Introduction
סרטן שלפוחית השתן הוא אחד מסוגי הסרטן הנפוצים ביותר במערכת ואברי המין, עם כמעט 75,000 מקרים חדשים בכל שנה בארה"ב 1. שיעור גבוה של הישנות דורש מעקב לכל החיים, מה שהופך את סרטן שלפוחית השתן אחד מסוגי הסרטן היקרים ביותר לטיפול. הטיפול הסטנדרטי הזהב לדרגה הגבוהה NMIBC הוא כריתת טרנס-שופכה, ואחריו טיפול חיסוני שלפוחית עם BCG. למרות שהמנגנון המדויק של הפעילות אנטי-הסרטני של BCG נותר הובהר במלואו, הוא קיבל את זה ההפעלה של תגובה חיסונית של תאים מועשרים בעוזר T (Th) 1 ורעיל לתאי T (TC) 1 תאים חיונית ל ההצלחה של הטיפול 2.
למרות העובדה כי BCG נשאר טיפול הבחירה בNMIBC, שיעור גבוה של חולים אינם מגיב לטיפול; יתר על כן, זה יכול לגרום למספר תופעות לוואי: כ -70% מגידולים שטופלו יחזרו אחרי כמה זמן ו~ התקדמות 15% לטופס השריר פולשנית שלמחלה. תופעות לוואי אחרים הקשורים לטיפול BCG כוללים dysuria, דלקת שלפוחית השתן ודלקת כליות 3-6.
פיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשניות חייב לקחת בחשבון את השימוש במודלים פרה-קליניים, הבא במבחנה הערכה ראשונית; זה רלוונטי במיוחד בגידולי מייקרו-סביבה שיכול להשפיע באופן משמעותי לפיתוח והיענותם לטיפול.
בעשור האחרון, יש לנו לטפל בהיבטים שונים של פעילות הוויסות החיסונית של HP-NAP, חלבון היוצר על ידי החיידק הליקובקטר פילורי, בתחילה זוהה כמסוגל לקדם הידבקות האנדותל של תאי polymorphonuclear (PMNs) 7. מבחינה מבנית, HP-NAP שייך לחלבון הגנה-DNA בתנאים מורעבים משפחה (DPS) 8 וכולל 12 יחידות משנה זהות מסודרות בקליפת dodecameric.
אנחנו הוכחנו כי HP-NAP הואקולט-כמו אגרה (TLR) 2 אגוניסט, עם פעילות ויסות-חיסונית חזקה אחראית לנהיגת הבידול של T לימפוציטים כלפי פנוטיפ Th1, הן במבחנה in vivo 9-10. בכוחה של פעילות זו, HP-NAP יכול להפנות את התגובה החיסונית Th2 לתגובת Th1 מועיל יותר במודל עכברי של אסתמה אלרגית 11.
כדי להעריך את הפוטנציאל אנטי-הסרטני Th1 תלוי של HP-NAP, נצלנו מודל עכבר של סרטן שלפוחית השתן שפותח לפני מספר שנים על ידי O'Donnel ועמיתים 12 להערכת ההשפעה של ממשל BCG.
עם פרוטוקול זה, אנו מראים כי HP-NAP יש פוטנציאל אנטי-סרטני חזק נגד סרטן שלפוחית השתן ושהיעילות של ממשל HP-NAP מקביל להצטברות המשמעותית, בתוך בלוטות הלימפה אזורית וגידול, של שני לימפוציטים מסוג Th1 וTc1 ייצור אינטרפרון ( IFN) -γ 13
הדו"ח הנוכחי מספק פרוטוקול stepbystep, המפרט את ההכנה של בעלי החיים, צנתור שופכתם, השריפה הכימית הנדרשת לחיבור של תאי רירית שלפוחית השתן, וההזרקה של התאים הסרטניים. אנו גם מתארים את הממשל המקומי של HP-NAP שיכול להיחשב כאב טיפוס של כל סוכנים טיפוליים שפותחו לטיפול בסרטן שלפוחית השתן. הראיות שהושגו על ידי השוואת גידולים מבודדים משליטה וHP-טופל NAP בעלי החיים מדגישה לא רק את העובדה שHP-NAP יכול להיות מועמד טוב לטיפול חיסוני בסרטן שלפוחית השתן, אלא גם את היעילות הכללית של הניסוי להגדיר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הנהלים לטיפול בבעלי חיים אושרו על ידי משרד בריאות האיטלקי (DM 204/2011-B).
