Introduction
방광암 USA 1 거의 75,000 매년 새로운 사례로, 비뇨 생식 관의 가장 흔한 암이다. 재발의 높은 비율은 방광암 치료하는 비싼 암 중 하나를 만드는 평생 추적 관찰을 필요로한다. 고급 NMIBC의 황금 표준 치료는 BCG와 방광 면역 다음, 트랜스 요도 절제술이다. BCG의 항 종양 활성의 정확한 메카니즘은 완전히 밝혀지지 그대로지만, 그것은 T 헬퍼 (토륨) (1) 및 세포 독성 T (TC) 한 세포가 풍부한 세포 매개 면역 반응의 활성화에 중요한 것으로 받아 들여 이 요법의 성공.
BCG는 NMIBC위한 선택의 처리는 남아 있다는 사실에도 불구하고, 치료에 반응하지 않는 환자의 높은 비율; 또한, 부작용의 수를 일으킬 수있다 : 처리 된 종양의 약 70 %의 근육 침습적 형태 ~ 15 %의 진행을 일정 시간 후 재발 및질병. BCG 치료와 관련된 다른 부작용은 배뇨 장애, 방광염, 신장 감염 3-6을 포함한다.
신규 한 치료 전략의 개발은 초기 시험 관내 평가 다음, 고려 전임상 모델을 사용한다; 이것은 누구의 미세 크게 치료에 자신의 개발 및 응답에 영향을 미칠 수있는 종양에 특히 관련이있다.
지난 10 년간, 우리는 HP-NAP, 헬리코박터 파일로리 균에 의해 생성 된 단백질의 면역 변조 활동의 여러 측면을 언급 한 초기 다형 핵 세포 (백혈구) (7)의 내피 부착을 촉진 할 수있는 것으로 확인. 구조적으로, HP-NAP는 공복 상태 (DPS) 가족 (8)에서 DNA를 보호하는 단백질에 속하고 dodecameric 쉘에 배치 (12)와 동일한 서브 유닛으로 구성되어 있습니다.
우리는 HP-NAP가 있음을 증명하고있다T의 분화를 구동 할 책임 강력한 면역 조절 활성을 갖는 수신자 같은 수용체 (TLR) 2 효능 제는 시험 관내 및 생체 내 9-10 모두에서, 한 Th1 표현형으로 림프구. 이 활동의 미덕에서, HP-NAP는 알레르기 성 천식 (11)의 쥐 모델에서 더 유리한받은 Th1 반응에 TH2 면역 반응을 리디렉션 할 수 있습니다.
HP-NAP의받은 Th1 종속 항 종양 가능성을 평가하기 위해 BCG 투여의 영향을 평가하기위한 O'Donnel 동료 (12)에 의해 수년 전에 개발 방광암의 마우스 모델을 이용했다.
이 프로토콜로, 우리는 HP-NAP는 방광암에 대한 강력한 항 종양 가능성을 가지고 및 HP-NAP 관리의 효능 (인터페론을 생산 모두받은 Th1과에 T 림프구의 종양 및 지역 림프절 내에서 상당한 축적을 평행을 입증 IFN)은 13 -γ
본 보고서는 동물의 준비, 그들의 요도 카테터, 방광 점막 세포의 부착을 위해 필요한 화학적 연소 및 종양 세포의 주입을 자세하게, stepbystep으로 프로토콜을 제공한다. 또한 방광암의 치료를 위해 개발 된 임의의 치료제의 원형으로 간주 할 수있는 HP-NAP의 국소 투여를 기술한다. 제어 및 HP-NAP 처리 된 동물로부터 분리 된 종양을 비교하여 얻은 증거는 단지 HP-NAP 방광 암 면역 요법을위한 좋은 후보뿐만 아니라 셋업 실험의 전반적인 효율성이 될 수 있다는 사실을 강조한다.
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Protocol
동물 처리를위한 모든 절차는 건강의 이탈리아 교육부 (DM 2,011분의 204-B)에 의해 승인되었습니다.
1. 동물
- microisolation 필터를 개별적으로 환기 케이지 연령 8 주에 C57BL6 / J 여성 쥐를 성장.
참고 : 자신의 외부 URO-생식기 장치의 해부학 적 형태가 남성에 비해 카테터 쉽게 렌더링하기 때문에 여성이 바람직하다.
2. 세포 배양
- 가습 된 5 % CO 2에서 37 ° C에서 10 %의 열 - 불 활성화 된 소 태아 혈청 및 50 μg의 / ㎖ 젠타 마이신으로 보충 된 RPMI 1640 배지에서 마우스 urothelial 암종 세포주 MB49을 유지한다.
