Introduction
El cáncer de vejiga es uno de los cánceres más comunes del tracto urogenital, con cerca de 75.000 nuevos casos cada año en los EE.UU. 1. Las altas tasas de recurrencia requieren seguimiento de por vida, lo que hace que el cáncer de vejiga uno de los cánceres más costosas de tratar. El tratamiento estándar de oro para el alto grado CVNMI es la resección transuretral, seguida de inmunoterapia intravesical con BCG. Aunque el mecanismo exacto de la actividad anti-tumor de BCG aún no se ha aclarado completamente, se acepta que la activación de una respuesta inmune mediada por células enriquecido en T helper (Th) 1 y T citotóxicas (Tc) de las células 1 es crucial para el éxito de la terapia 2.
A pesar de que la BCG sigue siendo el tratamiento de elección para CVNMI, una alta proporción de los pacientes no responden a la terapia; por otra parte, puede causar una serie de efectos secundarios: alrededor del 70% de los tumores tratados se repita después de algún tiempo y ~ 15% de avance a la forma del músculo invasivo de laenfermedad. Otros efectos secundarios asociados con el tratamiento con BCG incluyen disuria, cistitis y la infección renal 3-6.
El desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas debe tomar en consideración el uso de modelos preclínicos, tras la evaluación inicial in vitro; esto es particularmente relevante en tumores cuya microambiente puede influir significativamente en su desarrollo y la capacidad de respuesta al tratamiento.
Durante la última década, hemos abordado varios aspectos de la actividad inmunomoduladora de HP-PAN, una proteína producida por la bacteria Helicobacter pylori, identificado inicialmente como capaz de promover la adhesión endotelial de las células polimorfonucleares (PMN) 7. Estructuralmente, HP-PAN pertenece a la proteína DNA-protector en condiciones de hambre (AD) de la familia 8 y consta de 12 subunidades idénticas dispuestas en una cáscara dodecameric.
Hemos demostrado que HP-NAP esun receptor Toll-like (TLR) 2 agonista, con una fuerte actividad inmuno-modulación responsable de impulsar la diferenciación de los linfocitos T hacia el fenotipo Th1, tanto in vitro como in vivo 9-10. En virtud de esta actividad, HP-PAN es capaz de redirigir la respuesta inmune Th2 en la respuesta más beneficiosa Th1 en un modelo murino de asma alérgica 11.
Para evaluar el potencial antitumoral Th1 dependiente de HP-PAN, nos aprovechamos de un modelo de ratón de cáncer de vejiga desarrollado hace varios años por O'Donnel y sus colegas 12 para evaluar el impacto de la administración de BCG.
Con este protocolo, nos demuestran que HP-PAN tiene un fuerte potencial antitumoral contra el cáncer de vejiga y que la eficacia de la administración de HP-PAN es paralela a la acumulación significativa, dentro del tumor y los ganglios linfáticos regionales, tanto de Th1 y Tc1 linfocitos que producen interferón ( IFN) -γ 13
El presente informe proporciona un protocolo stepbystep, que detalla la preparación de los animales, su cateterismo uretral, la quema químico requerido para la unión de las células a la mucosa de la vejiga, y la inyección de las células tumorales. También describimos la administración tópica de HP-NAP que se puede considerar como un prototipo de cualesquiera agentes terapéuticos desarrollados para el tratamiento de cáncer de vejiga. La evidencia obtenida mediante la comparación de los tumores aislados de control y HP-PAN-animales tratados enfatiza no sólo el hecho de que HP-PAN podría ser un buen candidato para la inmunoterapia del cáncer de vejiga, sino también la eficacia general del montaje experimental.
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Protocol
Todos los procedimientos de manipulación de los animales han sido aprobados por el Ministerio italiano de Salud (204/2011-B DM).
1. Los animales
- Crecer ratones hembras C57BL6 / J a 8 semanas de edad en jaulas ventiladas individualmente con filtros microaislamiento.
Se prefieren las hembras porque la conformación anatómica de su aparato uro-genital externa hace que el cateterismo más fácil que en los hombres: Nota.
2. Cultivo Celular
- Mantener la urotelial ratón línea celular de carcinoma MB49 en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal inactivado por calor y 50 mg / ml de gentamicina a 37 ° C en humidificado 5% CO 2.