1. בעלי חיים
- לגדול נקבות עכברי C57BL6 / י עד 8 שבועות של גיל בכלובים מאווררים בנפרד עם מסנני microisolation.
הערה: נקבות הם העדיפו כי קונפורמציה האנטומי של מנגנון uro באיברי המין החיצוני שלהם הופכת את הצנתור קל יותר מאשר בגברים.
תרבות 2. תא
- לשמור על קו urothelial עכבר תא קרצינומה MB49 במדיום RPMI 1,640 בתוספת 10% בסרום שור עוברי חום מומת ו -50 מיקרוגרם / מיליליטר גנטמיצין על 37 מעלות צלזיוס ב5% CO 2 humidified.
- לגדל תאי MB49 בT-75 צלוחיות למפגש 80%. Trypsinize וגלול ברמה של 0.5 × 10 5-0.5 × 10 6 תאים לכל 150 μl של PBS לפני ההשתלה בעכברים.
3. השלפוחית Tumour שתל
- הרדימי עכברים באמצעות שילוב של zoletil ההרדמה וxylor (33 מ"ג / קילוגרם ו -20 מ"ג / קילוגרם, בהתאמה), הזריק intraperitoneally.
- הנח בעלי חיים במצב שכיבה ולתקן את הרגליים האחוריות למשטח עם נייר דבק. כפות יש להפריד מספיק כדי להבהיר meatus השופכה גם הגלוי ונגיש להחדרת הצנתר.
- הערה: הצנתור, צנתר ורידי ילדים 24 G מתאים לעכברים 8 עד 10 שבועות-ישנים. הבחירה של צנתר היא מאוד חשובה כדי למנוע דליפה של נוזל בין קיר השופכה וקטטר. צנתרים שעם גדולים יותר יש להשתמש לעכברים גדולים יותר או מבוגרים יותר.
- באמצעות זאטוט קטן, לצבוט קצה אחד של חלק החיצוני של שופכה ולסובב אותו בעדינות רבה לכיוון "סוף הראש" של העכברים. פעולה זו חושפת את meatus השופכה.
- הסר את המחט הפנימית של הצנתר והכנס את האחרון בשופכה בזווית של 45 מעלות, מעט אוריינטציהלקראת "הזנב" של העכברים. אל תכריח את הכניסה של צנתר; במקרה של התנגדות, פשוט לסובב את הקטטר מאוד בעדינות, עד שהוא מחליק בתוך השופכה. כאשר על 0.5-0.8 סנטימטר של הצנתר הוא בשופכה, בזהירות במקום מקביל קטטר לזנב של העכברים והכניסו אותו לחלוטין.
- באמצעות מזרק 1 מיליליטר, המחט שיש להיות מוכנסים בקטטר, לשטוף את שלפוחית שתן משייר על ידי הזרקת 200-300 μl של PBS סטרילי ולשאוב את כל הנוזל משלפוחית השתן.
- הערה: כאשר הזרקת PBS, השלפוחית תתמלא ונפיחות תהיה גלויה בין הרגליים האחוריות של העכברים; זה מאשר כי הצנתור הוא נכון. רוב הצנתרים נפח מת שיש לקחת בחשבון בעת חישוב נפח ההזרקה.
