Användning av stoppat flöde Fluorescens och märkta nukleotider Analysera ATP Omsättning cyklar av kinesiner

Summary

Kinesiner kännetecknas av nukleotid beroende interaktion med mikrotubuli: en cykel av ATP omsättning kopplad till en cykel av mikrotubuli interaktion. Här beskriver vi protokoll för att analysera kinetiken för enskilda nukleo övergångar i ATP-omsättning cykel av en kinesin med användning av fluorescensmärkta nukleotider och stoppat flöde fluorescens.

Abstract

Den kinesin superfamiljen av mikrotubuli associerade motorproteiner har en gemensam egenskap motor domän som både hydrolyserar ATP och binder mikrotubuli. Kinesiner visa skillnader inom super både ATP omsättning och i mikrotubuli interaktion. Dessa skillnader skräddarsy specifika kinesiner till olika funktioner såsom lasttransport, mikrotubuli glidande, mikrotubuli depolymeriseringen och mikrotubuli stabilisering. För att förstå verkningsmekanismen för en kinesin det är viktigt att förstå hur den kemiska cykeln av ATP-omsättning är kopplad till den mekaniska cykeln av mikrotubuli interaktion. Att dissekera ATP omsättningen cykeln, är en metod att använda fluorescerande nukleotider att visualisera enskilda steg i cykeln. Fastställande kinetiken för varje nukleotid övergången i omsättningscykeln ATP gör det hastighetsbegränsande steget eller stegen för hela cykeln för att kunna identifieras. För en kinesin, är det viktigt att känna till hastighetsbegränsande steget ifrånvaron av mikrotubuli, eftersom detta steg är generellt snabbare flera tusen gånger när kinesin interagerar med mikrotubuli. Cykeln i avsaknad av mikrotubuli jämförs sedan med att i närvaro av mikrotubuli till fullo förstå en kinesin ATP omsättning cykel. Kinetiken för enskilda nukleo övergångar är i allmänhet alltför snabb för att observera genom att manuellt blanda reaktanterna, i synnerhet i närvaro av mikrotubuli. En snabb blandning enhet, till exempel en stoppad-flöde fluorimeter, vilket gör att kinetik iakttas om tidsskalor för så lite som några millisekunder, kan användas för att övervaka sådana övergångar. Här beskriver vi protokoll där snabb blandning av reagens genom stoppad-flöde används i kombination med fluorescerande nukleotider att dissekera ATP omsättningen cykel av en kinesin.

Introduction

De kinesiner är en superfamilj av proteiner som kännetecknas av ett starkt konservativa motor domän ^1. Den kinesin motor domän interagerar med mikrotubuli i en nukleotid beroende sätt. Medlemmar av kinesin familjen visar en rad funktioner från translokerande kinesiner, som bär last i en riktad sätt längs mikrotubuli, till icke-translokerande mikrotubuli end bindande kinesiner, som reglerar mikrotubuli dynamik ^2,3.

Kinesiner använder omsättning adensosine-5'-trifosfat (ATP) för att reglera deras interaktion med mikrotubuli cytoskelettet ^4-6. Den konforma kinesin motor domän och därmed dess affinitet för mikrotubuli beror på dess nukleotid tillstånd: ATP, kan ADP, ADP.Pi eller ingen nukleotid bindas (Figur 1). För att förstå den molekylära mekanismen för en kinesin, krävs en förståelse för sambandet mellan ATP omsättning och mikrotubuli interaktion. Denlåtas, är ett viktigt mål i kinesin fältet för att karakterisera de funktionella egenskaperna hos olika nukleotid stater och kinetiken för övergångarna mellan dem båda i närvaro och frånvaro av mikrotubuli.

Figur 1 Den enklaste ATP omsättningen cykel för en kinesin består av fyra möjliga tillstånd: nukleotid Fritt (Φ), ATP-bunden, ADP.P _jag -bunden och ADP bundna Var och en av de fyra övergångar kännetecknas av en framåt och. bakåthastighetskonstant (k _x och k _-x respektive).