- Crecer células MB49 en matraces T-75 a 80% de confluencia. Trypsinize y resuspender en el 0,5 × 10 5 a 0,5 × 10 6 células por 150 l de PBS antes de la implantación en ratones.
3. intravesical tumor Implante
- Anestesiar ratones utilizando una mezcla de la Zoletil anestésicos y xylor (33 mg / kg y 20 mg / kg, respectivamente), inyectado por vía intraperitoneal.
- Coloque los animales en posición supina y fijar las patas traseras a la plataforma con cinta scotch. Patas tienen que ser separados suficientemente para hacer que el meato uretral bien visible y fácilmente accesible para la inserción del catéter.
- Nota: Para el cateterismo, un catéter venoso pediátrico 24 G es adecuado para ratones 8 a 10 semanas de edad. La elección del catéter es muy importante con el fin de evitar fugas de líquido entre la pared uretral y el catéter. Catéteres de calibre más grandes deben ser utilizados para los ratones más grandes o más.
- Utilizando una pequeña pinza, apriete uno de los bordes de la parte externa de la uretra y girar suavemente hacia la "cabecera" de los ratones. Esta acción expone el meato uretral.
- Retire la aguja interna del catéter e insertar este último en la uretra en un ángulo de 45 °, orientado ligeramentehacia la "cola" de los ratones. No fuerce la entrada del catéter; en caso de resistencia, simplemente gire el catéter con mucha suavidad, hasta que se desliza dentro de la uretra. Cuando aproximadamente 0,5-0,8 cm del catéter es en la uretra, colocar cuidadosamente el catéter paralelo a la cola de los ratones y se inserte completamente.
- Usando una jeringa de 1 ml, la aguja de los cuales tiene que ser insertado en el catéter, lavar la vejiga de la orina residual mediante la inyección de 200-300 l de PBS estéril y aspirar todo el líquido de la vejiga.
- Nota: Cuando la inyección de PBS, la vejiga se llenará y una hinchazón será visible entre las patas traseras de los ratones; esto confirma que el cateterismo es la correcta. La mayoría de los catéteres tienen un volumen muerto que debe ser considerado en el cálculo del volumen de inyección.
- Usando una jeringa de 1 ml estéril, inyectar 200 l de HCl 0,1 N. Llene la vejiga para quemar toda su pared. Después de 10 segundos, retire todo el ácido y neutrali inmediatamenteze mediante la inyección de 200 l de NaOH 0,1 N con una jeringa estéril. En el caso de la inyección del mayor número de células (0,5 × 10 6), no se requiere la etapa de acidificación.
- Aspire todo el líquido residual e inmediatamente echar la cavidad con 300 l de PBS estéril.
- Vaciar la vejiga por aspiración, e inyectar 150 l de PBS que contienen células MB49 (rango de 0,5 × 10 5 a 0,5 × 10 6) en la vejiga. Deje la jeringa montada en el catéter para evitar la fuga de células. Es mejor para asegurar la jeringa fijándolo a la plataforma con cinta scotch.
- Después de 1 hora, extraer suavemente el catéter de la uretra, y colocar los ratones en la jaula, bajo una lámpara incandescente hasta que despiertan: esto ocurre generalmente entre 1 y 2 horas después del final del tratamiento.
4. Entrega intravesical de HP-PAN
- Nota: Por lo menos 3 días después de la instilación de células, es posible comenzar latratamiento.
- Cateterizarse como se describe en los pasos 3.1 a 3.4. En esta etapa, no es necesario para quemar la pared de la vejiga con HCl.
- Usando una jeringa de 1 ml, lavar la vejiga de la orina residual mediante la inyección de 200-300 l de PBS estéril y aspirar todo el líquido de la vejiga.
- Inyectar 50 g de HP-PAN por 150 l de PBS en la vejiga. Deje la jeringa conectada al catéter para evitar la fuga de la solución de proteína. Asegure la jeringa fijándolo a la plataforma con cinta scotch.
- Después de 1 hora, extraer suavemente el catéter de la uretra y colocar los ratones en la jaula, bajo una lámpara incandescente, hasta que se despiertan.
5. tumor explantes y el análisis histológico
- Al final del tratamiento, sacrificar a los animales, colocarlos en posición supina y fijar las patas traseras a la plataforma con cinta scotch.
