Introduction
Blærekræft er en af de mest almindelige kræft i urogenitalkanalen, med næsten 75.000 nye tilfælde hvert år i USA 1. Høje tilbagefald kræver livslang opfølgning, hvilket gør blærekræft en af de dyreste kræftformer at behandle. Guldstandarden behandling for høj kvalitet NMIBC er trans-urethral resektion efterfulgt af intravesikal immunterapi med BCG. Selvom den præcise mekanisme af anti-tumor aktiviteten af BCG stadig at blive fuldstændigt belyst, er det accepteret, at aktiveringen af en immunreaktion cellemedieret beriget i T hjælper (Th) 1 og cytotoksisk T (Tc) 1-celler er afgørende for succesen af terapien 2.
På trods af at BCG fortsat behandling af valg for NMIBC, en stor del af patienterne responderer ikke på behandlingen; endvidere kan det medføre en række bivirkninger: ca. 70% af de behandlede tumorer igen efter nogen tid og ~ 15% fremskridt til muskel-invasive form forsygdom. Andre bivirkninger forbundet med BCG behandling indbefatter dysuri, blærebetændelse og nyre-infektion 3-6.
Udviklingen af nye terapeutiske strategier skal tage hensyn til brugen af prækliniske modeller, efter indledende in vitro evaluering; Dette er særlig relevant i tumorer, hvis mikromiljø kan væsentligt påvirke deres udvikling og lydhørhed over for behandling.
I det seneste årti har vi behandlet flere aspekter af den immunmodulerende aktivitet af HP-NAP, et protein produceret af bakterien Helicobacter pylori, oprindeligt identificeret som stand til at fremme endothelial adhæsion af polymorfkernede celler (PMN'er) 7. Strukturelt HP-NAP tilhører DNA-beskyttende protein under udsultede forhold (DPS) familie 8 og består af 12 identiske underenheder arrangeret i en dodecameric skal.
Vi har vist, at HP-NAP eren Toll-lignende receptor (TLR) 2 agonist, med en stærk immuno-modulerende aktivitet ansvarlig for at drive differentieringen af T-lymfocytter mod Th1-fænotype, både in vitro og in vivo 9-10. I kraft af denne aktivitet, HP-NAP er i stand til at omdirigere immunreaktionen Th2 til det mere fordelagtigt Th1-respons i en murin model for allergisk astma 11.
At evaluere Th1-afhængige anti-tumor potentiale HP-NAP, tog vi fordel af en musemodel for blærekræft udviklet flere år siden af O'Donnel og kolleger 12 til evaluering af virkningen af BCG administration.
Med denne protokol, viser vi, at HP-NAP har en stærk anti-tumor potentiale mod blærecancer og at effektiviteten af HP-NAP administration parallelt med signifikant akkumulering, inden tumor og regionale lymfeknuder, af både Th1 og TC1 lymfocytter producerer Interferon ( IFN) -γ 13
Nærværende rapport giver en skridtvise protokol beskriver udarbejdelsen af dyrene, deres urethral kateterisation, den kemiske brændende kræves til fastgørelse af celler til blæren slimhinde, og injektion af tumorcellerne. Vi beskriver også den topiske administration af HP-NAP, der kan betragtes som en prototype på nogen terapeutiske midler, der er udviklet til behandling af blærecancer. De beviser opnået ved at sammenligne tumorer isoleret fra kontrol og HP-NAP-behandlede dyr fremhæver ikke kun det faktum, at HP-NAP kunne være en god kandidat til blærekræft immunterapi, men også den generelle effektivitet i den eksperimentelle oprettet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer for håndtering af dyr er blevet godkendt af det italienske sundhedsministerium (DM 204/2011-B).
1. Dyr
- Grow C57BL6 / J hunmus til 8 uger gamle i individuelt ventilerede bure med microisolation filtre.
Note: Hunner foretrækkes, fordi den anatomiske konformation af deres urogenitale apparat ekstern gør kateterisation lettere end hos mænd.