För att förstå hur den kemiska cykeln av ATP-omsättning är kopplad till den mekaniska cykeln av mikrotubulus interaktion, måste man fastställa vilka steg i ATP omsättning cykeln hastighetsbegränsande i frånvaro av mikrorörduler och sedan bestämma hur cykeln förändras genom närvaron av mikrotubuli. Den enklaste ATP omsättning cykel består av fyra enskilda kemikalier steg: (1) ATP-bindning till den tomma platsen (Φ betecknar den tomma platsen, dvs nukleotid fritt kinesin); (2) ATP klyvning; (3) fosfat dissociation och (4) ADP dissociation (Figur 1). Det hastighetsbegränsande steget sätter hastighetskonstanten för den kompletta ATP omsättning cykel. Därför, för att bestämma vilka steg är hastighetsbegränsande vardera av de enskilda övergångarna skall mätas och jämföras med hastighetskonstanten för den kompletta cykeln. Metoder för att mäta den totala ATP omsättningscykelhastighetskonstant beskrivs inte här, men kan hittas i Here referens 7, beskriver vi metoder genom vilka hastighetskonstanter för enskilda kemiska steg kan bestämmas. Det finns ett antal metoder som finns för att studera enskilda övergångar i omsättning cykel av en nukleotid hydrolyse protein. De metoder som presenteras här tar advantage av egenskaperna av nukleotider märkta med fluoroforen methylanthraniloyl, vanligen kallad mant, som uppvisar en förändring i fluorescensintensitet vid bindning till protein ^8. Den mant gruppen används därför att dess ringa storlek innebär att, då den kopplas till ribos (Figur 2A), måste det i allmänhet liten eller ingen effekt på kinetiken för nukleotid bindande eller hydrolys ^9-12. Här presenterar vi protokoll som beskriver användningen av mant-märkta nukleotider, tillsammans med stoppat flöde fluorescens, att tillåta granskning av nukleotid bindande och dissociation i ATP omsättningen cykel av en kinesin.

Protocol

1. Bestämning av Fluorescensintensitet Förändring vid bindning av Mant-märkt nukleotid.

1. Lägg 1 iM mant-märkt nukleotid till 1 ^ M kinesin (slutkoncentrationer) i ett lämpligt reaktionsbuffert. Typiskt en buffert som gynnar mikrotubuli tillväxt och stabilitet används (se diskussion). En vanligen använd buffert innehåller 80 mM piperazin-bis-2-etansulfonsyra (PIPES) pH6.9, 1 mM _MgCl2 och 1 mM etylenglykol-bis-2 aminoeter-tetraättiksyra (EGTA).
   Obs: Koncentrationen av kinesin anges i alla protokoll avser koncentrationen av nukleotid bindningsställen (dvs. motor domäner). Olika kinesiner existera som monomerer, dimerer eller tetramerer och kan innehålla mer än en nukleotid-bindningsställe per molekyl.
2. Efter en inkubationstid (1-3 min) och med hjälp av en vanlig fluorimeter, mäta emissionsspektrum för mant-märkt nukleotid-kinesin komplex. Använd en excitationsvåglängd av 365 nm ochåtgärd emitterat ljus 400-500 nm i steg om 1 nm.
3. Gör en lösning av 1 mM mant-märkta nukleotiden i samma reaktionsbuffert som används i Steg 1.1.
4. Mät emissionsspektrum för den mant nukleotid enda prov, som tidigare beskrivits (se steg 1.2).
5. Normalisera spektra till signalen vid våglängden för maximal fluorescensintensitet av spektrumet av mant nukleotid i lösning (dvs utan kinesin) genom att dividera genom med detta värde.
6. Rita den normaliserade spektra (t.ex. figur 2B) att observera fluorescensintensiteten skillnader mellan mantATP bundna och / eller mantADP bunden kinesin och mant nukleotid i lösning.

