Summary

Radial Mobilità e citotossico Funzione retrovirale Replica vettoriale trasdotte, non aderente Alloresponsive Linfociti T

Published: February 11, 2015
doi:

Summary

We describe a protocol to monitor radial mobility of non-adherent immune cells in vitro using a cell sedimentation manifold/slide apparatus. Cell migration is tracked on monolayers of tumor cells or on extracellular matrix proteins. Examination by light and fluorescence microscopy allows for observation of cell mobility and cytotoxic functionality.

Abstract

Riportiamo un romanzo adattamento del dosaggio migrazione cellulare Monolayer radiale, prima riferito a misurare la migrazione radiale delle cellule tumorali aderenti su proteine ​​della matrice extracellulare, per misurare la motilità, umane non aderente o effettrici murine cellule immunitarie fluorescenza marcata. Questa tecnica utilizza un collettore in acciaio inox e 10 ben scorrevole in Teflon per depositare focally cellule T non aderenti nei pozzetti preparati sia con monostrati confluenti di cellule tumorali o proteine ​​della matrice extracellulare. Luce e / o multicanale microscopia a fluorescenza viene utilizzato per monitorare il movimento e il comportamento delle cellule effettrici nel tempo. Coloranti fluorescenti e / o vettori virali che codificano per transgeni fluorescenti sono usati per etichettare in modo differenziato i tipi di cellule per l'imaging. Questo metodo è distinto da simile tipo in vitro che traccia orizzontale o verticale migrazione / invasione utilizzando camere di diapositive, agar o transwell piatti. Il test permette di dati dettagliati di imaging a Be raccolti con differenti tipi cellulari caratterizzati da marcatori fluorescenti specifici; anche sottopopolazioni di cellule specifiche (ad esempio, trasdotte / nontransduced) possono essere monitorati. Superficie trame fluorescenza intensità vengono generati utilizzando i canali di fluorescenza specifici corrispondenti al tipo di cellula migrazione. Questo permette una migliore visualizzazione della mobilità non aderenti delle cellule immunitarie in momenti specifici. È possibile raccogliere prove di altre funzioni delle cellule effettrici, quali citotossicità o il trasferimento di vettori virali da effettore alle cellule bersaglio, pure. Così, il metodo permette ai ricercatori di documentare microscopicamente cellula-cellula interazioni di differenzialmente-marcato, non aderente con cellule aderenti di vario tipo. Tali informazioni possono essere particolarmente rilevanti nella valutazione di tipi di cellule immunitarie biologicamente manipolati o attivati, in cui la prova visiva della funzionalità si desideri con cellule bersaglio tumorale prima di utilizzarli per la terapia del cancro.

Introduction

Il test di migrazione cellulare monostrato Radial è stato originariamente sviluppato per misurare le proprietà infiltrative delle cellule tumorali aderenti 1-4 su vetrini rivestiti con matrice extracellulare (ECM) proteine ​​5-7 o con i componenti ECM individuali, come la fibronectina o laminina 1,2. La tecnica coinvolto seminare una sospensione di cellule singole cellule tumorali nel centro di pozzetti usando un collettore sedimentazione cellulare acciaio inossidabile (CSM). Dopo sedimentazione, le cellule tumorali sarebbero aderire al fondo del pozzo e la variazione del diametro della popolazione cellulare iniziale nel tempo usato per stabilire un tasso di motilità orizzontale. Il test di migrazione cellulare monostrato Radial ha fornito un vantaggio visivo rispetto ad altri metodi esistenti che impiegavano transwell piastre per saggio le capacità migratorie in vitro di cellule; questi test non sono favorevoli alla formazione immagine 8. Come pure, ha fornito anche una grande quantità di libertà nella scelta del timepoints in sede di valutazione della migrazione, senza alcun limite al numero di timepoints un ricercatore potrebbe scegliere di immagine dopo la sedimentazione.

Poiché la capacità di migrare è una funzionalità importante per le cellule non aderenti, soprattutto nella zona di immunoterapia o dove possono essere utilizzate come veicoli di consegna per vettori virali, abbiamo adattato l'uso del CSM per valutare la migrazione di cellule non aderenti tipi su monostrati di cellule tumorali, in aggiunta alle proteine ​​ECM. Il vantaggio di microscopicamente visualizzare la migrazione delle cellule non aderenti su monostrati di cellule tumorali vitali, il ECM complesso isolato dal tumore, o sui componenti ECM singoli rende questo test versatile. Saggi che utilizzano pozzi rivestiti con una singola proteina extracellulare non riflettono accuratamente il substrato tessuti ECM o tumore delle cellule sarebbero migrare attraverso in vivo.

Qui, abbiamo usato alloreattivi linfociti T citotossici (alloCTL), sensibilizzati ai principali histocompcomplesso atibilità (MHC) proteine ​​utilizzando reazioni a senso unico di cellule tumorali linfocitaria mista (MLTR) o reazioni linfociti misti (MLR) 9, come il nostro tipo di cella non aderente rappresentante. Abbiamo testato le celle sia di origine umana e murina. Quando la migrazione è stata misurata su monostrati tumorali, le cellule tumorali sono state impiegate obiettivi parzialmente rilevanti, mostrando alcune delle stesse proteine ​​MHC presenti nella popolazione cellulare utilizzato per sensibilizzare gli effettori, o obiettivi pienamente rilevanti, con una serie completa di molecole MHC che la effettori erano stati sensibilizzati verso. In alcuni esperimenti, abbiamo usato CellTracker fluorescente Red CMPTX o proliferazione cellulare dye eFluor 670 di distinguere tra cellule effettrici e di destinazione. Abbiamo anche utilizzato la trasduzione con codifica vettori virali per proteine ​​fluorescenti come un ulteriore modo per visualizzare le cellule. Per alcuni test, abbiamo transdotte la alloCTL con vettori retrovirali replicanti (RRV) che codificano per Emerald Green (EMD) proteina fluorescente 10,11; per OTHERS, le cellule tumorali sono state trasdotte con vettori lentivirali codificanti per mStrawberry.