- באמצעות מזרק 1 מיליליטר סטרילי, להזריק 200 μl של 0.1 N HCl. מלא את השלפוחית כדי לשרוף כל הקיר שלה. לאחר 10 שניות, להסיר את כל החומצה ומייד neutralize ידי הזרקת 200 μl של 0.1 N NaOH עם מזרק סטרילי. במקרה של הזרקה של המספר הגבוה ביותר של תאים (0.5 × 10 6), לא נדרש צעד החמצה.
- כל הנוזל שיורית לשאוב ומייד לשטוף את החלל עם 300 μl של PBS סטרילי.
- רוקן את שלפוחית השתן על ידי שאיפה, ולהזריק 150 μl של PBS המכיל תאי MB49 (טווח 0.5 × 10 5-0.5 × 10 6) לשלפוחית השתן. השאר את המזרק התאסף לקטטר כדי למנוע הדליפה של תאים. עדיף להבטיח את המזרק על ידי תיקון אותו למשטח עם נייר דבק.
- אחרי שעה 1, בעדינות לחלץ את הקטטר מהשופכה, ולמקם את העכברים בכלוב, תחת מנורת ליבון עד שהם מתעוררים: זה קורה בדרך כלל בין 1 ל 2 שעות לאחר תום הטיפול.
4. משלוח שלפוחית של HP-NAP
- הערה: לפחות 3 ימים לאחר החדרת תא, אפשר להתחילטיפול.
- קטטר כמתואר בצעדים 3.1-3.4. בשלב זה, אין צורך לשרוף את קיר שלפוחית השתן עם HCl.
- באמצעות מזרק 1 מיליליטר, לשטוף את שלפוחית שתן משייר על ידי הזרקת 200-300 μl של PBS סטרילי ולשאוב את כל הנוזל משלפוחית השתן.
- הזרק 50 מיקרוגרם של HP-NAP לμl 150 PBS לתוך שלפוחית השתן. השאר את המזרק המצורף לקטטר כדי למנוע דליפה של פתרון החלבון. אבטח את המזרק על ידי תיקון אותו למשטח עם נייר דבק.
- אחרי שעה 1, בעדינות לחלץ את הקטטר מהשופכה ולמקם את העכברים בכלוב, תחת מנורת ליבון, עד שהם מתעוררים.
5. Tumour Explants וניתוח היסטולוגית
- בסופו של הטיפול, להקריב בעלי החיים, למקם אותם בעמדות שכיבה ולתקן את הרגליים האחוריות למשטח עם נייר דבק.
- באמצעות אזמל כירורגי, לעשות חתך אנכי ארוך על 1.52 סנטימטר דרך העור והצפק, מתחיל בדיוק מעל איברי מין חיצוניים ל" סוף הראש "של העכברים. כדי למזער את הסיכון של פגיעה בשלפוחית השתן, להקדיש תשומת לב מיוחדת לעומק של החתך.
- שלפוחית השתן ימוקם במרכז-השמאל של הקיצוץ והגידול יהיה גלוי כגוש ורוד / סגול כהה. על כריתתו, למקם את כל שלפוחית השתן בכלוב היסטולוגית ולתקן ב 10% פורמלין שנאגרו לפני ההטבעה בפרפין.
- להיסטולוגית וניתוח histochemical חיסוני, להכין חלקים סידוריים של שלפוחית השתן (46 עובי מיקרומטר) באמצעות microtome סטנדרטי.
- להכתים את החלקים עם haematoxylin / eosin ולהמשיך בחישוב של גודל גידול (D XD 2) וקביעת אחוז הנמק לשטח חתך באמצעות נתח תמונה בעזרת מחשב.