2 Mätning av föreningen och dissociationshastighetskonstanter för mantATP

1. Till en lösning av upp till 20 | iM kinesin (se diskussion) i någon lämplig Mg2 ⁺ Vri buffert (t.ex. 80 mM PIPES pH6.9, 1 mM EGTA, 0,1% Tween 20), tillsätt 1mM (slutlig koncentration) etylendiamintetraättiksyra (EDTA) och 1 mM (slutlig koncentration) ditiotreitol (DTT). OBS: Tillägg av Tween20 till bufferten rekommenderas eftersom det minskar / förhindrar förlust av kinesin protein på kolonnen används för buffertbyte (steg 2.3 och 3.3)
2. Inkubera lösningen vid 25 ° C under 15 min.
3. Separat fri nukleotid och EDTA från kinesin med hjälp av en gravitationsflöde G-25 sephadex gelfiltreringskolonn enligt tillverkarens instruktioner (se lista över material).
   1. Jämvikta kolonnen med åtminstone 3 kolonnvolymer av en lämplig Mg2 ⁺ Vri buffert (se steg 2.1). Fyll på kinesin-innehållande lösningen på kolonnen. Förbered en samling röret genom att lägga till en lämplig volym av 100 mM magnesiumkloridlösning till det tomma röret, så att den slutliga koncentrationen av magnesiumklorid är 1 mM efter insamling av kinesin lösningen. Omedelbar tillsats av magnesiumklorid hjälper Stabilisyns nukleotiden fritt kinesin.
   2. Eluera kinesin användning av en lämplig Mg2 ⁺ Vri buffert. Kinesiner är instabila när fria från nukleotid så det är viktigt att arbeta snabbt. Förvara nukleotid fritt kinesin på is och använd inom 1-2 timmar.
4. Under eller före beredning av nukleotid fritt kinesin, förbereda en mantATP koncentrationsserie i samma reaktionsbuffert som den slutliga lösningen av nukleotid fritt kinesin. Bestäm olika koncentrationer av mantATP krävs enligt tillgängliga koncentrationen av kinesin med en typisk serie som sträcker sig från 0,1 till 50 ^ M (se steg 2.5 och diskussion).
5. Bered en koncentration rad nukleotid fritt kinesin. För varje koncentration av mantATP (steg 2,4), bör en koncentration av nukleotid-fri kinesin framställas så att den mant-märkta nukleotiden är i 5 till 10-faldigt molärt överskott över kinesin nucleotide bindningsställen.
6. Ställ excitationsvåglängd på stoppad-flow fluorimeter till 365 nm och samla utsända ljuset vid> 400 nm med en långpassfilter.
7. Börjar med den lägsta koncentrationen av mantATP, blanda den mantATP med en lämplig koncentration av nukleotid-fri kinesin i en 1: 1 vol / vol-förhållande med användning av ett stoppat flöde fluorimeter (figur 3A och 3B Inset). Anm: Reaktanterna utspädd med 50% efter blandning. Anteckna nukleotid koncentrationen både före och efter blandning (dvs 3,0 / 1,5 M) för att undvika förvirring.
8. Montera förändringen i fluorescensintensitet mättes vid varje koncentration av mantATP till en exponentiell funktion plus en linje med konstant negativ lutning för att redogöra för fotoblekning av den mant grupp (dvs Fluorescens = A ₀ .EXP _(kobs .t) + (m. t + c), där A ₀ är amplituden, är _kobs är hastighetskonstanten och t tiden, se figur 3B och diskussion). Från dessa passar bestämma enhastighetskonstant _(kobs) vid varje koncentration av mantATP. Varje k _obs är en faltning av en förening och dissociationshastighetskonstant (Figur 1, k ₁ och k _-1).
9. Deconvolve associerings och dissociationshastighetskonstanter genom att rita k _obs mot mantATP koncentration (t.ex. figur 3C). Montera dessa data till en linjär funktion (dvs., _kobs = k ₁ [mantATP] + k _-1) för att erhålla gradienten och y-axelns skärningspunkt. Gradienten representerar hastighetskonstanten för mantATP association (Figur 1, k ₁₎ med de enheter M ^-1 s ^-1. Skärnings representerar dissociationshastighetskonstant (Figur 1, k _-1) med enheter av s ^-1 (se diskussion). Obs: kan också tillämpas Detta sätt att bestämma ADP föreningen och dissociationhastighetskonstanter (Figur 1, k _-4 och k ₄₎ genom att använda mantADP som nukleotid.