Il alloCTL sono stati seminati attraverso un canale del collettore al centro di entrambi i monostrati di cellule tumorali o ECM raccolti da monostrati cellulari tumorali. Interazioni delle cellule aderenti e non aderenti sono state visualizzate mediante luce e / o mediante microscopia a fluorescenza nel tempo. Turbativa in monostrato cellula tumorale a bassa potenza, o tumore cellule con nuclei frammentati ad alta potenza sono indicatori di danno cellulare da lisi e apoptosi, rispettivamente. Abbiamo creato digitalmente mappe fluorescenti di intensità superficie che mostrano la migrazione di cellule fluorescenti T non aderenti sulle colture monostrato. Abbiamo notato anche la citotossicità generato per l'aderente monostrato cellulare glioma dopo la formazione di cluster del sovrapposto alloCTL non aderente. Come pure, è stato osservato trasduzione orizzontale RRV-EMD dalla alloCTL al monostrato glioma.

Protocol

1. Far scorrere Preparazione Inserire sedimentazione cellulare slide collettore in sacchetti di sterilizzazione e sigillare con nastro autoclave. Affrontare il lato rivestito di teflon della slitta della carta lato del sacchetto per evitare depositi di plastica sui pozzetti. Sacchetti autoclave per 15 min a 121 ° C. Rimuovere il vetrino dalla busta di sterilizzazione in un armadio biosicurezza e posto in un 150 x 15 mm piastra di Petri sterile sterile. Fino a quattro diapositive può anda…

Representative Results

Vettori virali codificanti per proteine ​​fluorescenti possono essere utilizzati in aggiunta o al posto di, colorante fluorescente. Trasduzione virale deve essere eseguita prima del dosaggio motilità. Entrambi i tipi di cellule aderenti e non aderenti possono essere differenzialmente etichettati. Il protocollo per la trasduzione dipenderà dal tipo di vettore impiegato. Qui, trasdotte il alloCTL nelle figure 3, 5 e 6 con RRV-EMD almeno due giorni di anticipo del test utilizzando il…

Discussion

Le cellule tumorali in una sospensione di cellule singole sono stati pipettati nei pozzetti di una slitta Teflon mascherato. Le cellule potevano aderire e poi formate monostrati in un umidificata al 5% di CO 2, 37 ° C incubatore (Figura 1A). Monostrati affermati o proteine ​​ECM derivati ​​dal monostrato potrebbero essere raccolti per questi test (Figura 1B). T effettrici linfociti marcati con coloranti fluorescenti vitali o trasdotte con vettori codificanti per EMD …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Supportato in parte dal NIH R01 CA121258, R01 CA125244, R01 CA154256, NIH / NCATS UCLA CTSI Concessione Numero UL1TR000124, USAMRMC W81XWH-08-1-0734, e Joan S. Holmes Memorial Fund Research. MJH e GCO ricevuti sostenuto dalla Joan S. Holmes Memorial Postdoctoral Fellowship presso la UCLA. Il dispositivo CSM è stato ottenuto da creativi metodi scientifici: www.creative-sci.com. Il vettore lentivirale è stato ricevuto dal UCLA Vector core, che è supportato da CURE / P30 DK041301.

Materials

Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Teflon-masked microscope slides Creative Scientific Methods CSM002
Cell Sedimentation Manifold Creative Scientific Methods CSM001
Petri Dish, 150mm Corning 430597
Petri Dish, 35mm Corning 430588
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Mediatech 21-040
20 μL Pipetman Gilson F123600
200 μL Pipetman Gilson F123601
200 μL pipette tips VWR 89003-060
Distilled, deionized water (sterile) Mediatech 25-055
Trypsin Mediatech 25-054-CL
Celltracker Red CMPTX Invitrogen C34552
TrypLE Express (optional) Gibco 12604
Tumor cell culture media (e.g. DMEM) Mediatech 10-013
AIM-V serum-free media Invitrogen 12055-083
Fetal Bovine Serum Omega Scientific FB-02
Inverted microscope
SPOT Advanced Diagnostic Instruments
Poly-D-Lysine Millipore A-003-E
Fibronectin BD 354008
31/2 x 51/4 Autoclave Pouches Crosstex SCXS2
Trypan Blue Mediatech 25-900-CI
Cell Proliferation eFluor 670 eBioscience 65-0840-85
ImageJ NIH

References

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Erickson, K. L., Hickey, M. J., Kato, Y., Malone, C. C., Owens, G. C., Prins, R. M., Liau, L. M., Kasahara, N., Kruse, C. A. Radial Mobility and Cytotoxic Function of Retroviral Replicating Vector Transduced, Non-adherent Alloresponsive T Lymphocytes. J. Vis. Exp. (96), e52416, doi:10.3791/52416 (2015).

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