Summary
Kinesins worden gekenmerkt door nucleotide-afhankelijke interactie met microtubuli: een cyclus van ATP omzet gekoppeld met een cyclus van microtubule interactie. We beschrijven hier protocollen om de kinetiek van afzonderlijke nucleotide overgangen in de ATP omzet cyclus van een kinesine met fluorescent gemerkte nucleotiden en gestopte stroming fluorescentie geanalyseerd.
Abstract
De kinesine superfamilie van microtubuli geassocieerde motorische eiwitten delen een karakteristieke motor domein dat zowel hydrolyseert ATP en bindt microtubuli. Kinesins weer verschillen tussen de superfamilie zowel in ATP omzet en in microtubuli interactie. Deze verschillen op maat specifieke kinesins om diverse functies zoals vrachtvervoer, microtubuli schuiven, microtubuli depolymerisatie en microtubuli stabilisatie. Om het werkingsmechanisme van een kinesine begrijpen is het belangrijk te begrijpen hoe de chemische cyclus van ATP omzet is gekoppeld met de mechanische cyclus van microtubuli interactie. De ATP omzet cyclus ontleden, een benadering om fluorescent gemerkte nucleotiden gebruiken om afzonderlijke stappen in de cyclus visualiseren. Het bepalen van de kinetiek van elk nucleotide overgang in de ATP omzet cyclus kan de snelheidsbeperkende stap of stappen voor de gehele cyclus te identificeren. Voor een kinesine, is het belangrijk om de snelheidsbeperkende stap kennen, inAangezien microtubules, zoals deze stap wordt gewoonlijk versneld duizenden voudig indien de kinesine interageert met microtubules. De cyclus in afwezigheid van microtubuli wordt vergeleken met die in de aanwezigheid van microtubuli volledig begrijpen kinesine ATP omzet cyclus. De kinetiek van afzonderlijke nucleotide overgangen doorgaans te snel waarnemen handmatig mengen reagentia, met name in aanwezigheid van microtubules. Een snelle menginrichting, zoals een gestopte stroming fluorimeter, waardoor kinetiek worden waargenomen op tijdschalen van slechts enkele milliseconden, kan worden gebruikt om dergelijke overgangen te controleren. We beschrijven hier protocollen waarin snelle menging van reagentia gestopte stroming wordt gebruikt in combinatie met fluorescent gemerkte nucleotiden ATP omzet cyclus van kinesine ontleden.
Introduction
De kinesins zijn een superfamilie van eiwitten gekenmerkt door een zeer geconserveerd domein motor 1. De kinesine motor domein interageert met microtubuli in een nucleotide-afhankelijke wijze. Leden van de kinesine familie te tonen een scala aan functies uit translocerende kinesins, die lading in een gerichte manier langs microtubuli, aan niet-translocerende microtubuli-end binding kinesins, die microtubuli dynamiek 2,3 reguleren.
Kinesins gebruik maken van de omzet van adensosine-5'-trifosfaat (ATP) om hun interactie met de microtubuli cytoskelet 4-6 reguleren. De conformatie van het kinesine motor domein en daardoor de affiniteit voor het microtubule afhankelijk van de nucleotide toestand: ATP, ADP kan, ADP.Pi of geen nucleotide gebonden (figuur 1). Naar het moleculaire mechanisme van een kinesine begrijpen, is een goed begrip van de relatie tussen ATP omzet en microtubuli interactie vereist. Hetor wij, een hoofddoel van het veld kinesine betreft de functionele eigenschappen van verschillende nucleotide staten en de kinetiek van de overgangen tussen twee in de aanwezigheid en afwezigheid van microtubuli karakteriseren.
Figuur 1 De eenvoudigste ATP omzet cyclus een kinesine bestaat uit vier mogelijke toestanden: nucleotide-free (Φ), ATP-gebonden, ADP.P i -gebonden en ADP-gebonden Elk van de vier transities gekenmerkt door een voorwaartse en. achteruit snelheidsconstante (k x respectievelijk k -x).