3. Mätning av dissociationshastighetskonstant för mantADP

1. Till en lösning av 2 pM kinesin i en lämplig reaktionsbuffert (t.ex. 80 mM PIPES pH6.9, 1 mM _MgCl2, 1 mM EGTA, 0,1% Tween 20), tillsätt 50 | iM mantADP (slutlig koncentration).
2. Inkubera vid 25 ^° C under 30 min.
3. Ta bort överflödigt mantADP och andra gratis nukleotid med buffert utbyte av kinesin i den valda reaktionsbuffert med hjälp av en G-25 sephadex kolonn (se lista över material) enligt tillverkarens instruktioner. Den kinesin motor domänen ska nu belastas med mantADP.
4. Ställ excitationsvåglängden på slutade flöde fluorimeter till 365 nm och samla utsända ljuset vid> 400 nm med en långpassfilter.
5. Blanda mantADP.kinesin komplex (~ 1 ^ M) med en 50-faldig eller större molar överskott av omärkt ATP i en 1: 1 vol / vol-förhållande med användning av ett stoppat flöde fluorimeter (figur 4A och 4B Inset).
6. Montera minskning i fluorescensintensiteten observeras över tid till en enda exponentialfunktion plus en rad av ständigt negativ lutning att redovisa fotoblekning av mant gruppen (dvs Fluorescens = A ₀ .EXP (k _obs .t) + (m.t + c), där A ₀ är amplituden, är _kobs är hastighetskonstanten och t tiden, se figur 4B och diskussion). Den k _obs bestämmas ur den passformen är hastighetskonstanten för dissociation av ADP (figur 1, k ₄₎ med enheter av s ^-1 (se diskussion).

Representative Results

En ökning av fluorescensintensiteten hos den mant gruppen är typiskt observerat efter bindning av mant-märkt nukleotid till en kinesin. Emellertid är storleken av en sådan signalförändringen beroende på den särskilda kinesin i fråga. Därför är det bra att göra jämviktsmätningar för att bekräfta både förekomsten och omfattningen av en fluorescensintensiteten förändring före utvecklas till kinetiska analyser. Representant fluorescensspektra för mantATP och mantADP, både i lösning och i komplex med kinesin-13, MCAK, visas i figur 2B. Dessa data markerar fluorescensintensiteten ökat visas av både mantATP och mantADP vid bindning till MCAK. Förändringen i fluorescensintensiteten vid bindning av mant nukleotid till en kinesin används för att rapportera om föreningen och dissociation av både ATP och ADP (avsnitt 2 och 3). I fallet med MCAK, är en fluorescensintensitetsskillnad observeras mellan mantATP.kinesin och mantADP.kinesin

Figur 3A visar reaktion som inträffar vid blandning mantATP med nukleotid fritt kinesin. Representativa data illustrerar ökningen i fluorescensintensitet som uppstår vid bindning av mantATP till kinesin-13, är MCAK visas i figur 3B. Data av den typ som visas i figur 3B uppsamlas vid ett intervall av mantATP koncentrationer. Ett diagram över de hastighetskonstanter _(kobs) bestämda kontra mantATP koncentration visas i figur 3C. Montering dessa data till en linjär funktion (dvs k _obs = k ₁ [mantATP] + k _-1) medger deconvolution av hastighetskonstanter som bidrar till k _obs (Steg 2.8). Därför möjliggör fastställandet av både föreningen och dissociationshastighetskonstant för mantATP (Figur 1, k ₁ och k -1 respektive).

Figur 4A skildrar den reaktion som sker vid blandning mantADP.kinesin med ett överskott av omärkt ATP. Data i figur 4B visar fluorescensintensitet minskning observerades för mantADP upon dissociation från kinesin-13, MCAK. Genom att montera dessa data till en exponentiell funktion (Steg 3.6) hastighetskonstanten för dissociation av mantADP bestäms direkt.

