Introduction
Cancer de la vessie est l'un des cancers les plus fréquents de l'appareil génito-urinaire, avec près de 75 000 nouveaux cas chaque année aux Etats-Unis 1. Les taux élevés de récidive nécessitent tout au long du suivi, ce qui rend le cancer de la vessie l'un des cancers les plus coûteuses à traiter. Le traitement de référence pour la haute qualité CVSEM est la résection trans-urétrale, suivie par immunothérapie intravésicale avec le BCG. Bien que le mécanisme précis de l'activité anti-tumorale de BCG doit encore être élucidé, il est admis que l'activation d'une réponse immunitaire à médiation cellulaire enrichie en lymphocytes T auxiliaires (Th) et une T cytotoxiques (Tc) une des cellules est essentiel pour la réussite de la thérapie 2.
Malgré le fait que le BCG reste le traitement de choix pour CVSEM, une forte proportion de patients ne répondent pas à la thérapie; En outre, il peut causer un certain nombre d'effets secondaires: environ 70% des tumeurs traitées réapparaissent après un certain temps et ~ 15% progrès à la forme du muscle-invasivemaladie. D'autres effets secondaires associés au traitement par le BCG comprennent dysurie, cystite et une infection des reins 3-6.
Le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques doit prendre en considération l'utilisation de modèles précliniques, après évaluation initiale in vitro; ceci est particulièrement pertinent dans les tumeurs dont microenvironnement peut influencer de manière significative leur développement et leur réponse au traitement.
Au cours de la dernière décennie, nous avons abordé plusieurs aspects de l'activité de modulation immunitaire de HP-NAP, une protéine produite par la bactérie Helicobacter pylori, initialement identifiée comme capable de favoriser l'adhésion endothéliale de polynucléaires (PMN) 7. Structurellement, HP-NAP appartient à la protéine d'ADN-protecteur dans des conditions affamés (DPS) de la famille 8 et se compose de 12 sous-unités identiques disposées dans une enveloppe dodecameric.
Nous avons démontré que HP-NAP estun récepteur de type Toll (TLR) 2 agoniste, avec une activité immuno-modulation fort responsable de la conduite de la différenciation des lymphocytes T vers le phénotype Th1, à la fois in vitro et in vivo 10/09. En vertu de cette activité, HP-NAP est capable de rediriger la réponse immunitaire Th2 en réponse Th1 la plus bénéfique dans un modèle murin d'asthme allergique 11.
Pour évaluer le potentiel anti-tumoral Th1 dépendante de HP-NAP, nous avons profité d'un modèle murin de cancer de la vessie développé il ya plusieurs années par O'Donnel et ses collègues 12 pour évaluer l'impact de l'administration du BCG.
Avec ce protocole, nous démontrons que HP-NAP a un potentiel anti-tumoral puissant contre le cancer de la vessie et que l'efficacité de l'administration HP-NAP est parallèle à l'accumulation importante, dans les noeuds de la tumeur et les ganglions lymphatiques régionaux, à la fois des lymphocytes de type Th1 et Tc1 produire de l'interféron ( IFN) -γ 13
Le présent rapport fournit un protocole de stepbystep, détaillant la préparation des animaux, leur cathétérisme urétral, la combustion chimique nécessaire pour la fixation des cellules de la muqueuse de la vessie, et l'injection de cellules tumorales. Nous décrivons également l'administration topique de HP-NAP qui peut être considéré comme un prototype de tous les agents thérapeutiques développées pour le traitement du cancer de la vessie. Les preuves obtenues en comparant les tumeurs isolées de contrôle et HP-NAP-animaux traités souligne non seulement le fait que HP-NAP pourrait être un bon candidat pour l'immunothérapie du cancer de la vessie, mais aussi l'efficacité générale de l'installation expérimentale.
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Protocol
Toutes les procédures de manipulation des animaux ont été approuvés par le ministère italien de la Santé (DM 204/2011-B).
1. Les animaux
- Cultivez souris femelles C57BL6 / J 8 semaines d'âge dans les cages individuellement ventilées avec des filtres de microisolation.
Note: Les femelles sont préférés car la conformation anatomique de leur appareil uro-génital externe rend le cathétérisme plus facile que chez les hommes.
2. Culture cellulaire
- Maintenir la lignée cellulaire de carcinome urothélial de la souris MB49 en milieu RPMI 1640 supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal inactivé à la chaleur et 50 ug / ml de gentamicine à 37 ° C humidifié à 5% de CO 2.