Om te begrijpen hoe de chemische cyclus van ATP omzet is gekoppeld met de mechanische cyclus van microtubuli interactie moet een die stap in de ATP omzet cyclus bepalen is snelheidsbepalend bij afwezigheid van microtubules en bepalen hoe de cyclus wordt veranderd door de aanwezigheid van microtubules. De eenvoudigste ATP omzet cyclus bestaat uit vier afzonderlijke chemische stappen: (1) ATP binding aan de lege plaats (Φ geeft de lege plaats, dat wil zeggen, nucleotide-free kinesine); (2) ATP splitsing; (3) fosfaat dissociatie en (4) ADP dissociatie (figuur 1). De snelheidsbeperkende stap stelt de snelheidsconstante voor de volledige ATP omzet cyclus. Derhalve, om te bepalen welke stap is snelheidsbepalend elk van de afzonderlijke overgangen worden gemeten en vergeleken met de snelheidsconstante voor de gehele cyclus. Methoden om de totale ATP omzet cyclus constant worden hier niet beschreven te meten maar kan worden gevonden referentie 7 Hier beschrijven we methoden waarmee rate constanten voor de afzonderlijke chemische stappen kan worden bepaald. Er zijn verschillende methoden om individuele overgangen bestuderen in de omzet cyclus van een nucleotide hydrolyseren eiwit. De hier gepresenteerde methoden nemen advantage van de eigenschappen van nucleotiden gemerkt met de fluorofoor methylanthraniloyl, meestal aangeduid als mant, die een verandering in fluorescentie-intensiteit weer bij binding aan eiwit 8. De mant wordt gebruikt, omdat het kleine formaat betekent dat, indien gekoppeld aan de ribose (figuur 2A), moet gewoonlijk weinig of geen effect op de kinetiek van nucleotide binding of hydrolyse 9-12. Hier presenteren we protocollen die het gebruik van gemerkte nucleotiden-mant, samen met gestopte stroming fluorescentie, observatie van nucleotide binding en dissociatie mogelijk in de ATP omzet cyclus van kinesine.
Protocol
1 Bepaling van de Fluorescence Intensity Verandering van binding van Mant-gemerkt nucleotide.
- Voeg 1 uM-mant gelabelde nucleotide tot 1 uM kinesine (uiteindelijke concentraties) in een passende reactie buffer. Typisch een buffer die de groei en stabiliteit van microtubuli voordelen wordt gebruikt (zie bespreking). Een algemeen gebruikte buffer bevat 80 mM piperazine-bis-2-ethaansulfonzuur (PIPES) pH6.9, 1 mM MgCl2 en 1 mM ethyleenglycol-bis-2 aminoether-azijnzuur (EGTA).
Opmerking: De concentratie van kinesine vermeld in alle protocollen betrekking op de concentratie van nucleotide bindingsplaatsen (dwz motor domeinen). Verschillende kinesins bestaan als monomeren, dimeren of tetrameren en kan dus meer dan een nucleotide bindingsplaats per molecuul bevatten. - Na een incubatieperiode (1-3 min) en bij een standaard fluorimeter meet het emissiespectrum voor-mant gelabelde nucleotide kinesine complex. Gebruik een excitatie golflengte van 365nm enmaatregel uitgestraalde licht 400-500 nm in stappen van 1 nm.
- Voeg een oplossing van 1 mM mant gelabelde nucleotide in dezelfde reactiebuffer in stap 1.1.
- Meet het emissiespectrum van de mant nucleotide enkel monster, zoals eerder beschreven (zie stap 1.2).
- Normaliseren van de spectra om het signaal bij de golflengte van maximale fluorescentie intensiteit van het spectrum van mant nucleotide in oplossing (dus zonder kinesine) door te delen door de waarde.
- Plot de genormaliseerde spectra (bijvoorbeeld Figuur 2B) om fluorescentie-intensiteit verschillen tussen de mantATP-gebonden en / of mantADP-gebonden kinesine en mant nucleotide in oplossing te observeren.
2 Meting van de vereniging en dissociatiesnelheidsconstanten voor mantATP
- Aan een oplossing van 20 uM kinesine (zie bespreking) in passende Mg2 + -vrije buffer (bijvoorbeeld 80 mM PIPES pH6.9, 1 mM EGTA, 0.1% Tween20), voeg 1mM (eindconcentratie) ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) en 1 mM (eindconcentratie) dithiothreitol (DTT). Opmerking: Toevoeging van Tween20 de buffer wordt aanbevolen als het vermindert / voorkomt dat kinesine eiwit op de kolom voor bufferuitwisseling (Stappen 2.3 en 3.3)
- Incubeer de oplossing bij 25 ° C gedurende 15 minuten.