- 80 %의 합류에 T-75 플라스크에 MB49 세포를 성장. 를 Trypsinize 0.5 × 105에서 재현 탁 - 마우스에 이식하기 전에 PBS 150 μL 당 0.5 × 10 6 세포.
3. 방광 내 종양 임플란트
- (각각 33 ㎎ / ㎏ 및 20 ㎎ / ㎏)의 마취제 zoletil xylor과의 혼합을 사용하여 마우스를 마취, 복강 내 주사.
- 앙와위에서 동물을 놓고 스카치 테이프로 패드에 뒷다리를 해결. 앞발을 충분히 잘 표시하고 카테터의 삽입을 위해 용이하게 액세스 가능한 요도를 렌더링하기 위해 분리되어야한다.
- 참고 : 카테터를 들어, 24 G 소아 정맥 카테터는 8-10주 된 쥐에 적합합니다. 카테터의 선택은 요도 벽과 카테터 사이의 액 누설을 방지하기 위해 매우 중요하다. 큰 구멍 카테터는 큰 이상 마우스를 사용해야합니다.
- 작은 집게를 사용하여, 요도의 외부 부분 중 하나 가장자리를 끼와 마우스의 "머리 끝"으로 아주 조심스럽게 비틀. 이 작업은 요도를 노출합니다.
- 45 °의 각도로 요도에서 후자를 카테터의 내부 바늘을 제거하고 삽입 약간 지향마우스의 "꼬리 끝"으로. 카테터의 입구를 강요하지 마십시오 그 내부에 미끄러까지 요도 저항의 경우에는, 단지 매우 부드럽게 카테터 트위스트. 카테터의 약 0.5-0.8 cm가 요도에있을 때, 신중 마우스의 꼬리에 카테터를 병렬 배치하고 완전히 삽입.
- 카테터 삽입되어야하는 바늘의 1 mL의 주사기를 이용하여, 멸균 PBS의 200-300 μl를 주입하여 잔류 뇨로부터 방광을 씻어 방광에서 모든 액체를 흡인.
- 참고 : PBS를 주입하면 방광이 채워하고 붓기가 쥐의 뒷다리 사이에 볼 수 있습니다; 이 카테터가 올바른지 확인한다. 대부분 카테터 주입량을 계산할 때 고려되어야 데드 볼륨을 갖는다.
- 1 mL의 멸균 주사기를 사용하여, 0.1 N의 HCl 200 μl를 주입. 전체 벽을 레코딩하기 위해 방광을 입력합니다. 10 초 후, 모든 산을 제거하고 즉시 neutrali멸균 주사기와 0.1 N NaOH를 200 μl를 주입하여 ZE. 셀의 가장 높은 숫자 (0.5 × 106)의 주입시, 산성화 단계는 필요하지 않다.
- 기음 모든 잔류 액 즉시 멸균 PBS 300 μL와 공동을 세척.
- 방광 - (0.5 × 106의 범위는 0.5 × 10 5) 흡인 방광을 비우고, MB49 및 세포를 함유하는 PBS 150 μl를 주입. 세포의 누설을 방지하기 위해 카테터에 조립 주사기를 남겨. 이 스카치 테이프 패드를 고정하여 주사기를 고정하는 것이 좋다.
- 1 시간 후, 부드럽게로부터 요도 카테터를 추출하고 깨어까지 백열등, 케이지에서 마우스를 배치 이것은 보통 치료 종료 후의 1 ~ 2 시간이 발생한다.
HP-NAP 4. 방광 내 배달
- 주 : 셀 점안 후 최소 3 일, 그것은 시작하는 것이 가능하다치료.
- 단계 3.1-3.4에 설명 된대로 카테 테르를 꽂다. 이 단계에서, 그것은 HCl로 방광 벽을 구울 필요가 없습니다.
- 1 ML의 주사기를 사용하여 멸균 PBS의 200 ~ 300 μl를 주입하여 잔류 소변에서 방광 세척과 방광의 모든 액체를 대기음.
- 방광에 150 μL PBS 당 HP-NAP의 50 μg의를 주입한다. 단백질 용액의 누출을 방지하는 카테터에 부착 된 주사기를 남겨. 스카치 테이프로 패드에 고정하여 주사기를 고정합니다.
- 그들이 깨어 때까지, 백열 램프에서 1 시간 후, 부드럽게 요도에서 카테터를 추출하고 새장에 마우스를 놓습니다.
5. 종양의 Explants 및 조직 학적 분석
- 처리의 끝에서, 동물을 희생 누운 위치에 배치하고 스카치 테이프 패드를 고정 뒷다리.