2. Cellekultur
- Opretholde muse urothelial carcinom cellelinie MB49 i RPMI 1.640 medium suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum og 50 pg / ml gentamicin ved 37 ° C i befugtet 5% CO2.
- Grow MB49-celler i T-75 kolber til 80% konfluens. Trypsinisér og resuspender ved 0,5 × 10 5-0,5 × 10 6 celler pr 150 pi PBS før implantation i mus.
3. Intravesikal Tumor Implant
- Bedøver mus under anvendelse af en blanding af bedøvelsesmidler zoletil og xylor (33 mg / kg og 20 mg / kg), injiceret intraperitonealt.
- Placer dyr i en liggende stilling og løse bagbenene til puden med tape. Paws har at være tilstrækkeligt adskilt til at gøre urinrørsåbningen godt synlige og let tilgængelige for indsættelse af kateteret.
- Bemærk: Angående kateterisation, en 24 G pædiatrisk venekateter er egnet i 8 til 10 uger gamle mus. Valget af kateteret er meget vigtig for at undgå udsivning af væske mellem uretravæggen og kateteret. Større lysning katetre skal anvendes til større eller ældre mus.
- Ved hjælp af en lille nipper, knibe en kant af den udvendige del af urinrøret og vride det meget forsigtigt mod "hovedenden" af mus. Denne handling frilægger urinrørsåbningen.
- Fjern den indre nål af kateteret og sæt sidstnævnte i urinrøret i en vinkel på 45 °, let orientereti retning af "hale ende" af musene. Tving ikke indgangen til kateteret; i tilfælde af resistens, bare vride katetret meget forsigtigt, indtil den glider inde i urinrøret. Når ca. 0,5-0,8 cm af kateteret i urinrøret, anbring forsigtigt kateteret parallelt til halen af musene og indsætte det fuldstændigt.
- Anvendelse af en 1 ml sprøjte, hvis nål, der skal indsættes i kateteret, vaske blæren fra residualurin ved at injicere 200-300 pi sterilt PBS og aspireres al væsken fra blæren.
- Bemærk: Når injektion af PBS, vil blæren fylde og en hævelse vil være synlig mellem bagbenene fra musene; Dette bekræfter, at kateterisation er korrekt. De fleste katetre har et dødt volumen, der skal overvejes, når beregningen injektionsvolumenet.
- Anvendelse af en steril 1 ml sprøjte, injiceres 200 pi 0,1 N HCI. Fylde blæren for at brænde hele sin væg. Efter 10 sek, fjerne alle de sure og straks neutralize ved at injicere 200 pi 0,1 N NaOH med en steril sprøjte. Ved injektion af det højeste antal celler (0,5 x 10 6), er syrningen trin ikke nødvendigt.
- Aspirér al restvæsken og straks skylle kaviteten med 300 pi sterilt PBS.
- Tømme blæren ved aspiration, og injicere 150 pi PBS indeholdende MB49-celler (interval 0,5 × 10 5-0,5 x 10 6) ind i blæren. Lad sprøjten samles til kateteret for at undgå lækage af celler. Det er bedre at fastgøre sprøjten ved at fastgøre den til puden med tape.
- Efter 1 time forsigtigt udtrække kateteret fra urinrøret, og placere musene i buret, under en glødelampe, indtil de vågne: dette sker normalt mellem 1 og 2 timer efter afslutningen af behandlingen.
4. Intravesikal Levering af HP-NAP
- Bemærk: Mindst 3 dage efter instillation celle, er det muligt at begyndebehandling.
- Selvkaterisation som beskrevet i trin 3,1-3,4. På dette stadium er det ikke nødvendigt at brænde blærevæggen med HCI.
- Anvendelse af en 1 ml sprøjte, vask blæren fra residualurin ved at injicere 200-300 pi sterilt PBS og aspireres al væsken fra blæren.
- Injicer 50 ug HP-NAP per 150 pi PBS ind i blæren. Lad sprøjten fastgjort til kateteret for at undgå lækage af proteinopløsningen. Fastgør sprøjten ved fastsættelse det til puden med tape.