- לספירת כלי, להמשיך על ידי צביעת החלקים לCD31 סמן אנדותל / PECAM, תוך שימוש בטכניקת פרוקסידאז סטנדרטית. סרוק את הסעיפיםt חשמל נמוך (4 ×) כדי לזהות את האזור של צפיפות כלי דם הגבוהה ביותר. בתוך אזור זה, לספור microvessels בודדת בחמישה תחומים נפרדים אקראיים בהספק גבוה (20 ×).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 מציג את טכניקת הצנתור; עכבר צינתור והחדיר עם 0.5 × 10 6 תאים MB49. טיפול עם HP-NAP הוא התחיל 3 ימים לאחר ההזרקה של תאים סרטניים, כדי לאפשר להם לצרף אל קיר שלפוחית השתן ולהתרבות. כל בעלי החיים המשתייכים לקבוצת השליטה לפתח הגידול; חלק מהם עלול למות לפני תום תקופת 13 היום בשל החסימה של השופכה.
לאחר הזריקה הראשונה עם HP-NAP, מטופלים בעלי החיים בכל שלושה ימים, עבור הסכום כולל של ארבע זריקות. בסוף הניסוי, ביום שלוש עשרה, בעלי החיים מוקרבים והשלפוחיות שנאספו לניתוח histochemical היסטולוגית וחיסוני. כפי שניתן לראות באיור 2 א, היקף הגידול בשלפוחית השתן מעכברים שטופל HP-NAP הוא קטן יותר באופן משמעותי מזה של הגידול של עכברים שטופל רכב (220 ± 62 מ"מ 3 לעומת 830 ± 180 מ"מ 3).
מעניין לציין כי בעוד בבעלי חיים שטופל רכב הגידול פולש לרקמות שומן הבסיסיות, ב -7 מתוך 8 בעלי החיים שטופלו HP-NAP הגידול מוגבל בתוך קיר שלפוחית השתן (איור 2). לבסוף, כלי דם מופחת והמידה של נמק הוא גדל בעכברי HP-טופל NAP, ביחס לבעלי חיים לשלוט (איור 2 ו- C).
צנתור 1. עכברים איור. נקבות עכברים מורדמים וצינתור באמצעות צינורית סטרילי 24 G. הפנל הימני הוא הגדלה של הקופסה השחורה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
2. פעילות איור אנטי גידול של HP-NAP. עכברים, מושתלת ביום 0 עם MB49 תאים (0.5 × 10 6), מטופלים 50 מיקרוגרם של HP-NAP או PBS (רכב) עם על 3 ימים, 6, 9 ו 12. כל בעלי החיים נהרגים ביום 13. ניתוח היסטולוגית נציג בשלפוחיות מבודדות מעכברי שליטה ובעלי חיים שטופל HP-NAP, וכימות נפח גידול (). הגדלה (ב) לחלקים של לוח ואחוז הנמק בשתי קבוצות של בעלי חיים. (ג) שלפוחיות כריתה, מוכתמות עבור CD31 / PECAM; סעיפי נציג משליטה ובעלי החיים שטופל HP-NAP מוצגים. כימות צפיפות microvessel (C, פנל מימין); HPF, שדות highpower. הנתונים מייצגים SD ± ממוצע; n = 8 עכברים לכל קבוצה. משמעות סטטיסטי נקבעה על ידי -test של הסטודנטים לא (** p <0.01). דמות שונה מאח Codoloאל. 13. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
רוב ההתקדמות בטיפול בסרטן דורשים בדיקות במודלים של בעלי חיים לפני שמתחיל ניסויים קליניים. האפשרות ללמוד ביולוגיה גידול in vivo, מנצל מודלים של בעלי חיים, מהווה כלי חיוני לחוקרים חוקרים פתוגנזה של הסרטן, המאפשרים ההערכה של גישות טיפוליות שונות. דגמי orthotopic יישארו סטנדרטי 14-15 הזהב, הן בשל הסכום של שורות תאים הענק זמין להקים מודל גידול וכי הם מחקים את הסביבה של הגידול הטבעי 16.
יתר על כן, הקמת מודלים orthotopic של סרטן בעכברי syngeneic, כפי שתואר כאן, רלוונטי במיוחד במקרה של מחקרים שנועדו לבחון אסטרטגיות טיפוליות חדשות המבוססות על טיפול חיסוני, מאז שהאחרון אינו אפשרי בעכברים חסרים חיסוניים שעוברים xenoimplants.