- Aparte vrije nucleotide en EDTA uit de kinesine met een zwaartekracht G-25 sephadex gelfiltratiekolom volgens de instructies van de fabrikant (zie lijst van materialen).
- Equilibreer de kolom met ten minste 3 kolomvolumes passende Mg2 + -vrije buffer (zie Stap 2.1). Laad de kinesine-bevattende oplossing op de kolom. Bereid een verzamelbuis door toevoeging van een geschikt volume van 100 mM magnesiumchloride oplossing van de lege buis, zodat de uiteindelijke concentratie van magnesium chloride 1 mM na verzameling van het kinesine oplossing. Onmiddellijke toevoeging van magnesiumchloride helpt stabilise de-nucleotide gratis kinesine.
- Elueren de kinesine met een geschikte Mg 2 + -vrij buffer. Kinesins zijn onstabiel als vrij van nucleotide dus is het belangrijk om snel te werken. Bewaar de nucleotide gratis kinesine op ijs en binnen 1-2 uur.
- Tijdens of voorafgaand aan de bereiding van nucleotide vrij kinesine, stelt een mantATP concentratiereeks in dezelfde reactiebuffer als de uiteindelijke oplossing van nucleotide-free kinesine. Bepaal het concentratiebereik van mantATP nodig, overeenkomstig de beschikbare concentratie van kinesine met een typische reeks van 0,1 tot 50 pm (zie stap 2.5 en discussie).
- Bereid een concentratiereeks van nucleotide-free kinesine. Voor elke concentratie van mantATP (Stap 2.4), moet een concentratie van nucleotiden free kinesine zodat het gemerkte nucleotide-mant in 5 tot 10-voudige molaire overmaat ten opzichte kinesine nucleotide bindingsplaatsen worden bereid.
- Stel de golflengte op de gestopte-flow fluorimeter tot 365 nm en het verzamelen van uitgezonden licht bij> 400 nm met behulp van een lange-pass filter.
- Beginnend met de laagste concentratie van mantATP, meng de mantATP met een geschikte concentratie van nucleotiden vrij kinesine in een 1: 1 v / v verhouding met een gestopte stroming fluorimeter (figuur 3A en 3B Inzet). Opmerking: De reactanten worden verdund met 50% na mengen. Houd een nota van de nucleotide concentratie zowel voor als na het mengen (dwz 3,0 / 1,5 uM) om verwarring te voorkomen.
- Passen bij de verandering in de fluorescentie-intensiteit gemeten bij elke concentratie van mantATP een exponentiële functie en een lijn van constante negatieve helling om rekening te houden fotobleken van de mant-groep (dwz, Fluorescentie = A 0 .exp (k obs .t) + (m. t + c), waar een 0 is de amplitude, k obs is de snelheid constant is en t de tijd, zie figuur 3B en discussie). Uit deze past bepalen eensnelheidsconstante (k obs) bij elke concentratie van mantATP. Elke k obs is een convolutie van een vereniging en dissociatiesnelheidsconstante (Figuur 1, k 1 en k -1).
- Deconvolutie van de vereniging en dissociatiesnelheidsconstanten door het plotten van k obs tegen mantATP concentratie (bijvoorbeeld Figuur 3C). Bevestig deze gegevens een lineaire functie (bijvoorbeeld, k obs = k 1 [mantATP] + k -1) de helling en de y-as intercept verkrijgen. De gradiënt is de snelheidsconstante voor mantATP vereniging (Figuur 1, k 1) met de eenheden M -1 s -1. Het intercept geeft de dissociatiesnelheidsconstante (Figuur 1, k -1) met eenheden van s -1 (zie bespreking). Opmerking: Deze benadering kan ook worden toegepast op de ADP associatie en dissociatie bepalensnelheidconstanten (Figuur 1, k -4 en k 4) met behulp van mantADP als de nucleotide.
