentration af mantATP til en eksponentiel funktion plus en linje af konstant negativ hældning til at redegøre for fotoblegning af MANT gruppen (dvs. fluorescens = A 0 .exp (k obs .T) + (m. t + C), hvor A 0 er amplituden k obs er hastighedskonstanten og t er tiden, se figur 3B og diskussion). Fra disse passer bestemme enhastighedskonstant (k obs) ved hver koncentration af mantATP. Hver k obs er en foldning af en forening og dissociationshastighedskonstant (figur 1, K 1 og K -1).
- Deconvolve associerings- og dissociationshastighedskonstanter ved at plotte k obs mod mantATP koncentration (f.eks, figur 3C). Monter disse data til en lineær funktion (dvs. k obs = k 1 [mantATP] + k -1) for at opnå gradient og y-aksen aksen. Gradienten repræsenterer hastighedskonstanten for mantATP forening (figur 1, K 1) med enhederne M -1 s -1. Den skæringspunkt repræsenterer dissociationshastighedskonstant (figur 1, k -1) med enheder med s -1 (se diskussionen). Bemærk: Denne fremgangsmåde kan også anvendes til at bestemme ADP foreningen og dissociationhastighedskonstanter (figur 1, k -4 og k 4) ved hjælp mantADP som nukleotid.
3. Måling af dissociationshastighedskonstant for mantADP
- Til en opløsning af 2 uM kinesin i en egnet reaktionsbuffer (fx 80 mM PIPES pH6.9, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 0,1% Tween 20), tilsættes 50 uM mantADP (slutkoncentration).
- Der inkuberes ved 25 ° C i 30 minutter.
- Fjern overskydende mantADP og andre fri nukleotid af bufferen udskifte kinesin til det valgte reaktionspuffer ved hjælp af en G-25 Sephadex-søjle (se listen af materialer) ifølge producentens anvisninger. Den kinesin motor domæne bør nu belastes med mantADP.
- Indstil excitationsbølgelængde på stoppet-flow-fluorimeter til 365 nm og opsamle udsendt lys ved> 400 nm under anvendelse af en lang-pass filter.
- Bland mantADP.kinesin komplekset (~ 1 uM) med en 50-fold eller større molar overskud af umærket ATP i en 1: 1 volumen / volumen-forholdet ved hjælp af en standset flow-fluorimeter (figur 4A og 4B indsat).
- Monter fald i fluorescens intensitet observeret over tid til en enkelt eksponentiel funktion plus en linje af konstant negativ hældning til at redegøre for fotoblegning af MANT gruppen (dvs. fluorescens = A 0 .exp (k obs .T) + (m.t + c), hvor A 0 er amplituden k obs er hastighedskonstanten og t er tiden, se figur 4B og diskussion). K obs bestemmes ud fra dette fit er hastighedskonstanten for dissociation af ADP (figur 1, k 4) med enheder af s -1 (se diskussionen).
Representative Results
En stigning i fluorescensintensitet mant gruppe typisk observeret ved binding af mant-mærket nukleotid til en kinesin. Men størrelsen af et sådant signal ændring er afhængig af den særlige kinesin pågældende. Derfor er det nyttigt at udføre ligevægt målinger for at bekræfte både tilstedeværelsen og størrelsen af en fluorescens-intensitet forandring før den udvikler sig til kinetiske analyser. Repræsentant fluorescens spektre for mantATP og mantADP, både i opløsning og i kompleks med kinesin-13, MCAK, er vist i figur 2B. Disse data fremhæve stigningen fluorescensintensitet vises af både mantATP og mantADP efter binding til MCAK. Ændringen i fluorescensintensitet efter binding af MANT nukleotid til en kinesin anvendes til at rapportere om foreningen og dissociation af både ATP og ADP (afsnit 2 og 3). I tilfælde af MCAK observeres en fluorescensintensitet forskel mellem mantATP.kinesin og mantADP.kinesin Figur 3A afbilder den reaktion, der opstår efter blanding mantATP med nukleotid-fri kinesin. Repræsentative data, der illustrerer stigningen i fluorescensintensitet, der opstår ved binding af mantATP til kinesin-13, er MCAK vist i figur 3B. Data for typen vist i figur 3B er opsamlet ved en række mantATP koncentrationer. Et plot af de hastighedskonstanter (k OBS) bestemmes versus mantATP koncentration er vist i figur 3C. Montering af disse data til en lineær funktion (dvs. k obs = k 1 [mantATP] + k -1) giver mulighed deconvolution hastighedskonstanterne der bidrager til k obs (trin 2.8). Derfor muliggør bestemmelse af både foreningen og den dissociationshastighedskonstant for mantATP (figur 1, K 1 og K 4A viser den reaktion, som forekommer efter blanding mantADP.kinesin med et overskud af umærket ATP. Dataene i figur 4B viser fluorescensintensiteten fald observeret for mantADP på afstandtagen fra kinesin-13, MCAK. Ved at montere denne data til en eksponentiel funktion (trin 3.6) hastighedskonstanten for dissociation af mantADP bestemmes direkte. 