- Cultiver les cellules MB49 dans des flacons T-75 à 80% de confluence. Trypsiniser et remettre en suspension à 0,5 x 10 5 à 0,5 x 10 6 cellules par 150 pi de PBS avant l'implantation chez la souris.
3. intravésicale tumeur Implant
- Anesthésier les souris en utilisant un mélange des anesthésiques et Zoletil Xylor (33 mg / kg et 20 mg / kg, respectivement), injecté par voie intraperitoneale.
- Placez les animaux dans une position couchée et fixer les pattes de derrière pour le tampon avec du scotch. Pattes doivent être suffisamment séparés pour rendre le méat urétral bien visible et facilement accessible pour l'insertion du cathéter.
- Remarque: Pour le cathétérisme, un cathéter veineux pédiatrique 24 G est adapté pour les souris 8 à 10 semaines-vieux. Le choix du cathéter est très important afin d'éviter les fuites de liquide entre la paroi de l'urètre et du cathéter. Cathéters plus larges de forage doivent être utilisés pour les souris plus grands ou plus.
- En utilisant une petite pince, pincez un bord de la partie externe de l'urètre et de le tordre très doucement vers la "tête" de la souris. Cette action expose le méat urétral.
- Retirer l'aiguille du cathéter interne et insérer celle-ci dans l'urètre d'un angle de 45 °, légèrement orientéevers la "queue" de la souris. Ne pas forcer l'entrée du cathéter; en cas de résistance, il suffit de tourner le cathéter très doucement, jusqu'à ce qu'il glisse à l'intérieur de l'urètre. Quand environ 0,5-0,8 cm du cathéter est dans l'urètre, placer soigneusement le cathéter parallèle à la queue des souris et insérez-le complètement.
- En utilisant une seringue de 1 ml, l'aiguille de laquelle doit être insérée dans le cathéter, laver la vessie de l'urine résiduelle en injectant 200 à 300 ul de PBS stérile et aspirer tout le liquide de la vessie.
- Remarque: Lors de l'injection du PBS, la vessie se remplira et un gonflement sera visible entre les pattes arrières des souris; ceci confirme que le cathétérisme est correcte. La plupart des cathéters ont un volume mort qui doit être considéré dans le calcul du volume d'injection.
- En utilisant une seringue de 1 ml stérile, injecter 200 pi de HCl 0,1. Remplissez la vessie afin de brûler toute sa paroi. Après 10 sec, retirer tout l'acide et neutrali immédiatementze par injection de 200 ul de NaOH 0,1 N avec une seringue stérile. En cas d'injection du plus grand nombre de cellules (0,5 x 10 6), l'étape d'acidification est pas nécessaire.
- Aspirer tout le liquide résiduel et rincer immédiatement la cavité avec 300 pi de PBS stérile.
- Vider la vessie par aspiration, et injecter 150 pi de PBS contenant des cellules MB49 (gamme 0,5 x 10 5 à 0,5 × 10 6) dans la vessie. Laisser la seringue monté sur le cathéter afin d'éviter la fuite des cellules. Il est préférable de fixer la seringue en le fixant sur le tampon avec du scotch.
- Après 1 heure, extrait doucement le cathéter à partir de l'urètre, et de placer les souris dans la cage, sous une lampe à incandescence jusqu'à leur réveil: cela se produit habituellement entre une et deux heures après la fin du traitement.
4. Livraison intravésicale de HP-NAP
- Remarque: Au moins 3 jours après l'instillation de cellules, il est possible de commencer latraitement.
- Cathétériser la manière décrite dans les étapes 3.1 à 3.4. A ce stade, il ne faut pas brûler la paroi de la vessie avec HCl.
- En utilisant une seringue de 1 ml, laver la vessie de l'urine résiduelle en injectant 200 à 300 ul de PBS stérile et aspirer tout le liquide de la vessie.
- Injecter 50 pg de HP-NAP par 150 ul de PBS dans la vessie. Laisser la seringue fixée au cathéter pour éviter une fuite de la solution de protéine. Fixer la seringue en la fixant à la pastille avec du scotch.
- Après 1 heure, extrait doucement le cathéter de l'urètre et de placer les souris dans la cage, sous une lampe à incandescence, jusqu'à ce qu'ils se réveillent.
5. Tumeur explants et de l'analyse histologique
- A la fin du traitement, sacrifier les animaux, les placer dans les positions couchée et fixer les pattes de derrière pour le tampon avec du scotch.