- Efter 1 time forsigtigt udtrække kateteret fra urinrøret og placere musene i buret, under en glødelampe, indtil de vågne.
5. Tumor Eksplantater og Histologisk analyse
- Ved afslutningen af behandlingen, ofre dyrene, placere dem i liggende positioner og løse bagbenene til puden med tape.
- Ved anvendelse af en kirurgisk skalpel en lodret snit omkring 1,52 cm lang gennem huden ogbughinde, begyndende lige over ydre kønsorganer til "hovedende" af musene. For at minimere risikoen for at beskadige blæren, være særlig opmærksom på dybden af snittet.
- Blæren vil blive placeret i centrum-venstre i snit og tumoren vil være synlig som en mørk pink / violet masse. Ved sin excision, placere hele blæren i en histologisk bur og fix i 10% bufferet formalin før indlejring i paraffin.
- Til histologisk og immun histokemiske analyse, forberede serielle sektioner af blæren (46 um tykkelse) under anvendelse af en standard mikrotom.
- Plette sektioner med hæmatoxylin / eosin og fortsætte med beregningen af tumorstørrelse (D xd 2), og om fastsættelse af, nekrose pr tværsnitsareal ved hjælp af en computer assisteret billedanalysator.
- For fartøj optælling, fortsæt ved farvning sektionerne for endotel markør CD31 / PECAM, ved hjælp af en standard immunoperoxidaseteknik. Scan sektionerne ent lav effekt (4 ×) for at identificere området med højeste vaskulær densitet. Inden for denne region, tæller individuelle mikrokar i fem separate tilfældige felter ved høj effekt (20 ×).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser kateterisation teknik; musen er kateter og indpodet med 0,5 × 10 6 MB49 celler. Behandling med HP-NAP startes 3 dage efter injektion af tumorceller, at sætte dem i stand til at knytte til blærevæggen og formere sig. Alle dyr, der tilhører kontrolgruppen udvikler tumoren; nogle af dem kan dø inden udløbet af perioden fra den 13. dag grundet okklusion af urinrøret.
Efter den første injektion med HP-NAP, behandles dyrene hver tredje dag, for i alt fire injektioner. Ved afslutningen af forsøget på dag tretten, aflives dyrene, og blærerne opsamlet til histologiske og immune histokemiske analyse. Som vist i figur 2A, er væsentligt mindre end den tumor i vehikelbehandlede mus (220 ± 62 mm 3 vs 830 ± 1 volumen af tumoren i blæren fra HP-NAP-behandlede mus80 mm3).
Interessant, at selv i vehikelbehandlede dyr tumoren invaderer det underliggende fedtvæv, i 7 af de 8 HP-NAP-behandlede dyr tumoren er begrænset inden blærevæggen (figur 2B). Endelig vaskularitet reduceres, og omfanget af nekrose er forøget i HP-NAP-behandlede mus i forhold til kontroldyr (figur 2B og C).
Figur 1. Mus kateterisering. Hunmus bedøves og kateteriseret under anvendelse af en 24 G steril kanyle. Det højre panel er forstørrelsen af den sorte boks. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Anti-tumor aktiviteten af HP-NAP. Mus, implanteret på dag 0 med MB49 celler (0,5 × 10 6), behandles med 50 ug HP-NAP eller PBS (køretøj) på dag 3, 6, 9 og 12. Alle dyr aflives på dag 13. (A) Repræsentativ histologisk analyse på blærer isoleret fra kontrolmus og HP-NAP-behandlede dyr, og tumorvolumen kvantificering. (B) forstørrelse af dele af panel A og procentdelen af nekrose i de to dyregrupper. (C) resekteres blærer, farvet for CD31 / PECAM; repræsentative snit fra kontrol og HP-NAP-behandlede dyr er vist. Kvantificering af mikrokardannelse densitet (C, højre panel); HPF, highpower felter. Data repræsenterer gennemsnit ± SD; n = 8 mus pr gruppe. Statistisk signifikans blev bestemt ved Students t-test (** p <0,01). Figur modificeret fra Codolo etal. 13. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hovedparten af fremskridt i cancerbehandling forlange afprøvninger i dyremodeller, før du starter kliniske forsøg. Muligheden for at studere tumor biologi in vivo, at drage fordel af dyremodeller, er et afgørende redskab for forskere undersøger kræft patogenese, der gør det muligt at vurdere de forskellige behandlingsmetoder. Orthotopisk modeller forbliver guldstandarden 14-15, både på grund af den enorme mængde af cellelinier til rådighed til at oprette en tumor model, og fordi de efterligner miljøet af det naturligt forekommende tumor 16.