Figur 2. Nukleotiderne mærket med fluorophoren methylanthraniloyl (mant) bruges til at isolere de enkelte trin i ATP omsætning cyklus. (A) Strukturen mantATP viser placeringen af den MANT fluorofor konjugeret til enten 2 'eller 3' position på ribose. (B) Normaliseret fluorescens spektre for mantATP og mantADP i opløsning (mAXP) og mantATP end mantADP i kompleks med kinesin MCAK (mATP + MCAK og mADP + MCAK). Den mantATP spektre er normaliseret til fluorescens ved max for mantATP i opløsning, og mantADP spektre er normaliseret til fluorescens ved Max til mantADP i opløsning. Spektrene for mant nukleotider blandet med MCAK opsamles ved 1 minutter efter blanding. Koncentrationen af reagenser og fluorimeter indstillinger som beskrevet i protokol trin 1.1 og 1.2. 
Figur 3. Måling af foreningen hastighedskonstanten af mantATP. (A) Skematisk afbilder den reaktion, der finder sted efter sammenblanding af stopped-flow: mantATP (mATP) binder til nukleotid-fri kinesin. Fluorescensintensiteten af MANT gruppe stiger efter binding til proteinet. (B) fluorescenssignal ændring (sort) observeret efter blanding mantATP (25 m) med MCAK (5 M nucleotide-fri). Disse data er egnet (rød stiplet) til en enkelt eksponentialfunktion plus en linje af konstant negativ hældning, som tegner sig for fotoblegning af mant fluorofor (se diskussionen) Indsat:. Indholdet af sprøjter før blanding på stoppet-flow-fluorimeter. (C) hastighedskonstanter (k OBS) bestemt for reaktion mantATP med nukleotid-fri MCAK plottet mod koncentrationen af mantATP. Dette plot vil have en lineær region med gradienten er foreningen hastighedskonstant (figur 1, k 1) med enheder med M-1s-1 og y-aksen er den dissociationshastighedskonstant (figur 1, k -1) med enheder af s -1. Klik her for at se en større version af dette tal.
. Figur 4. Måling af dissociationshastighedskonstant for mantADP (A) Skematisk afbilder den reaktion, der finder sted efter sammenblanding af stopped-flow: kinesin indlæst med mantADP fortyndes i et overskud af umærket ATP. Tidsforskyder mantADP erstattes af umærket ATP, hvilket forhindrer bagsiden reaktion mantADP forening (se diskussionen). Fluorescensintensiteten af MANT gruppen falder efter afstandtagen fra proteinet. (B) Fluorescens fald observeret ved dissociation af mantADP fra kinesin MCAK. Fluorescenssignalet (sort) er egnet (rød stiplet) til et enkelt eksponentiel plus en linje af konstant negativ hældning til at redegøre for fotoblegning af MANT gruppen (se diskussionen). Hastighedskonstanten bestemmes er hastighedskonstanten for dissociation af mantADP (figur 1, k4) Indsat:.. Indholdet af sprøjterne før blanding på en standset flow fluorimeter Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Her præsenterer vi protokoller til observation og analyse af kinetik overgange mellem nukleotid-stater for en kinesin. Disse protokoller udnytte hurtig blanding metode stopped-flow i forbindelse med fluorescens-mærkede nukleotider. Metoder af denne type er blevet anvendt i udstrakt grad til at studere nukleotidbindende og dissociation for en række kinesins 9-11,13-16. De beskrevne ikke tillader observation af phosphatfrigivelse (figur 1, trin 3) metoder. Imidlertid kan stoppet-flow-fluorescens anvendes til at observere denne overgang ved hjælp af en phosphat sensing protein til par produktion af phosphat til en fluorescensintensitet ændring 17. De metoder, der præsenteres brug nukleotider mærket med lille fluorofor methylanthraniloyl (mant), som generelt udviser en stigning i fluorescens intensitet når det er bundet til protein. Endvidere mant fluoroforen, når den er konjugeret til enten 2 'eller 3' position på ribose ofte har ringe eller ingen virkning på binding dissociation eller hydrolyse af nukleotid 9-12. Mant-mærkede nukleotider er let tilgængelige fra kommercielle kilder (se listen over materialer) og skal opfattes som blandinger af de 2 'og 3' konjugat da de hurtigt igen ækvilibrere når oprenset til en enkelt isomer 8. Mant-mærkede nukleotider gøre fremragende reportermolekyler, som kinetikken for nukleotidbindende og dissociering kan observeres.