- 외과 용 메스를 사용하여, 피부를 통해 약 1.52 cm 긴 수직 절개를복막 바로 마우스의 "헤드 엔드"외부 생식기 위에서 시작. 방광 손상의 위험을 최소화하기 위해, 절삭 깊이에 특히주의.
- 방광은 절단의 중앙 왼쪽에 배치되고 종양 어두운 핑크 / 바이올렛 질량으로 표시됩니다. 그 절제시, 조직 학적 새장에 전체 방광을 배치하고 파라핀에 삽입하기 전에 10 % 포르말린에 고정합니다.
- 조직 학적 및 면역 조직 화학적 분석을 위해, 표준 마이크로톰을 이용하여 방광 (46 μm의 두께)의 시리얼 섹션을 준비합니다.
- 헤 마톡 실린 / 에오신으로 섹션 얼룩과 종양 크기 (D XD는 2), 컴퓨터 보조 화상 분석기를 사용 단면적 당 괴사의 비율을 결정하는 계산을 진행.
- 용기 카운트, immunoperoxidase 표준 기술을 이용하여, 내피 세포 마커 CD31 / PECAM에 대한 부분을 염색하여 진행. 섹션을 스캔가장 높은 혈관 밀도의 영역을 식별하기위한 저전력 (× 4)를 t. 이 지역 내에서 높은 전력 (20 ×)에서 다섯 별도의 임의의 필드에서 개별 미세 혈관을 계산합니다.
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Representative Results
도 1은 카테터 기법을 나타낸 것이다; 마우스는 카테터 0.5 × 10 6 MB49 세포를 주입한다. HP-NAP와 치료는 방광 벽에 부착하고 증식 할 수 있도록하기 위해 3 일 종양 세포의 주입 후 시작된다. 대조군에 속한 모든 동물들은 종양의 개발; 그들 중 일부는 의한 요도의 폐색에 13 일의 기간이 종료하기 전에 다이있다.
HP-NAP와 첫번째 주입 후에, 동물은 네 주사, 총 3 일마다 처리된다. 실험의 끝에, 열세 일에, 동물을 희생하고 블래 조직학 및 면역 조직 화학 분석을 위해 수집 하였다. 도 2a에 도시 한 바와 같이, HP-NAP - 처리 된 마우스에서 방광 내 종양의 부피는 830 ± 1 대 (220 ± 62mm 3 비히클 - 처리 된 마우스의 종양보다 훨씬 작80mm 3).
흥미롭게도, 동안 차량 처리 된 동물에서 종양은 종양이 방광 벽 (그림 2B) 내에 한정된다 (8) HP-NAP 처리 동물의 7, 기본이되는 지방 조직을 침공. 마지막으로, 혈류가 감소되고 괴사 범위는 동물 (도 2B와 C)를 제어에 대하여, HP-NAP 처리 된 마우스에서 증가된다.
그림 1. 마우스의 카테터. 여성 마우스는 마취와 24 G 멸균 정맥 카테터를 사용하고 있습니다. 오른쪽 패널은 블랙 박스의 배율이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
HP-NAP의 그림 2 항 종양 활성. 마우스, MB49 셀 (0.5 × 106)로 일 0 이식은, 일 3, 6, 9 및 50 HP-NAP 또는 PBS (차량)의 μg의로 처리 12. 모든 동물은 하루 (13) (A) 제어 마우스 및 HP-NAP 처리 동물 및 종양 체적 정량에서 분리 방광에 대표 조직 학적 분석에서 사망. 동물의 두 그룹으로 패널과 괴사 백분율의 섹션 (B) 배율. (C) CD31 / PECAM 스테인드 절제된 방광; 제어 및 HP-NAP 처리 동물의 대표 섹션이 표시됩니다. 미세 혈관 밀도 (C, 오른쪽 패널)의 정량; HPF, HIGHPOWER 필드. 데이터는 평균 ± 표준 편차를 나타냅니다; 그룹 당, n은 = 8 마우스. 통계적 유의성은 학생의 T는 - 테스트 (** P <0.01)으로 측정 하였다. Codolo 등등에서 수정 된 도표등. (13). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
암 치료에서의 진보의 대부분은 임상 시험을 시작하기 전에 동물 모델에서 시험을 요구한다. 생체 내 종양 생물학을 연구 동물 모델을 활용 가능성이 다른 치료 적 접근 방식을 평가할 수있는 암 발병 조사 연구를위한 중요한 도구를 나타낸다. 동 소성 모델은 금본위 제 14 ~ 15을 유지, 모두 때문에 종양 모델을 설정하고 할 수 세포주의 거대한 양의가 자연적으로 발생하는 종양 (16)의 환경을 모방하기 때문이다.