Figur 2. Nukleotider märkta med fluoroforen methylanthraniloyl (mant) används för att isolera enskilda stegen i ATP omsättningscykeln. (A) Strukturen på mantATP visar läget för den mant fluorofor konjugerad till antingen 2 "eller 3 'position på ribos. (B) Normaliserad fluorescensspektra för mantATP och mantADP i lösning (MAXP) och mantATP end mantADP i komplex med kinesin MCAK (mATP + MCAK och MADP + MCAK). Den mantATP spektra är normaliserade till fluorescens vid max för mantATP i lösning och mantADP spektra normaliserade till fluorescens vid _max för mantADP i lösning. Spektra för de mant nukleotider blandade med MCAK uppsamlas vid en min efter blandning. Koncentrationen av reagens och fluorimeter inställningar är såsom beskrivs i protokoll steg 1,1 och 1,2.

Figur 3 Mätning av föreningens hastighetskonstanten för mantATP. (A) Schematisk visar reaktionen som äger rum post blandning genom stoppat flöde: mantATP (mATP) binder till nukleotid fritt kinesin. Den fluorescensintensiteten hos mant grupp ökar vid bindning till proteinet. (B) Fluorescens signaländring (svart) observerades vid blandning mantATP (25 M) med MCAK (5 M nucleotide fritt). Dessa data är i skick (röd streckad) till en enda exponentiell funktion plus en linje med konstant negativ lutning, som står för fotoblekning av den mant fluorofor (se diskussion) Infällt:. Innehållet i sprutorna före blandning på stoppat flöde fluorimeter. (C) Hastighetskonstanter _(kobs) bestämda för reaktionen av mantATP med nukleotid-fri MCAK plottad mot koncentrationen av mantATP. Denna kurva kommer att ha en linjär region med gradienten är den associationshastighetskonstanten (figur 1, k ₁₎ med enheter av M ^-1 s ^-1 och y-interceptet är den dissociationshastighetskonstant (Figur 1, k _-1) med enheter av s ^-1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

. Figur 4 Mätning av dissociationshastighetskonstant för mantADP (A) Schematisk visar reaktionen som äger rum post blandning genom stoppat flöde: kinesin förladdad med mantADP späds in i ett överskott av omärkt ATP. Hålls isär mantADP ersätts med omärkt ATP, vilket därigenom förhindrar baksidan reaktion av mantADP association (se diskussion). Fluorescensintensiteten av den mant grupp minskar vid dissociering från proteinet. (B) Fluorescens minskning observeras vid dissociationen av mantADP från kinesin MCAK. Fluorescenssignalen (svart) är lämplig (röd streckad) till en enda exponentiell plus en rad av ständigt negativ lutning för att redogöra för fotoblekning av mant-gruppen (se diskussion). Hastighetskonstanten bestämdes är hastighetskonstanten för dissociation av mantADP (Figur 1, k₄₎ Infällt:.. Innehållet i sprutorna före blandning på ett stoppat-flöde fluorimeter Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Här presenterar vi protokoll för observation och analys av kinetiken för övergångarna mellan nukleotid stater för en kinesin. Dessa protokoll utnyttjar snabb blandning metod stoppat flöde i samband med fluorescensmärkta nukleotider. Metoder av denna typ har använts i stor utsträckning för att studera nukleotid bindning och dissociation för en variation av kinesiner ^9-11,13-16. De beskrivna metoderna tillåter inte observation av fosfatfrisättning (figur 1, steg 3). Emellertid kan stoppat flöde fluorescens användas för att observera denna övergång genom att använda en fosfat avkännande protein till par produktion av fosfat till en fluorescensintensitet förändring ^17. Metoderna som presenteras användnings nukleotider märkta med den lilla fluoroforen methylanthraniloyl (mant), som i allmänhet uppvisar en ökning av fluorescensintensiteten när det är bundet till protein. Vidare mant fluorofor, när de är konjugerade till antingen 2 'eller 3' positionen på ribose, har ofta ringa eller ingen effekt på bindning, dissociation eller hydrolys av nukleotid ^9-12. Mant-märkta nukleotider är lätt tillgängliga från kommersiella källor (se lista över material) och tillhandahålls som blandningar av de 2 "och 3" konjugat, som de snabbt åter jämvikt när renas till en enda isomer ^8. Mant-märkta nukleotider gör utmärkta reportermolekyler med som kan observeras kinetiken för nukleotid bindande och dissociation.