Anvendelsen af fluorescens-mærkede nukleotider betyder, at udlæsning af de beskrevne assays er et tidstro ændring i fluorescensintensitet. Dette gør disse assays ideel til stopped-flow-fluorescens, som tillader hurtig blanding af reagenser og tidstro observation af ændringer i fluorescens, der er forbundet med den efterfølgende reaktion. Kombinationen af stopped-flow blanding teknik og fluorescens som metode til påvisning frembringer et system, der er relativt prøve efstrækkeligt. For eksempel, at erhverve de data vist i figur 3C kræver 0,8-1,0 mg oprenset kinesin-13, MCAK og at erhverve de data vist i figur 4B kræver ~ 0,3 mg oprenset kinesin-13, MCAK. En ulempe ved anvendelsen af mant som en fluorofor, er, at det er udsat for fotoblegning. Dette kan observeres i isolation fra kinesin reaktionskinetik ved at blande en opløsning af mant-mærket nukleotid med reaktionsbuffer, i fravær af kinesin i stopped-flow. En langsom nedgang i fluorescens intensitet observeres som MANT gruppen bliver bleget. Over området tidshorisonter anvendt i protokollerne fotoblegning af mant gruppe er godt beskrevet ved en lineær funktion. Derfor er en enkel måde at rette data for fotoblegning er at passe til en eksponentiel funktion med en baseline beskrives ved en lineær funktion (dvs. mt + C) snarere end den mere almindelige flad baseline beskrives ved en enkelt parameter.
mantATP binding
Ved måling hastighedskonstanter for foreningen og dissociation af mantATP (Afsnit 2) ADP, som forbliver forbundet med kinesin nukleotid-bindingssted i fravær af mikrotubuli, skal fjernes. Dette giver mantATP forening og dissociation (figur 1, trin 1), der skal overholdes i isolation fra ADP dissociation. For at opnå dette kinesin inkuberes med mindst et 50-fold overskud af EDTA i nucleotid-bindingssteder (trin 2.1). EDTA sequesters Mg2 + ioner forårsager Mg2 at dissociere fra nukleotid-bindende lomme, hvilket resulterer i frigivelse af nucleotid 11. Derfor, når udføre trin 2,1-2,3, er det afgørende at bruge en buffer fri for Mg2 +. Nukleotidsekvensen fri kinesin protein er bufferudskiftet at adskille den fra både fri nukleotid og fra EDTA. For at opnå denne adskillelse, en engangs tyngdekraft-flow-gel filtrering kolonne er tilstrækkelig, og er enkel og hurtig at bruge (se listen over materialer). Interaktionen af mantATP med nukleotid fri kinesin udføres ved en række mantATP koncentrationer (trin 2.4) for at muliggøre deconvolution af foreningen og dissociationshastighedskonstanter (trin 2.8). Teorien bag eksperimenter af denne type er godt beskrevet i reference 18. Ved udførelsen af disse eksperimenter man begynder med den laveste koncentration af mantATP. Dette fjerner behovet for vasketrin mellem forskellige koncentrationer. Det vil sandsynligvis være nødvendigt at justere følsomheden af stopped-flow fluorimeter da mantATP koncentrationen øges. MantATP koncentrationen skal altid være i mindst 5-fold overskud i forhold til koncentrationen af kinesin nukleotid- bindingssteder at opretholde pseudo første ordens betingelser. Da koncentrationen af mantATP forøges signalet ændring kan blive oversvømmet den fraktion af nukleotid, som binder til kinesin aftager. Therefore er koncentrationen af kinesin også steget for hver ny koncentration af mantATP sådan, at koncentrationen af mantATP er aldrig større end 10-fold molært overskud i forhold til nucleotid bindingssteder (trin 2.6).