- El uso de un bisturí quirúrgico, hacer una incisión vertical sobre 1,52 cm de largo a través de la piel y elperitoneo, empezando justo por encima de los genitales externos de la "cabecera" de los ratones. Para minimizar el riesgo de dañar la vejiga, prestar especial atención a la profundidad del corte.
- La vejiga se colocará en el centro-izquierda de la corte y el tumor será visible como una masa de color rosa / violeta oscuro. Tras su escisión, coloque toda la vejiga en una jaula histológico y fijar en el 10% formalina tamponada antes de la incrustación en parafina.
- Para análisis histológico e histoquímico inmune, preparar secciones en serie de la vejiga (46 micras de espesor) usando un microtomo estándar.
- Tinción de las secciones con hematoxilina / eosina y proceder con el cálculo del tamaño del tumor (D xd 2) y determinar el porcentaje de necrosis por área de sección transversal usando un analizador de imagen asistida por ordenador.
- Para el conteo buque, proceder por la tinción de las secciones para el marcador endotelial CD31 / PECAM, utilizando una técnica de inmunoperoxidasa estándar. Analiza las secciones de unt baja potencia (4 ×) para identificar el área de mayor densidad vascular. Dentro de esta región, cuente microvasos individuales en cinco campos aleatorios independientes a alta potencia (20 ×).
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Representative Results
La Figura 1 muestra la técnica de cateterismo; el ratón se cateterizó y inculca con 0,5 × 10 6 células MB49. El tratamiento con HP-NAP se inicia 3 días después de la inyección de las células tumorales, para que puedan adherirse a la pared de la vejiga y proliferar. Todos los animales pertenecientes al grupo de control se desarrollan el tumor; algunos de ellos pueden morir antes del final del período de 13 días debido a la oclusión de la uretra.
Después de la primera inyección con HP-NAP, los animales son tratados cada tres días, para un total de cuatro inyecciones. Al final del experimento, en el día trece, los animales se sacrificaron y se recogieron las vejigas para el análisis histoquímico histológico e inmunológico. Como se muestra en la Figura 2A, el volumen del tumor dentro de la vejiga a partir de ratones HP-NAP-tratada es significativamente menor que el del tumor de los ratones tratados con vehículo (220 ± 62 mm 3 vs 830 ± 180 mm 3).
Curiosamente, mientras que en los animales tratados con vehículo el tumor invade el tejido graso subyacente, en 7 de los 8 animales tratados con HP-PAN el tumor está confinado dentro de la pared de la vejiga (Figura 2B). Por último, se reduce la vascularidad y la extensión de la necrosis se incrementa en ratones HP-PAN-tratada, con respecto a los animales control (Figura 2B y C).
Figura 1. Los ratones cateterismo. Ratones hembra son anestesiados y cateterizaron usando una cánula estéril 24 G. El panel de la derecha es la ampliación de la caja de negro. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. La actividad antitumoral de HP-PAN. Los ratones, implantado en el día 0 con MB49 células (0,5 × 10 6), se trató con 50 g de HP-PAN o PBS (vehículo) en los días 3, 6, 9 y 12. Todos los animales son sacrificados en el día 13. (A) análisis histológico Representante en vejigas aisladas de ratones de control y los animales HP-PAN-tratada, y el volumen del tumor cuantificación. (B) Ampliación de las secciones del panel A y el porcentaje de necrosis en los dos grupos de animales. (C) vejigas resecadas, teñidos para CD31 / PECAM; se muestran secciones representativas de animales control y HP-PAN-tratada. La cuantificación de la densidad de los microvasos (C, panel derecho); HPF, campos de alta potencia. Los datos representan SD ± media; n = 8 ratones por grupo. La significación estadística se determinó mediante la prueba t de Student (** p <0,01). Figura modificada de Codolo etal., 13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La mayoría de los avances en el tratamiento del cáncer requiere pruebas en modelos animales antes de comenzar los ensayos clínicos. La posibilidad de estudiar la biología del tumor in vivo, aprovechando modelos animales, representa una herramienta fundamental para los investigadores que investigan la patogénesis del cáncer, lo que permite la evaluación de los diferentes enfoques terapéuticos. Modelos ortotópico siguen siendo el estándar de oro 14-15, tanto debido a la enorme cantidad de líneas celulares disponibles para establecer un modelo de tumor y porque imitan el entorno del tumor de origen natural 16.