여기에 기술 된 바와 같이, 후자는 xenoimplants를 거쳐 면역 결핍 마우스에서 가능하지 않기 때문에 또한, 동계 마우스에서 암의 동소 모델을 설정하는, 면역 요법에 기초하여 새로운 치료 전략을 조사하는 목적으로 연구의 경우에 특히 적합하다.
이 프로토콜에 묘사 된 방법은 T를 설명종양 세포의 접종 및 방광 공동 내로 치료제의 투여를 모두 허용 암컷 마우스 그는 요도 카테터.
(대신 트립신 또는 폴리 라이신의 사용과 같은 다른 방법들로 상기 설명 된 바와 같이) 산 화상 통해 방광 벽 전처리의 장점은 크고 고도로 침윤성 종양의 발달을 촉진하는 것을이다. 아마도 종양 세포 (17)의 생존에 대한 이들 물질의 잔기의 악영향 트립신 및 폴리 리신, 작고 덜 침습적 종양 결과, 전처리와 반대로,. 후자는 방광 벽의 천공 (18)으로 복막 종양의 확산을 일으킬 수 있기 때문에 산 번인은 또한 전기 소작에 기초한 다른 전처리 시스템에 바람직하다.
이 프로토콜은 단기 연구 (~ 십삼일)에 최적화되어 있습니다. 홍보 주입높은 휴대폰 번호로 인해 큰 종양 부담이 더 빠른 종양의 성장 가능성이 동물의 손실의 원인이되므로 세포의 운영자의 수는 매우 중요하다. 사용자가 자신이 가진 기술 될 때까지 또, 따라서 동물의 사망을 야기 요도 또는 방광 손상의 위험이 어느 정도 존재한다. 동물이 적절하게 (절차를 수행하는 동안 죽지 않는 때문에 등) 운영하는 경우 우리의 경험에서, 그러나, 그들은 실험 (십삼일)의 기간 동안 고통없이 살. 또한, 주입 된 세포의 수를 감소시킴으로써, 실험 지속 기간을 연장 할 수있다.
우리는 더 높은 효과 / 부작용이 부여 새 BCG에 기초한 요법을 향상시키고, 궁극적으로 대체 할 목적으로 헬리코박터 파이로리로 생산되는 단백질 HP-NAP의 항 종양 활성을 평가하는데이 모델을 사용할 비. 보다 일반적으로,이 접근법은 모든 실험 전 clini에 채용 될 수있다방광 공동 내로 치료제의 전달을 필요로 CAL 평가.
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Disclosures
저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 Associazione Italiana의 당 라 Ricerca 술 Cancro, 대학의 이탈리아어 연구부, 인쇄용 프로젝트와 PROGETTI 디 Ricerca 디 아테네 오, 부여 N ° CPDA137871, Fondazione Cariplo에 의해 지원되었다, N은 MDB에 2011-0485을 ° 및 Finanziamento 지오반니에 의해 부여 가이아 Codolo에 Studiosi, 파도바 대학.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| C57BL/6J female mice | Harlan Italy (Udine, Italy) | ||
| MB49 Cells | Obtained from Prof. O'Donnel, University of Iowa Carver College of Medicine, Iowa, USA | ||
| RPMI | Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) | R8758 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D1408 | 10X, to be diluted in apyrogenic water |
| Flask | Becton Dickinson (Franklin Lakes, New Jersey, USA) | 353135 | |
| Syringe 1ml | Becton Dickinson | 301358 | |
| Trypsin | Life Technologies (Waltham, Massachusetts, USA) | ||
| Gentamycin | Life Technologies | 15710-049 | |
| Xilor | Bio 98 s.r.l. (Milano, Italy) | 2% Xylazin | |
| Zoletil | Virbac (Carros, France) | 359713301992 | 5% Zolazepam + 5% Tiletamine |
| 24G Catheter | Terumo (Rome, Italy) | SR+DM2419PX | |
| HCl | Carlo Erba Reagents (Milano, Italy) | 403871 | Liquid |
| NaOH | JT Baker (Center Valley, Pennsylvania, USA) | 10095011 | Powder |
| Equipment | |||
| Surgical Scalpel | Albion Surgical Limited (Sheffield, England) | ||
| Microtome | Leica Microsystem ( Wetzlar, Germany) | RM2235 | |
| Microscope Slides | VWR International (Radnor, Pennsylvania, USA) | 631-0108 | |
| Image Analyzer | Zeiss (Jena, Germany) | Cyres System | |
References
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