Användningen av fluorescensmärkta nukleotider betyder att läsas ut av de analyser som beskrivs är ett realtid förändring i fluorescensintensitet. Detta gör dessa analyser idealisk för stoppat flöde fluorescens, vilket möjliggör snabb blandning av reagensen och realtid observation av förändringar i fluorescens som är förknippade med den efterföljande reaktionen. Kombinationen av stoppat flöde som blandningsteknik och fluorescens som den metod för detektering producerar ett system som är relativt prov efräckligt. Till exempel, för att få de data som visas i figur 3C kräver 0,8-1,0 mg renat kinesin-13, MCAK, och att skaffa de data som visas i figur 4B kräver ~ 0,3 mg renat kinesin-13, MCAK. En nackdel med användningen av mant som en fluorofor är att det är utsatt för fotoblekning. Detta kan observeras i isolering från kinesin reaktionskinetiken genom att blanda en lösning av mant-märkta nukleotiden med reaktionsbuffert, i frånvaro av kinesin, i stoppat flöde. En långsam minskning i fluorescensintensitet observeras som den mant gruppen blir blekt. Under intervallet tidsskalor som används i protokollen fotoblekning av mant-gruppen är väl beskrivs av en linjär funktion. Därför är ett enkelt sätt att korrigera data för fotoblekning för att passa till en exponentiell funktion med en baslinje som beskrivs av en linjär funktion (dvs, mt + c) i stället för den vanligare platta baslinjen, som beskrivs av en enda parameter.

mantATP bindning

Vid mätning av hastighetskonstanter för association och dissociation av mantATP (§ 2) i ADP, vilket förblir associerad med kinesin nukleotid-bindningsställe i frånvaro av mikrotubuli, måste tas bort. Detta gör mantATP association och dissociation (figur 1, steg 1) skall beaktas isolerat från ADP dissociation. För att uppnå detta kinesin inkuberas med åtminstone en 50-faldigt överskott av EDTA över nucleotide bindningsställen (steg 2,1). Den EDTA sekvestrerar Mg2 ^+-joner orsakar Mg2 ⁺ dissociera från nukleotid-bindningsfickan, som resulterar i frisättning av den nukleotid ^11. Därför när de utför stegen 2,1-2,3, är det viktigt att använda en buffert utan Mg ^{2 +.} Nukleotiden fritt kinesin protein är bufferten utbytt för att skilja den från både fri nukleotid och från EDTA. För att åstadkomma denna separation kan en engångs strömning GEl filtreringskolonn är tillräcklig och är enkel och snabb att använda (se lista över material). Interaktionen mellan mantATP med nukleotid fri kinesin utförs vid en rad mantATP koncentrationer (Steg 2.4) för att möjliggöra deconvolution av föreningen och dissociationshastighetskonstanter (Steg 2.8). Teorin bakom experiment av denna typ är väl beskriven i referens 18. utföra dessa experiment man börjar med den lägsta koncentrationen av mantATP. Detta tar bort behovet av tvättsteg mellan olika koncentrationer. Det kommer sannolikt att bli nödvändigt att justera känslighet slutade flöde fluorimeter som mantATP koncentrationen ökar. Den mantATP Koncentrationen måste alltid vara minst 5-faldigt överskott över koncentrationen av kinesin nukleotid bindningsställen för att bibehålla pseudo första ordningens villkor. Men när koncentrationen av mantATP ökas signalförändringen kan bli överbelastad och den fraktion av nukleotid som binder till kinesin minskar. Therefore, är koncentrationen av kinesin också ökat för varje ny koncentration av mantATP sådan att koncentrationen av mantATP är aldrig större än 10-faldigt molärt överskott över nucleotide bindningsställen (steg 2,6).