Desuden etablering ortotopisk modeller af kræft i syngene mus, som beskrevet her, er særlig relevant i forbindelse med undersøgelser med henblik på at undersøge nye terapeutiske strategier baseret på immunterapi, da sidstnævnte er ikke muligt i immune defekte mus, der gennemgår xenoimplants.
Afbildet i denne protokol metode beskriver than kateterisering af en hunmus urinrøret, der tillader både podning af tumorceller og administration af terapeutiske midler ind i blæren hulrum.
Fordelen ved forkonditionering blærevæggen gennem en syre burn (som beskrevet ovenfor, i stedet for andre metoder, såsom anvendelse af trypsin eller poly-lysin), er at fremme udviklingen af store og stærkt invasive tumorer. Tværtimod forbehandling med trypsin og poly-lysin, resulterer i mindre og mindre invasive tumorer, sandsynligvis på grund af en skadelig virkning af rester af disse stoffer på levedygtigheden af tumorceller 17. Syren brænde foretrækkes også til et andet forkonditionering system baseret på elektrisk kauterisation fordi sidstnævnte kan forårsage perforering af blærevæggen og udbredelsen af tumoren i peritoneum 18.
Protokollen er blevet optimeret til kortvarige undersøgelser (~ 13 dage). Implantering af PRoper antal celler er kritisk, eftersom en højere celletal vil medføre en hurtigere tumorvækst og eventuelt tab af dyr på grund af stor tumorbyrde. Desuden var der indtil brugeren bliver fortrolig med teknikken, er der en vis grad af risiko i beskadige urinrøret eller blæren, således forårsager død af dyrene. Det er vores erfaring, men hvis dyrene tilstrækkeligt drives (og således ikke dø under proceduren), de lever uden at lide for varigheden af forsøgene (13 dage). Endvidere ved at reducere antallet af injicerede celler, er det muligt at forlænge varigheden af forsøgene.
Vi anvendte denne model til at vurdere anti-tumor aktiviteten af proteinet HP-NAP produceret af Helicobacter pylori, med det formål at forbedre, og til sidst erstatte den nuværende terapi baseret på BCG med en ny udstyret med en højere fordele / bivirkninger ratio. Mere generelt kan det eksperimenterende tilgang vedtages i alle præ-kli-cal evalueringer, der kræver levering af terapeutiske midler ind i blæren hulrum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro, italienske universiteter og forskning, Prin-projekter og Progetti di Ricerca di Ateneo indrømme N ° CPDA137871, Fondazione Cariplo yde N ° 2011-0485 til mdb, og ved Finanziamento Giovani Studiosi, University of Padua, til Gaia Codolo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| C57BL/6J female mice | Harlan Italy (Udine, Italy) | ||
| MB49 Cells | Obtained from Prof. O'Donnel, University of Iowa Carver College of Medicine, Iowa, USA | ||
| RPMI | Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) | R8758 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D1408 | 10X, to be diluted in apyrogenic water |
| Flask | Becton Dickinson (Franklin Lakes, New Jersey, USA) | 353135 | |
| Syringe 1ml | Becton Dickinson | 301358 | |
| Trypsin | Life Technologies (Waltham, Massachusetts, USA) | ||
| Gentamycin | Life Technologies | 15710-049 | |
| Xilor | Bio 98 s.r.l. (Milano, Italy) | 2% Xylazin | |
| Zoletil | Virbac (Carros, France) | 359713301992 | 5% Zolazepam + 5% Tiletamine |
| 24G Catheter | Terumo (Rome, Italy) | SR+DM2419PX | |
| HCl | Carlo Erba Reagents (Milano, Italy) | 403871 | Liquid |
| NaOH | JT Baker (Center Valley, Pennsylvania, USA) | 10095011 | Powder |
| Equipment | |||
| Surgical Scalpel | Albion Surgical Limited (Sheffield, England) | ||
| Microtome | Leica Microsystem ( Wetzlar, Germany) | RM2235 | |
| Microscope Slides | VWR International (Radnor, Pennsylvania, USA) | 631-0108 | |
| Image Analyzer | Zeiss (Jena, Germany) | Cyres System | |
References
- Siegel, R., Ma, J., Zou, Z., Cancerstatistics Jemal, A. CA Cancer J Clin. 64, 9-29 (2014).