3 Meting van de dissociatiesnelheidsconstante voor mantADP
- Aan een oplossing van 2 uM kinesine in een geschikte reactiebuffer (bijvoorbeeld 80 mM PIPES pH6.9, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 0.1% Tween20), voeg 50 uM mantADP (eindconcentratie).
- Incubeer bij 25 ° C gedurende 30 minuten.
- Verwijder overtollig mantADP en andere vrije nucleotide door buffer uitwisseling kinesine in de gekozen reactiebuffer met een G-25 Sephadex-kolom (zie materialen) volgens de instructies van de fabrikant. De kinesine motor domeinnaam moet nu worden geladen met mantADP.
- Stel de golflengte op de gestopte-flow fluorimeter tot 365 nm en het verzamelen van uitgezonden licht bij> 400 nm met behulp van een lange-pass filter.
- Meng de mantADP.kinesin complex (~ 1 uM) met een 50-voudige of meer molar overmaat ongelabeld ATP in een 1: 1 v / v verhouding met een gestopte stroming fluorimeter (figuur 4A en 4B Inzet).
- Passen bij de afname van de fluorescentie-intensiteit waargenomen in de tijd om een enkele exponentiële functie plus een lijn van constante negatieve helling om rekening te houden fotobleken van de mant-groep (dat wil zeggen, Fluorescentie = A 0 .exp (k obs .t) + (m.t + c), waar een 0 is de amplitude, k obs is de snelheid constant is en t de tijd, zie figuur 4B en discussie). De k obs afgeleid uit deze fit is de snelheidsconstante voor de dissociatie van ADP (figuur 1, k 4) met eenheden van s -1 (zie bespreking).
Representative Results
Een toename in fluorescentie-intensiteit van de mant groep typisch waargenomen na binding van gemerkt nucleotide-mant een kinesine. De omvang van een dergelijk signaal veranderingen vereist de specifieke kinesine betrokken. Daarom is het nuttig evenwicht metingen zowel de aanwezigheid en grootte van een fluorescentie-intensiteit te bevestigen alvorens aan kinetische testen. Representatieve fluorescentie spectra voor mantATP en mantADP, zowel in oplossing als in complex met de kinesine-13, MCAK, worden getoond in figuur 2B. Deze gegevens wijzen op de toename van de fluorescentie-intensiteit wordt weergegeven door zowel mantATP en mantADP na binding aan MCAK. De verandering in de fluorescentie-intensiteit na binding van mant nucleotide een kinesine wordt gebruikt om te rapporteren over de vereniging en dissociatie van zowel ATP en ADP (afdelingen 2 en 3). Bij MCAK, wordt een fluorescentie-intensiteit waargenomen verschil tussen mantATP.kinesin en mantADP.kinesin Figuur 3A toont de reactie die optreedt na mengen mantATP met nucleotide free kinesine. Representatieve gegevens illustreren de toename in fluorescentie-intensiteit die optreedt na binding van mantATP de kinesine-13 MCAK wordt getoond in figuur 3B. Gegevens van de in figuur 3B type wordt verzameld op verschillende mantATP concentraties. Een plot van de snelheidsconstanten (k obs) bepaald versus mantATP concentratie wordt weergegeven in Figuur 3C. Montage van deze gegevens aan een lineaire functie (dat wil zeggen, k obs = k 1 [mantATP] + k -1) maakt deconvolutie van het tarief constanten die bijdragen aan obs (Stap 2.8) k. Daarom, waardoor de bepaling van zowel de vereniging en de dissociatie snelheidsconstante voor mantATP (Figuur 1, k 1 en k Figuur 4A toont de reactie die plaatsvindt na mengen mantADP.kinesin met een overmaat ongelabeld ATP. De gegevens in Figuur 4B toont de fluorescentie-intensiteit daling waargenomen mantADP bij dissociatie van het kinesine-13, MCAK. Door toepassing van deze gegevens aan een exponentiele functie (stap 3.6) de snelheidsconstante voor dissociatie van mantADP direct bepaald. 