- Avec un scalpel chirurgical, faire une incision verticale d'environ 1,52 cm de long à travers la peau et de lapéritoine, en commençant juste au-dessus des organes génitaux externes de la "tête" de la souris. Pour minimiser le risque d'endommager la vessie, accorder une attention particulière à la profondeur de la coupe.
- La vessie sera placé dans le centre-gauche de la coupe et la tumeur sera visible comme une masse rose / violet foncé. Lors de son excision, placer toute la vessie dans une cage histologique et fixer 10% de formol tamponné avant de l'intégrer dans de la paraffine.
- Pour l'analyse histologique et histochimique immunitaire, préparer des coupes en série de la vessie (46 um d'épaisseur de) en utilisant un microtome standard.
- Colorer les sections avec hématoxyline / éosine et procéder au calcul de la taille de la tumeur (D xd 2) et déterminer le pourcentage de la nécrose par zone transversale en utilisant un analyseur d'image assistée par ordinateur.
- Pour récipient comptage, procéder par coloration des sections pour le marqueur endothelial CD31 / PECAM, en utilisant une technique d'immunoperoxydase standard. Scannez les sections d'unt faible puissance (4 ×) pour identifier la zone de la densité vasculaire plus élevé. Dans cette région, compter microvaisseaux individuels dans cinq champs aléatoires distincts à haute puissance (20 ×).
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Representative Results
La figure 1 illustre la technique de cathétérisation; la souris est sondé et inculqué avec 0,5 × 10 6 cellules MB49. Le traitement avec HP-NAP est démarré 3 jours après l'injection des cellules tumorales, pour leur permettre de fixer sur la paroi de la vessie et proliférer. Tous les animaux appartenant au groupe de contrôle développer la tumeur; certains d'entre eux peuvent mourir avant la fin de la période de 13 jours en raison de l'occlusion de l'urètre.
Après la première injection avec HP-NAP, les animaux sont traités tous les trois jours, pour un total de quatre injections. A la fin de l'expérience, au jour treize, les animaux sont sacrifiés et les vessies recueillies pour analyse histologique et histochimique immunitaire. Comme le montre la Figure 2A, le volume de la tumeur à l'intérieur de la vessie de souris HP-NAP-traitée est considérablement plus petite que celle de la tumeur des souris traitées avec le véhicule (220 ± 62 vs 830 mm 3 ± 180 mm 3).
Fait intéressant, tandis que chez les animaux traités avec le véhicule de la tumeur envahit le tissu adipeux sous-jacente, dans 7 des 8 animaux HP-NAP-traités de la tumeur est confinée à l'intérieur de la paroi de la vessie (figure 2B). Enfin, la vascularisation est réduite et l'étendue de la nécrose est augmentée chez les souris HP-NAP-traitée, par rapport aux animaux témoins (Figure 2B et C).
Figure 1. Souris cathétérisme. Des souris femelles sont anesthésiés et cathétérisés aide d'une canule stérile 24 G. Le panneau de droite est le grossissement de la boîte noire. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. L'activité anti-tumorale de HP-NAP. Souris, implanté au jour 0 avec des cellules MB49 (0,5 × 10 6), sont traités avec 50 pg de HP-NAP ou PBS (véhicule) aux jours 3, 6, 9 et 12. Tous les animaux sont tués au jour 13. (A) de l'analyse histologique Représentant vessies isolées de souris de contrôle et les animaux HP-NAP-traitée, et le volume de la tumeur quantification. (B) d'agrandissement des sections du panneau A et le pourcentage de nécrose dans les deux groupes d'animaux. (C) vessies exérèse, colorées pour CD31 / PECAM; sections représentatives de contrôle et animaux HP-NAP-traités sont présentés. La quantification de la densité des microvaisseaux (C, panneau de droite); HPF, champs forte puissance. Les données représentent moyenne ± l'écart; n = 8 souris par groupe. La signification statistique a été déterminée par la t -test de l'étudiant (** p <0,01). Figure modifiée à partir Codolo et. 13 al. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
La majorité des avancées dans le traitement du cancer nécessitent des essais sur des modèles animaux avant de commencer les essais cliniques. La possibilité d'étudier la biologie des tumeurs in vivo, profitant de modèles animaux, représente un outil essentiel pour les chercheurs de l'enquête pathogenèse du cancer, permettant l'évaluation des différentes approches thérapeutiques. Orthotopiques modèles restent l'étalon-or 14-15, à la fois en raison de l'énorme quantité de lignées de cellules disponibles pour mettre en place un modèle de tumeur et parce qu'ils imitent l'environnement de la tumeur d'origine naturelle 16.