- Saint, F., et al. Prognostic value of a T helper 1 urinary cytokine response after intravesical bacillus Calmette-Guerin treatment for superficial bladder cancer. J Urol. 167, 364-367 (2002).
- Shahin, O., Thalmann, G. N., Rentsch, C., Mazzucchelli, L., Studer, U. E. A retrospective analysis of 153 patients treated with or without intravesical bacillus Calmette-Guerin for primary stage T1 grade 3 bladder cancer: recurrence, progression and survival. J Urol. 169, 96-100 (2003).
- Lamm, D. L.
- De Jager, R., et al. Long-term complete remission in bladder carcinoma in situ with intravesical TICE bacillus Calmette Guerin. Overview analysis of six phase II clinical trials. Urology. 38, 507-513 (1991).
- Dovedi, S. J., Davies, B. R. Emerging targeted therapies for bladder cancer: a disease waiting for a drug. Cancer Metastasis Rev. 28, 355-367 (2009).
- Evans, D. J., et al. Characterization of a Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. Infect Immun. 63, 2213-2220 (1995).
- Grant, R. A., Filman, D. J., Finkel, S. E., Kolter, R., Hogle, J. M. The crystal structure of Dps, a ferritin homolog that binds and protects DNA. Nat Struct Biol. 5, 294-303 (1998).
- Amedei, A., et al. The neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori promotes Th1 immune responses. J Clin Invest. 116, 1092-1101 (2006).
- Bernard, M., D'Elios, M. M. The immune modulating activity of the Helicobacter pylori HP-NAP: Friend or foe. Toxicon. 56, 1186-1192 (2010).
- Codolo, G., et al. The neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori down-modulates Th2 inflammation in ovalbumin-induced allergic asthma. Cell Microbiol. 10, 2355-2363 (2008).
- Gunther, J. H., et al. Optimizing syngeneic orthotopic murine bladder cancer (MB49). Cancer Res. 59, 2834-2837 (1999).
- Codolo, G., et al. HP-NAP inhibits the growth of bladder cancer in mice by activating a cytotoxic Th1 response. Cancer Immunol Immunother. 61, 31-40 (2012).
- Chan, E., Patel, A., Heston, W., Larchian, W. Mouse orthotopic models for bladder cancer research. BJU Int. 104, 1286-1291 (2009).
- Kubota, T. Metastatic models of human cancer xenografted in the nude mouse: the importance of orthotopic transplantation. J Cell Biochem. 56, 4-8 (1994).
- Loi, M., et al. The use of the orthotopic model to validate antivascular therapies for cancer. Int J Dev Biol. 55, 547-555 (2011).
- Miyazaki, K., et al. Preconditioning methods influence tumor property in an orthotopic bladder urothelial carcinoma rat model. Mol Clin Oncol. 2, 65-70 (2014).
- Horiguchi, Y., et al. Establishment of orthotopic mouse superficial bladder tumor model for studies on intravesical treatments. Hum Cell. 21, 57-63 (2008).