Figuur 2 nucleotiden gemerkt met de fluorofoor methylanthraniloyl (mant) worden gebruikt om individuele stappen in de ATP omzet cyclus isoleren. (A) Structuur van mantATP die de positie van de mant fluorofoor geconjugeerd aan ofwel de 2 'of 3' positie op de ribose. (B) genormaliseerde fluorescentie spectra voor mantATP en mantADP in oplossing (maxp) en een mantATPd mantADP in complex met de kinesine MCAK (mATP + MCAK en MADP + MCAK). De mantATP spectra zijn genormaliseerd om de fluorescentie bij max voor mantATP in oplossing en de mantADP spectra zijn genormaliseerd om de fluorescentie bij max voor mantADP in oplossing. De spectra van de mant nucleotiden gemengd met MCAK worden verzameld op 1 min na menging. De concentratie van de reagentia en fluorimeter instellingen worden zoals beschreven in het protocol de stappen 1.1 en 1.2. 
Figuur 3 Meting van de vereniging snelheidsconstante van mantATP. (A) Schematische afbeelding van de reactie die plaatsvindt na de menging door gestopt-flow: mantATP (mATP) bindt met nucleotide-vrije kinesine. De fluorescentie-intensiteit van de mant groep toeneemt bij binding aan het eiwit. (B) Fluorescentie signaalwisseling (zwart) waargenomen na mengen mantATP (25 M) met MCAK (5 M nu-cleotide gratis). Deze data is fit (rode stippellijnen) om een enkele exponentiële functie plus een lijn van constante negatieve helling, die goed is voor fotobleken van de mant fluorofoor (zie bespreking) Inzet:. Inhoud van de spuiten voor het mengen van de gestopte-flow fluorimeter. (C) Snelheidsconstanten (k obs) bepaald voor de reactie van mantATP met nucleotide free MCAK uitgezet tegen de concentratie van mantATP. Dit perceel zal een lineaire gebied met het verloop dat de vereniging snelheidsconstante (Figuur 1, k 1) met eenheden van M -1 s -1 en de y-as wordt de dissociatiesnelheidsconstante (Figuur 1, k -1) met zijn eenheden van s -1. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
. Figuur 4 Meting van de dissociatie snelheidsconstante voor mantADP (A) Schematische afbeelding van de reactie die plaatsvindt na de menging door gestopt-flow: kinesine voorgeladen met mantADP wordt in een overmaat van niet-gemerkte ATP verdund. Dissociëren mantADP wordt vervangen door niet-gemerkte ATP, waardoor de achterkant reactie van mantADP vereniging (zie bespreking) voorkomen. De fluorescentie-intensiteit van de mant groep afneemt bij dissociatie van het eiwit. (B) Fluorescentie afname waargenomen na de dissociatie van mantADP de kinesine MCAK. De fluorescentie-signaal (zwart) is fit (rode stippellijn) tot een enkele exponentiële plus een lijn van constante negatieve helling om rekening te houden fotobleken van de mant-groep (zie bespreking). De snelheidsconstante bepaald is de snelheidsconstante voor dissociatie van mantADP (figuur 1, k4) Inzet:.. Inhoud van de spuiten voor het mengen op een gestopte-flow fluorimeter Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Discussion
Hier presenteren we protocollen voor observatie en analyse van de kinetiek van de overgangen tussen nucleotide staten voor een kinesine. Deze protocollen maken gebruik van de snelle menging werkwijze gestopte stroming in combinatie met fluorescent gelabelde nucleotiden. Werkwijzen van dit type zijn uitgebreid gebruikt nucleotide binding en dissociatie van diverse kinesins 9-11,13-16 studeren. De beschreven hebben waarneming van fosfaat afgifte (Figuur 1, stap 3) niet toe methoden. Echter, gestopte stroming fluorescentie gebruikt om deze overgang zien met een fosfaat sensing eiwit te koppelen van de productie van fosfaat een fluorescentie-intensiteit verandering 17. De werkwijzen voorgesteld gebruik nucleotiden gelabeld met de kleine fluorofoor methylanthraniloyl (mant), die in het algemeen vertonen een toename in fluorescentie-intensiteit wanneer gebonden aan eiwit. Bovendien mant fluorofoor, wanneer geconjugeerd aan ofwel de 2 'of 3' positie op de ribose, heeft vaak weinig of geen effect op de binding, dissociatie of hydrolyse van de nucleotide 9-12. Mant-gemerkte nucleotiden zijn verkrijgbaar bij commerciële bronnen (zie materialen) en worden als mengsels van de 2 'en 3' conjugaat ze snel opnieuw in evenwicht wanneer gezuiverd tot een enkel isomeer 8. -Mant gemerkte nucleotiden maken uitstekende reporter moleculen waarbij de kinetiek van nucleotide binding en dissociatie kan worden waargenomen.