mantADP Dissociation
Selv om foreningen og dissociationshastighedskonstanter for mantADP kan bestemmes ved samme metode beskrevet for mantATP (afsnit 2). Dissociation af ADP fra en kinesin direkte kan observeres ved forbelastning nucleotid-bindingssted med mantADP (trin 3,1-3,3) Den mantADP.kinesin kompleks blandes derefter med et overskud af umærket ATP (trin 3.5). Den overskydende umærket ATP forebygger gentilknytningsangreb af mantADP til kinesin og derved gør det muligt for dissociationsreaktion (figur 1, 4 r), der skal overholdes i isolation fra sammenslutning af mantADP. I dette assay koncentrationen af umærket ATP skal være mindst 50 gange molært overskud af nucleotide bindingssteder. Teorien bag dette assay er godt beskrevet i reference 18. Denne direkte metode giver en mere nøjagtig værdi for dissociationshastighedskonstant end ekstrapolering til y-aksen, der er beskrevet i trin 2.8.
Inddragelse af Mikrotubuli
De beskrevne metoder kan også anvendes til at bestemme kinetikken for nukleotidbindende og dissociation i nærværelse af mikrotubuli. Mikrotubuler introduceres til nukleotid indeholdende sprøjte før blanding i stopped-flow: den nederste sprøjten i figur 3B og 4B (Inlays). I denne konfiguration vil kinesin mødes nukleotidet på samme tid, som det opfylder mikrotubuli. Stabiliserede mikrotubuli anvendes, hvor levetiden for tubulin polymer forlænges ved anvendelse af enten en stabiliserende kemisk, såsom taxol eller et nonhydrolysable GTP analog, såsom guanosin-5'- [(α, β) -methyleno] trifosfat (GMPCPP, se listen over materialer). Det er muligt at anvende to cyklusser af tubulinpolymerisation med GMPCPP at mikrotubuli, der kan lagres i flere måneder i flydende nitrogen 9,19. Brugen af tilberedte mikrotubuli reducerer de praktiske vanskeligheder med at udføre disse analyser. For at inkludere mikrotubuli i assayene, er det vigtigt at anvende en reaktionsbuffer egnet til mikrotubuli stabilitet. Bufferen valg er PIPES bygger på, med de mest almindeligt anvendte buffer indeholdende 80 mm rør pH 6,9, 1 mM MgCl2 og 1 mM EGTA (kendt som BRB80) 20,21.
De beskrevne fremgangsmåder er ikke begrænset til brug med kinesins, men kan tilpasses og anvendes på enhver nukleotidbindende protein. For eksempel er der blevet anvendt lignende metoder til ATP omsætning cyklus af medlemmer af myosin familie af molekylære motorer 12,22 og brugen af mant mærket guanosin nukleotider udviderfremgangsmåder af denne type til GTP hydrolyse proteiner 23,24.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde støttes af bioteknologi og biologiske Sciences Research Council (BBSRC), Royal Society og University of Nottingham.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2’/3’-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5’triphosphate | Jena Biosciences | # NU-202 | mantATP |
| 2’/3’-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5’-diphosphate | Jena Biosciences | # NU-201 | mantADP |
| Mg-ATP | Roche | # 10519979001 | The disodium salt of ATP is made to a concentration of 100 mM in 100 mM MgCl2. Concentration should be verified by absorption at 260 nm (e = 15,400 M-1cm-1). Solution stored in aliquots at -20 oC. |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP120-500 | 0.5 M stock solution in water, pH 8.0. HAZARD: powder harmful if inhaled. |
| Dithiothreitol (DTT) | Melford | MB1015 | 1 M stock solution in water made fresh for use on the same day. HAZARD: powder harmful if inhaled or in contact with the skin. |
| NAP-5 column | GE Healthcare | # 17-0853 | G-25 sephadex resin gravity-flow gel filtration column |
| GMPCPP | Jena Biosciences | # NU-405 | nonhydrolysable analogue of GTP |
| Stopped-flow fluorimeter | Applied Photophysics | SX20 | A fluorimeter with some plumbing attached, which allows reagents to be rapidly mixed in the observation cuvette. Thereby allowing the kinetics of reactions on timescales of ~0.1 - 100 sec to be monitored. |
References
- Marx, A., Hoenger, A., Mandelkow, E.
- Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 682-696 (2009).
- Friel, C. T., Howard, J. Coupling of kinesin ATP turnover to translocation and microtubule regulation: one engine, many machines. J. Muscle Res. Cell Motil. 33, 377-383 (2012).
- Yun, M., Zhang, X., Park, C. G., Park, H. W., Endow, S. A. A structural pathway for activation of the kinesin motor ATPase. EMBO J. 20, 2611-2618 (2001).
- Hirose, K., Akimaru, E., Akiba, T., Endow, S. A., Amos, L. A. Large conformational changes in a kinesin motor catalyzed by interaction with microtubules. Mol. Cell. 23, 913-923 (2006).
- Kikkawa, M., et al.
- Friel, C. T., Bagshaw, C. R., Howard, J. Analysing the ATP turnover cycle of microtubule motors. Methods Mol. Biol. 777, 177-192 (2011).
- Bagshaw, C. ATP analogues at a glance. J. Cell Sci. 114, 459-460 (2001).
- Friel, C. T., Howard, J. The kinesin-13 MCAK has an unconventional ATPase cycle adapted for microtubule depolymerization. EMBO J. 30, 3928-3939 (2011).
- Gilbert, S. P., Webb, M. R., Brune, M., Johnson, K. A. Pathway of processive ATP hydrolysis by kinesin. Nature. 373, 671-676 (1995).
- Sadhu, A., Taylor, E. W.
- Woodward, S. K., Eccleston, J. F., Geeves, M. A. Kinetics of the interaction of 2'(3')-O-(N-methylanthraniloyl)-ATP with myosin subfragment 1 and actomyosin subfragment 1: characterization of two acto-S1-ADP complexes. Biochemistry. 30, 422-430 (1991).
- Hackney, D. D. Pathway of ADP-stimulated ADP release and dissociation of tethered kinesin from microtubules. Implications for the extent of processivity. Biochemistry. 41, 4437-4446 (2002).
- Lockhart, A., Cross, R. A. Kinetics and motility of the Eg5 microtubule motor. Biochemistry. 35, 2365-2373 (1996).
- Chen, C. J., Porche, K., Rayment, I., Gilbert, S. P. The ATPase pathway that drives the kinesin-14 Kar3Vik1 powerstroke. J. Biol. Chem. 287, 36673-36682 (2012).
- Moyer, M. L., Gilbert, S. P., Johnson, K. A. Pathway of ATP hydrolysis by monomeric and dimeric kinesin. Biochemistry. 37, 800-813 (1998).
- Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E., Direct Webb, M. R. real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase. Biochemistry. 33, 8262-8271 (1994).
- Goodrich, J. A., Kugel, J. F. Chapter 4. Binding and Kinetics for Molecular Biologists. 4, Cold Spring Harbour Laboratory Press. Cold Spring, NY. 69-97 (2006).
- Gell, C., et al. Microtubule dynamics reconstituted in vitro and imaged by single-molecule fluorescence microscopy. Methods Cell Biol. 95, 221-245 (2010).
- Olmsted, J. B., Borisy, G. G. Ionic and nucleotide requirements for microtubule polymerization in vitro. Biochemistry. 14, 2996-3005 (1975).
- Brinkley, W. Microtubules: a brief historical perspective. J. Struct Biol. 118, 84-86 (1997).
- Ostap, E. M., Pollard, T. D. Biochemical kinetic characterization of the Acanthamoeba myosin-I ATPase. J. Cell Biol. 132, 1053-1060 (1996).
- Eccleston, J. F., Moore, K. J., Brownbridge, G. G., Webb, M. R., Lowe, P. N. Fluorescence approaches to the study of the p21ras GTPase mechanism. Biochem. Soc. Trans. 19, 432-437 (1991).
- Ahmadian, M. R., Wittinghofer, A., Herrmann, C. Fluorescence methods in the study of small GTP-binding proteins. Methods Mol. Biol. 189, 45-63 (2002).