המתודולוגיה המתוארת בפרוטוקול זה מתארת tהוא הצנתור של שופכה עכבר נקבה המאפשרת גם החיסון של תאים סרטניים והממשל של סוכנים טיפוליים לתוך חלל שלפוחית השתן.
היתרון של נפשית מראש קיר שלפוחית השתן באמצעות צריבת חומצה (כפי שפורט לעיל, במקום גישות אחרות, כגון השימוש בטריפסין או פולי-ליזין), הוא זו של קידום הפיתוח של גידולים גדולים והחודרניים ביותר. להיפך, נפשית מראש עם טריפסין ופולי-ליזין, תוצאות בגידולים קטנים יותר ופחות פולשני, ככל הנראה בשל השפעה מזיקה של שאריות של חומרים אלו על יכולת הקיום של תאים סרטניים 17. צריבת החומצה גם העדיפה מערכת נפשית מראש אחרת המבוססת על צריבה חשמלית משום שהאחרון עלול לגרום לניקוב של קיר שלפוחית השתן וההפצה של הגידול לתוך 18 הצפק.
הפרוטוקול כבר מותאם למחקרים לטווח קצר (~ 13 ימים). השתלת יחסי הציבורמספר אופר של תאים הוא קריטי, שכן מספר תא גבוה יותר יגרום ליותר צמיחת גידול מהיר ואולי אובדן של בעלי חיים עקב נטל גידול גדול. יתר על כן, עד שהמשתמש הופך בטוח עם הטכניקה, יש מידה מסוימת של סיכון בפגיעה בשופכה או בשלפוחית השתן, ובכך גרם למותם של בעלי החיים. מניסיוננו, לעומת זאת, אם בעלי החיים מופעלים כראוי (ובכך אינו מתים במהלך ההליך), הם חיים בלי לסבול למשך הניסויים (13 ימים). יתר על כן, על ידי צמצום מספר התאים המוזרקים, אפשר להאריך את משך הניסויים.
השתמשנו במודל זה כדי להעריך את הפעילות האנטי-סרטנית של חלבון HP-NAP המיוצר על ידי הליקובקטר פילורי, במטרה לשפר, וסופו של דבר להחליף, הטיפול הנוכחי המבוסס על BCG עם אחד חדש ניחן ביתרונות / תופעות לוואי גבוהים יותר יחס. באופן כללי יותר, גישה ניסויית זה יכול להיות מאומץ בכל מראש cliniהערכות קאל הדורשים המשלוח של סוכנים טיפוליים לתוך חלל שלפוחית השתן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי Associazione Italiana ללה Ricerca sul Cancro, משרד האיטלקי של אוניברסיטות ומחקר, פרויקטי Prin וProgetti di Ricerca di Ateneo, להעניק N ° CPDA137871, Fondazione Cariplo, להעניק N ° 2,011-0,485 לMDB, ועל ידי Finanziamento ג'ובאני Studiosi, אוניברסיטה של פדובה, לגאיה Codolo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| C57BL/6J female mice | Harlan Italy (Udine, Italy) | ||
| MB49 Cells | Obtained from Prof. O'Donnel, University of Iowa Carver College of Medicine, Iowa, USA | ||
| RPMI | Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) | R8758 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D1408 | 10X, to be diluted in apyrogenic water |
| Flask | Becton Dickinson (Franklin Lakes, New Jersey, USA) | 353135 | |
| Syringe 1ml | Becton Dickinson | 301358 | |
| Trypsin | Life Technologies (Waltham, Massachusetts, USA) | ||
| Gentamycin | Life Technologies | 15710-049 | |
| Xilor | Bio 98 s.r.l. (Milano, Italy) | 2% Xylazin | |
| Zoletil | Virbac (Carros, France) | 359713301992 | 5% Zolazepam + 5% Tiletamine |
| 24G Catheter | Terumo (Rome, Italy) | SR+DM2419PX | |
| HCl | Carlo Erba Reagents (Milano, Italy) | 403871 | Liquid |
| NaOH | JT Baker (Center Valley, Pennsylvania, USA) | 10095011 | Powder |
| Equipment | |||
| Surgical Scalpel | Albion Surgical Limited (Sheffield, England) | ||
| Microtome | Leica Microsystem ( Wetzlar, Germany) | RM2235 | |
| Microscope Slides | VWR International (Radnor, Pennsylvania, USA) | 631-0108 | |
| Image Analyzer | Zeiss (Jena, Germany) | Cyres System | |
References
- Siegel, R., Ma, J., Zou, Z., Cancerstatistics Jemal, A. CA Cancer J Clin. 64, 9-29 (2014).