Het gebruik van fluorescent gemerkte nucleotiden betekent dat het uitlezen van de beschreven assays is een realtime verandering in fluorescentie-intensiteit. Dit maakt deze assays geschikt voor gestopte stroming fluorescentie, die snelle menging van de reagentia en real time waargenomen veranderingen in fluorescentie geassocieerd met de daaropvolgende reactie mogelijk maakt. De combinatie van gestopte stroming als de mengtechniek en fluorescentie als detectiemethode vormt een systeem dat relatief sample efdoende. Om bijvoorbeeld de in figuur 3C gegevens door nodig 0,8-1,0 mg gezuiverd kinesine-13, MCAK, en de in figuur 4B gegevens door nodig ~ 0,3 mg gezuiverd kinesine-13, MCAK. Een nadeel van het gebruik van mant als een fluorofoor is dat het gevoelig voor fotobleken. Dit kan worden waargenomen los van kinesine reactiekinetiek door een oplossing van gemerkt nucleotide-mant met reactiebuffer, in afwezigheid van kinesine, in de gestopte stroming. Een langzame afname in fluorescentie-intensiteit waargenomen als de mant groep wordt gebleekt. Over het bereik van termijnen in de beschreven fotobleken van de mant groep protocollen wordt goed beschreven door een lineaire functie. Daarom is een eenvoudige manier de gegevens voor fotobleken correct past een exponentiële functie met een uitgangswaarde beschreven door een lineaire functie (dwz mt + c) in plaats van de gebruikelijke vlakke basislijn, beschreven door een enkele parameter.
mantATP bindend
Bij het meten van snelheidsconstanten van associatie en dissociatie van mantATP (deel 2) de ADP, dat geassocieerd blijft met het kinesine-nucleotide bindingsplaats in afwezigheid van microtubuli, worden verwijderd. Dit maakt mantATP vereniging en dissociatie (Figuur 1, stap 1) in acht worden genomen los van ADP dissociatie. Om dit te bereiken de kinesine wordt geïncubeerd met tenminste een 50-voudige overmaat van EDTA op nucleotide bindingsplaatsen (Stap 2.1). De EDTA sequesters Mg2 +-ionen veroorzaken Mg2 + dissociëren van de nucleotide-bindende pocket, waardoor afgifte van de nucleotide 11. Daarom, bij het uitvoeren van de stappen 2,1-2,3, is het essentieel om een buffer vrij van Mg 2 + gebruiken. De nucleotide-free kinesine eiwit buffer uitgewisseld te scheiden zowel vrij nucleotide en van EDTA. Om deze scheiding, een wegwerp zwaartekracht-stroom ge volbrengenl filtratie kolom is voldoende en is eenvoudig en snel te gebruiken (zie de lijst van materialen). De interactie van mantATP met nucleotide gratis kinesine wordt uitgevoerd bij een reeks mantATP concentraties (Stap 2.4) uitgevoerd om deconvolutie van de vereniging en dissociatiesnelheidsconstanten (Stap 2.8) in te schakelen. De theorie achter de experimenten van dit type wordt ook beschreven in referentie 18 Bij het uitvoeren van deze experimenten men begint met de laagste concentratie mantATP. Dit neemt de noodzaak voor wasstappen tussen de verschillende concentraties. Het zal waarschijnlijk nodig zijn om de gevoeligheid van de gestopte stroming fluorimeter aanpast wanneer de mantATP concentratie wordt verhoogd. De mantATP concentratie moet altijd minstens 5-voudige overmaat ten opzichte van de concentratie van kinesine nucleotide bindingsplaatsen aan pseudo eerste orde te handhaven. Aangezien de concentratie van mantATP toeneemt, de signaalverandering kan raken overspoeld als de fractie van nucleotide dat bindt aan afneemt kinesine. Therefore, wordt de concentratie van het kinesine ook verhoogd voor elke concentratie mantATP zodat de concentratie van mantATP nooit groter dan 10-voudige molaire overmaat ten opzichte van nucleotide bindingsplaatsen (Stap 2.6).