mantADP Dissociation

Fastän associations och dissociationshastighetskonstanter för mantADP kan bestämmas med hjälp av samma metod som beskrivits för mantATP (avsnitt 2). Dissociation av ADP från en kinesin kan observeras direkt genom förladdning nukleotid-bindningsställe med mantADP (Steg 3,1-3,3) Den mantADP.kinesin komplex blandas sedan med ett överskott av omärkt ATP (steg 3,5). Överskottet omärkt ATP förhindrar återbindning av mantADP till kinesin och därigenom gör det möjligt för dissociationsreaktionen (Figur 1, k ₄₎ skall beaktas isolerat från sammanslutning av mantADP. I denna analys av koncentrationen av omärkt ATP måste vara minst ett 50-faldigt molärt överskott av nucAleotide bindningsställen. Teorin bakom denna analys är väl beskriven i referens 18 Denna direkta metod ger en mer korrekt värde för dissociationshastighetskonstant än den extrapolering till y-axeln som beskrivs i steg 2,8.

Införande av mikrotubuli

De beskrivna metoderna kan också användas för att bestämma kinetiken för nukleotid bindning och dissociation i närvaro av mikrotubuli. Mikrotubuli introduceras till nukleotid innehållande sprutan före blandning i stoppat flöde: det undre sprutan i figur 3B och 4B (Inläggningar). I denna konfiguration kommer kinesin möta nukleotid samtidigt som den uppfyller mikrotubuli. Stabiliserade mikrotubuli används, där livslängden för tubulin polymeren förlängd genom användning av antingen en stabiliserande kemikalie, såsom taxol, eller en nonhydrolysable GTP-analog, såsom guanosin-5 '- [(α, β) -methyleno] trifosfat (GMPCPP, se lista på material). Det är möjligt att använda två cykler av tubulinpolymerisation med GMPCPP att mikrotubuli som kan lagras i flera månader i flytande kväve ^9,19. Användningen av i förväg förberedda mikrotubuli minskar betydligt de praktiska svårigheterna med att utföra dessa analyser. Om du vill inkludera mikrotubuli i analyserna, är det viktigt att använda en reaktionsbuffert lämplig för mikrotubuli stabilitet. Bufferten val är RÖR baserade, med den mest använda buffert innehållande 80 mM PIPES pH 6,9, 1 mM _MgCl2 och 1 mM EGTA (sk BRB80) ^20,21.

De beskrivna metoderna är inte begränsade till användning med kinesiner, men kan anpassas och tillämpas på alla nukleotid bindande protein. Exempelvis har liknande metoder använts till omsättningen cykel medlemmar av myosin familj av molekylära motorer ^12,22 och användningen av mant märkt guanosin nukleotider ytterligare utökar ATPmetoder av denna typ till GTP hydrolysera proteiner ^23,24.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2’/3’-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5’triphosphate	Jena Biosciences	# NU-202	mantATP
2’/3’-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5’-diphosphate	Jena Biosciences	# NU-201	mantADP
Mg-ATP	Roche	# 10519979001	The disodium salt of ATP is made to a concentration of 100 mM in 100 mM MgCl2. Concentration should be verified by absorption at 260 nm (e = 15,400 M-1cm-1). Solution stored in aliquots at -20 oC.
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Fisher Scientific	BP120-500	0.5 M stock solution in water, pH 8.0. HAZARD: powder harmful if inhaled.
Dithiothreitol (DTT)	Melford	MB1015	1 M stock solution in water made fresh for use on the same day. HAZARD: powder harmful if inhaled or in contact with the skin.
NAP-5 column	GE Healthcare	# 17-0853	G-25 sephadex resin gravity-flow gel filtration column
GMPCPP	Jena Biosciences	# NU-405	nonhydrolysable analogue of GTP
Stopped-flow fluorimeter	Applied Photophysics	SX20	A fluorimeter with some plumbing attached, which allows reagents to be rapidly mixed in the observation cuvette. Thereby allowing the kinetics of reactions on timescales of ~0.1 - 100 sec to be monitored.