Por otra parte, la creación de modelos ortotópico de cáncer en ratones singénicos, tal como se describe aquí, es particularmente relevante en el caso de estudios destinados a la investigación de nuevas estrategias terapéuticas basadas en inmunoterapia, ya que estos últimos no son posibles en ratones inmunodeficientes que se someten xenoimplantes.
La metodología descrita en este protocolo describe tél cateterización de un uretra femenina ratón que permite tanto la inoculación de las células tumorales y la administración de agentes terapéuticos en la cavidad de la vejiga.
La ventaja de preacondicionamiento de la pared de la vejiga a través de una quemadura de ácido (como se detalló anteriormente, en lugar de otros enfoques, tales como el uso de tripsina o poli-lisina), es la de promover el desarrollo de tumores grandes y altamente invasivos. Por el contrario, de preacondicionamiento con tripsina y poli-lisina, los resultados en los tumores más pequeños y menos invasivos, probablemente debido a un efecto perjudicial de los residuos de estas sustancias sobre la viabilidad de las células tumorales 17. La quemadura de ácido También se prefiere a otro sistema de acondicionamiento previo basado en la cauterización eléctrica debido a que el último puede provocar la perforación de la pared de la vejiga y la diseminación del tumor en el peritoneo 18.
El protocolo ha sido optimizado para los estudios a corto plazo (~ 13 días). La implantación de la prnúmero oper de las células es fundamental, ya que un número mayor de células se traducirá en más rápido crecimiento del tumor y posiblemente la pérdida de los animales debido a la carga tumoral grande. Por otra parte, hasta que el usuario se convierte en confianza con la técnica, hay un cierto grado de riesgo en dañar la uretra o la vejiga, causando así la muerte de los animales. En nuestra experiencia, sin embargo, si los animales se operan adecuadamente (y por lo tanto no mueren durante el procedimiento), viven sin sufrir por la duración de los experimentos (13 días). Por otra parte, mediante la reducción del número de células inyectadas, es posible prolongar la duración de los experimentos.
Se utilizó este modelo para evaluar la actividad anti-tumor de la proteína HP-NAP producida por Helicobacter pylori, con el objetivo de mejorar, y eventualmente sustituir, la terapia actual basado en BCG con uno nuevo dotado de un mayores beneficios / efectos secundarios proporción. En términos más generales, este enfoque experimental puede ser adoptado en todos los pre-cliniCal evaluaciones que requieren el suministro de agentes terapéuticos dentro de la cavidad de la vejiga.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro, el Ministerio italiano de la Universidad e Investigación, proyectos Prin y Progetti di Ricerca di Ateneo, conceder N ° CPDA137871, Fondazione Cariplo, concede N ° 2011 hasta 0485 a los BMD, y por Finanziamento Giovani studiosi, Universidad de Padua, a Gaia Codolo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| C57BL/6J female mice | Harlan Italy (Udine, Italy) | ||
| MB49 Cells | Obtained from Prof. O'Donnel, University of Iowa Carver College of Medicine, Iowa, USA | ||
| RPMI | Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) | R8758 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D1408 | 10X, to be diluted in apyrogenic water |
| Flask | Becton Dickinson (Franklin Lakes, New Jersey, USA) | 353135 | |
| Syringe 1ml | Becton Dickinson | 301358 | |
| Trypsin | Life Technologies (Waltham, Massachusetts, USA) | ||
| Gentamycin | Life Technologies | 15710-049 | |
| Xilor | Bio 98 s.r.l. (Milano, Italy) | 2% Xylazin | |
| Zoletil | Virbac (Carros, France) | 359713301992 | 5% Zolazepam + 5% Tiletamine |
| 24G Catheter | Terumo (Rome, Italy) | SR+DM2419PX | |
| HCl | Carlo Erba Reagents (Milano, Italy) | 403871 | Liquid |
| NaOH | JT Baker (Center Valley, Pennsylvania, USA) | 10095011 | Powder |
| Equipment | |||
| Surgical Scalpel | Albion Surgical Limited (Sheffield, England) | ||
| Microtome | Leica Microsystem ( Wetzlar, Germany) | RM2235 | |
| Microscope Slides | VWR International (Radnor, Pennsylvania, USA) | 631-0108 | |
| Image Analyzer | Zeiss (Jena, Germany) | Cyres System | |
References
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