mantADP Dissociatie
Hoewel associatie en dissociatie snelheidsconstanten voor mantADP kan worden bepaald volgens dezelfde methode beschreven voor mantATP (deel 2). Dissociatie van ADP van een kinesine kan direct worden waargenomen door preloading de nucleotide-bindingsplaats met mantADP (stappen 3.1-3.3) De mantADP.kinesin complex wordt vervolgens gemengd met een overmaat ongelabeld ATP (stap 3.5). De overmaat ongelabelde ATP voorkomt opnieuw inbinden van mantADP aan de kinesine en daardoor kan de dissociatie reactie (Figuur 1, k 4) in acht te nemen, los van vereniging van mantADP. In deze test moet de concentratie ongemerkt ATP tenminste een 50-voudige molaire overmaat nuc zijnleotide bindingsplaatsen. De theorie achter deze assay wordt goed beschreven in referentie 18 Deze directe methode geeft een nauwkeuriger waarde voor de dissociatiesnelheidsconstante dan de extrapolatie naar de y-as in stap 2.8 beschreven.
Opname van microtubuli
De beschreven werkwijzen kunnen ook worden gebruikt om de kinetiek van nucleotide binding en dissociatie bepaald in aanwezigheid van microtubules. Microtubuli kennis met de nucleotide met spuit voor het mengen in de gestopte stroming: de onderste spuit in figuur 3B en 4B (Inlegwerk). In deze configuratie zal de kinesine de nucleotide aan op hetzelfde moment als het voldoet aan de microtubules. Gestabiliseerde microtubuli worden gebruikt, waarbij de levensduur van de tubuline polymeer wordt verlengd door het gebruik van ofwel een stabilisatie chemische, zoals taxol of een nonhydrolysable GTP analoog, zoals guanosine-5 '- [(α, β) -methyleno] trifosfaat (GMPCPP, zie lijst van materialen). Het is mogelijk om twee cycli van tubuline polymerisatie met GMPCPP om microtubuli die kan worden opgeslagen gedurende vele maanden in vloeibare stikstof 9,19 maken. Het gebruik van vooraf bereide microtubuli vermindert significant de praktische problemen bij het uitvoeren van deze testen. Om microtubuli in de assays omvatten, is het belangrijk om een reactie buffer geschikt voor microtubule stabiliteit te gebruiken. De buffer van keuze is gebaseerd PIPES, de meest gebruikte buffer die 80 mM PIPES pH 6,9, 1 mM MgCl2 en 1 mM EGTA (zogenaamde BRB80) 20,21.
De beschreven werkwijzen zijn niet beperkt tot gebruik met kinesins, maar kan worden aangepast en toegepast op elke nucleotide bindend eiwit. Zo zijn soortgelijke werkwijzen toegepast op de ATP omzet cyclus van leden van de familie van myosine moleculaire motoren 12,22 en het gebruik van mant gemerkte guanosine nucleotiden breidtmethoden van dit type GTP hydrolyse van eiwitten 23,24.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door de Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC), de Royal Society en de Universiteit van Nottingham.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2’/3’-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5’triphosphate | Jena Biosciences | # NU-202 | mantATP |
| 2’/3’-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5’-diphosphate | Jena Biosciences | # NU-201 | mantADP |
| Mg-ATP | Roche | # 10519979001 | The disodium salt of ATP is made to a concentration of 100 mM in 100 mM MgCl2. Concentration should be verified by absorption at 260 nm (e = 15,400 M-1cm-1). Solution stored in aliquots at -20 oC. |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP120-500 | 0.5 M stock solution in water, pH 8.0. HAZARD: powder harmful if inhaled. |
| Dithiothreitol (DTT) | Melford | MB1015 | 1 M stock solution in water made fresh for use on the same day. HAZARD: powder harmful if inhaled or in contact with the skin. |
| NAP-5 column | GE Healthcare | # 17-0853 | G-25 sephadex resin gravity-flow gel filtration column |
| GMPCPP | Jena Biosciences | # NU-405 | nonhydrolysable analogue of GTP |
| Stopped-flow fluorimeter | Applied Photophysics | SX20 | A fluorimeter with some plumbing attached, which allows reagents to be rapidly mixed in the observation cuvette. Thereby allowing the kinetics of reactions on timescales of ~0.1 - 100 sec to be monitored. |
References
- Marx, A., Hoenger, A., Mandelkow, E.
- Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 682-696 (2009).
- Friel, C. T., Howard, J. Coupling of kinesin ATP turnover to translocation and microtubule regulation: one engine, many machines. J. Muscle Res. Cell Motil. 33, 377-383 (2012).
- Yun, M., Zhang, X., Park, C. G., Park, H. W., Endow, S. A. A structural pathway for activation of the kinesin motor ATPase. EMBO J. 20, 2611-2618 (2001).
- Hirose, K., Akimaru, E., Akiba, T., Endow, S. A., Amos, L. A. Large conformational changes in a kinesin motor catalyzed by interaction with microtubules. Mol. Cell. 23, 913-923 (2006).
- Kikkawa, M., et al.
- Friel, C. T., Bagshaw, C. R., Howard, J. Analysing the ATP turnover cycle of microtubule motors. Methods Mol. Biol. 777, 177-192 (2011).
- Bagshaw, C. ATP analogues at a glance. J. Cell Sci. 114, 459-460 (2001).
- Friel, C. T., Howard, J. The kinesin-13 MCAK has an unconventional ATPase cycle adapted for microtubule depolymerization. EMBO J. 30, 3928-3939 (2011).
- Gilbert, S. P., Webb, M. R., Brune, M., Johnson, K. A. Pathway of processive ATP hydrolysis by kinesin. Nature. 373, 671-676 (1995).
- Sadhu, A., Taylor, E. W.
- Woodward, S. K., Eccleston, J. F., Geeves, M. A. Kinetics of the interaction of 2'(3')-O-(N-methylanthraniloyl)-ATP with myosin subfragment 1 and actomyosin subfragment 1: characterization of two acto-S1-ADP complexes. Biochemistry. 30, 422-430 (1991).
- Hackney, D. D. Pathway of ADP-stimulated ADP release and dissociation of tethered kinesin from microtubules. Implications for the extent of processivity. Biochemistry. 41, 4437-4446 (2002).
- Lockhart, A., Cross, R. A. Kinetics and motility of the Eg5 microtubule motor. Biochemistry. 35, 2365-2373 (1996).
- Chen, C. J., Porche, K., Rayment, I., Gilbert, S. P. The ATPase pathway that drives the kinesin-14 Kar3Vik1 powerstroke. J. Biol. Chem. 287, 36673-36682 (2012).
- Moyer, M. L., Gilbert, S. P., Johnson, K. A. Pathway of ATP hydrolysis by monomeric and dimeric kinesin. Biochemistry. 37, 800-813 (1998).
- Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E., Direct Webb, M. R. real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase. Biochemistry. 33, 8262-8271 (1994).
- Goodrich, J. A., Kugel, J. F. Chapter 4. Binding and Kinetics for Molecular Biologists. 4, Cold Spring Harbour Laboratory Press. Cold Spring, NY. 69-97 (2006).
- Gell, C., et al. Microtubule dynamics reconstituted in vitro and imaged by single-molecule fluorescence microscopy. Methods Cell Biol. 95, 221-245 (2010).
- Olmsted, J. B., Borisy, G. G. Ionic and nucleotide requirements for microtubule polymerization in vitro. Biochemistry. 14, 2996-3005 (1975).
- Brinkley, W. Microtubules: a brief historical perspective. J. Struct Biol. 118, 84-86 (1997).
- Ostap, E. M., Pollard, T. D. Biochemical kinetic characterization of the Acanthamoeba myosin-I ATPase. J. Cell Biol. 132, 1053-1060 (1996).
- Eccleston, J. F., Moore, K. J., Brownbridge, G. G., Webb, M. R., Lowe, P. N. Fluorescence approaches to the study of the p21ras GTPase mechanism. Biochem. Soc. Trans. 19, 432-437 (1991).
- Ahmadian, M. R., Wittinghofer, A., Herrmann, C. Fluorescence methods in the study of small GTP-binding proteins. Methods Mol. Biol. 189, 45-63 (2002).