- Saint, F., et al. Prognostic value of a T helper 1 urinary cytokine response after intravesical bacillus Calmette-Guerin treatment for superficial bladder cancer. J Urol. 167, 364-367 (2002).
- Shahin, O., Thalmann, G. N., Rentsch, C., Mazzucchelli, L., Studer, U. E. A retrospective analysis of 153 patients treated with or without intravesical bacillus Calmette-Guerin for primary stage T1 grade 3 bladder cancer: recurrence, progression and survival. J Urol. 169, 96-100 (2003).
- Lamm, D. L.
- De Jager, R., et al. Long-term complete remission in bladder carcinoma in situ with intravesical TICE bacillus Calmette Guerin. Overview analysis of six phase II clinical trials. Urology. 38, 507-513 (1991).
- Dovedi, S. J., Davies, B. R. Emerging targeted therapies for bladder cancer: a disease waiting for a drug. Cancer Metastasis Rev. 28, 355-367 (2009).
- Evans, D. J., et al. Characterization of a Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. Infect Immun. 63, 2213-2220 (1995).
- Grant, R. A., Filman, D. J., Finkel, S. E., Kolter, R., Hogle, J. M. The crystal structure of Dps, a ferritin homolog that binds and protects DNA. Nat Struct Biol. 5, 294-303 (1998).
- Amedei, A., et al. The neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori promotes Th1 immune responses. J Clin Invest. 116, 1092-1101 (2006).
- Bernard, M., D'Elios, M. M. The immune modulating activity of the Helicobacter pylori HP-NAP: Friend or foe. Toxicon. 56, 1186-1192 (2010).
- Codolo, G., et al. The neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori down-modulates Th2 inflammation in ovalbumin-induced allergic asthma. Cell Microbiol. 10, 2355-2363 (2008).
- Gunther, J. H., et al. Optimizing syngeneic orthotopic murine bladder cancer (MB49). Cancer Res. 59, 2834-2837 (1999).
- Codolo, G., et al. HP-NAP inhibits the growth of bladder cancer in mice by activating a cytotoxic Th1 response. Cancer Immunol Immunother. 61, 31-40 (2012).
- Chan, E., Patel, A., Heston, W., Larchian, W. Mouse orthotopic models for bladder cancer research. BJU Int. 104, 1286-1291 (2009).
- Kubota, T. Metastatic models of human cancer xenografted in the nude mouse: the importance of orthotopic transplantation. J Cell Biochem. 56, 4-8 (1994).
- Loi, M., et al. The use of the orthotopic model to validate antivascular therapies for cancer. Int J Dev Biol. 55, 547-555 (2011).
- Miyazaki, K., et al. Preconditioning methods influence tumor property in an orthotopic bladder urothelial carcinoma rat model. Mol Clin Oncol. 2, 65-70 (2014).
- Horiguchi, Y., et al. Establishment of orthotopic mouse superficial bladder tumor model for studies on intravesical treatments. Hum Cell. 21, 57-63 (2008).