En outre, la mise en place de modèles orthotopiques cancer chez les souris syngéniques, comme décrit ici, est particulièrement pertinent dans le cas d'études visant à étudier de nouvelles stratégies thérapeutiques basées sur l'immunothérapie, puisque celle-ci ne sont pas possibles dans des souris immunodéficientes qui subissent xenoimplants.
La méthodologie décrite dans ce protocole décrit til cathétérisme de l'urètre de la souris femelle qui permet à la fois l'inoculation des cellules tumorales et l'administration d'agents thérapeutiques dans la cavité de la vessie.
L'avantage de préconditionnement de la paroi de la vessie par une brûlure à l'acide (comme indiqué ci-dessus, à la place d'autres approches, telles que l'utilisation de la trypsine ou poly-lysine), est celle de promouvoir le développement de tumeurs grosses et très envahissantes. Au contraire, le préconditionnement avec de la trypsine et la poly-lysine, des résultats dans les tumeurs plus petites et moins invasives, probablement en raison d'un effet préjudiciable des résidus de ces substances sur la viabilité des 17 cellules tumorales. La brûlure acide est également préférable à un autre système de pré-conditionnement basé sur la cautérisation électrique car celui-ci peut provoquer la perforation de la paroi de la vessie et de la diffusion de la tumeur dans le péritoine 18.
Le protocole a été optimisé pour les études à court terme (~ 13 jours). L'implantation de la prNuméro oper de cellules est essentiel, car un certain nombre de cellules plus élevée se traduira par une croissance plus rapide de la tumeur et peut-être la perte d'animaux en raison de la charge tumorale importante. En outre, jusqu'à ce que l'utilisateur devient à l'aise avec la technique, il ya un certain degré de risque d'endommager l'urètre ou de la vessie, provoquant ainsi la mort des animaux. Dans notre expérience, cependant, si les animaux sont suffisamment exploités (et donc ne meurent pas au cours de la procédure), ils vivent sans souffrir pour la durée des expériences (13 jours). En outre, en réduisant le nombre de cellules injectées, il est possible de prolonger la durée des expériences.
Nous avons utilisé ce modèle pour évaluer l'activité anti-tumorale de la protéine HP-NAP produite par Helicobacter pylori, dans le but d'améliorer, et éventuellement remplacer, la thérapie actuelle basée sur le BCG avec un nouveau doté d'une hausse des prestations / effets secondaires rapport. Plus généralement, cette approche expérimentale peut être adoptée dans tous les pré-Cliniévaluations ques qui nécessitent l'administration d'agents thérapeutiques dans la cavité de la vessie.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrentes.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par l'Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro, Ministère italien de l'université et de la recherche, les projets et Prin Progetti di Ricerca di Ateneo, accorder N ° CPDA137871, Fondazione Cariplo, accorder N ° 2011-0485 à MdB, et par Finanziamento Giovani Studiosi, Université de Padoue, à Gaia Codolo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| C57BL/6J female mice | Harlan Italy (Udine, Italy) | ||
| MB49 Cells | Obtained from Prof. O'Donnel, University of Iowa Carver College of Medicine, Iowa, USA | ||
| RPMI | Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) | R8758 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D1408 | 10X, to be diluted in apyrogenic water |
| Flask | Becton Dickinson (Franklin Lakes, New Jersey, USA) | 353135 | |
| Syringe 1ml | Becton Dickinson | 301358 | |
| Trypsin | Life Technologies (Waltham, Massachusetts, USA) | ||
| Gentamycin | Life Technologies | 15710-049 | |
| Xilor | Bio 98 s.r.l. (Milano, Italy) | 2% Xylazin | |
| Zoletil | Virbac (Carros, France) | 359713301992 | 5% Zolazepam + 5% Tiletamine |
| 24G Catheter | Terumo (Rome, Italy) | SR+DM2419PX | |
| HCl | Carlo Erba Reagents (Milano, Italy) | 403871 | Liquid |
| NaOH | JT Baker (Center Valley, Pennsylvania, USA) | 10095011 | Powder |
| Equipment | |||
| Surgical Scalpel | Albion Surgical Limited (Sheffield, England) | ||
| Microtome | Leica Microsystem ( Wetzlar, Germany) | RM2235 | |
| Microscope Slides | VWR International (Radnor, Pennsylvania, USA) | 631-0108 | |
| Image Analyzer | Zeiss (Jena, Germany) | Cyres System | |
References
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