Introduction
Blaaskanker is een van de meest voorkomende kanker van het urogenitale kanaal, met ongeveer 75000 nieuwe gevallen per jaar in de Verenigde Staten 1. Hoge tarieven van herhaling vereisen levenslang follow-up, die blaaskanker een van de duurste vormen van kanker te behandelen maakt. De gouden standaard behandeling voor de high-grade NMIBC is trans-urethrale resectie, gevolgd door intravesicale immunotherapie met BCG. Hoewel het precieze mechanisme van de antitumoractiviteit van BCG nog niet geheel opgehelderd, wordt aangenomen dat de activering van een celgemedieerde immuunrespons verrijkte T helper (Th) 1 en cytotoxische T (Tc) 1 cellen is cruciaal voor het succes van de therapie 2.
Hoewel BCG blijft de voorkeursbehandeling voor NMIBC, een groot deel van de patiënten niet reageren op de therapie; Bovendien kan een aantal bijwerkingen veroorzaken: ongeveer 70% van de behandelde tumoren terugkeren na enige tijd en ~ 15% vooruitgang spier-invasieve vorm van hetziekte. Andere bijwerkingen van BCG behandeling omvatten dysurie, cystitis en nierontsteking 3-6.
De ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën moeten rekening houden met het gebruik van preklinische modellen, na de eerste in vitro evaluatie; Dit geldt met name voor tumoren waarvan micro aanzienlijk beïnvloeden de ontwikkeling en de gevoeligheid voor behandeling.
In de afgelopen tien jaar hebben we meerdere aspecten van het immuunsysteem modulerende activiteit van HP-NAP, een eiwit geproduceerd door de bacterie Helicobacter pylori aangepakt, aanvankelijk geïdentificeerd als in staat is het bevorderen van endotheel hechting van polymorfonucleaire cellen (PMN) 7. Structureel, HP-NAP behoort tot het DNA beschermt eiwit onder uitgehongerd omstandigheden (DPS) gezin 8 en bestaat uit 12 identieke subeenheden gerangschikt in een dodecameer schelp.
We hebben aangetoond dat HP-NAP isEen Toll-achtige receptor (TLR) 2 agonist, met een sterke immunomodulerende activiteit verantwoordelijk voor het stimuleren van de differentiatie van T-lymfocyten naar de Th1 fenotype, zowel in vitro als in vivo 9-10. Krachtens deze activiteit HP-NAP kan de Th2 immuunrespons in de gunstiger Th1 respons in een muismodel van allergische astma 11 omleiden.
Om de Th1-afhankelijke anti-tumor potentieel van HP-NAP te evalueren, hebben we geprofiteerd van een muismodel van blaaskanker ontwikkelde enkele jaren geleden door O'Donnel en collega's 12 voor het evalueren van de impact van de BCG administratie.
Met dit protocol, tonen we dat HP-NAP een sterke antitumor potentieel tegen blaaskanker en de werkzaamheid van HP-NAP toediening loopt parallel met de significante accumulatie in tumor en regionale lymfeknopen, zowel Th1- en Tc1-lymfocyten die interferon ( IFN) -γ 13
Het huidige rapport geeft een stepbystep protocol, waarin de voorbereiding van de dieren, hun urethrale catheterisatie, de chemische branden die nodig zijn voor de bevestiging van de cellen naar de blaas mucosa, en de injectie van de tumorcellen. We beschrijven ook de topische toediening van HP-NAP die kan worden beschouwd als een prototype van therapeutische middelen ontwikkeld voor de behandeling van blaaskanker. Het verkregen door het vergelijken tumoren geïsoleerd uit controle en HP-NAP-behandelde dieren aanwijzingen benadrukt niet alleen dat HP-NAP een goede kandidaat voor blaaskanker immunotherapie, maar ook de algemene doeltreffendheid van de proefmethoden zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures voor dierlijke handling zijn goedgekeurd door het Italiaanse ministerie van Volksgezondheid (DM 204/2011-B).
1. Dieren
- Grow C57BL6 / J vrouwelijke muizen tot 8 weken oud in individueel geventileerde kooien met microisolation filters.
Opmerking: De vrouwtjes hebben de voorkeur, omdat de anatomische conformatie van hun externe uro-genitale apparaat maakt de catheterisatie makkelijker dan bij mannen.
2. Celkweek
- Handhaaf de muis urotheelcarcinoom cellijn MB49 in RPMI 1640 medium aangevuld met 10% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum en 50 pg / ml gentamicine bij 37 ° C in bevochtigde 5% CO 2.
- Groeien MB49 cellen in T-75 kolven tot 80% confluentie. Trypsinize en hersuspenderen in 0,5 x 10 5-0,5 x 10 6 cellen per 150 pl PBS voor implantatie in muizen.
3. Intravesicale Tumor Implant
- Verdoven muizen een mix van de anesthesie zoletil en xylor (33 mg / kg en 20 mg / kg), intraperitoneaal geïnjecteerd.
- Plaats dieren in een liggende positie en bevestig de achterpoten om de pad met plakband. Poten hebben voldoende worden gescheiden om de urethra gehoorgang goed zichtbaar en gemakkelijk toegankelijk voor het inbrengen van de katheter te maken.
- Opmerking: Voor de catheterisatie, een 24 G pediatrische veneuze katheter is geschikt voor 8 tot 10 weken oude muizen. De keuze van de katheter van groot belang om lekkage van vloeistof tussen de urethrale wand en de catheter te vermijden. Grotere boring katheters worden gebruikt voor grotere of ouder muizen.
- Met behulp van een kleine tang, knijp een rand van het buitenste gedeelte van de plasbuis en draai het heel voorzichtig in de richting van het "head end" van de muizen. Deze actie onthult de urethra gehoorgang.
- Verwijder de inwendige naald van de katheter en plaats deze in de urethra onder een hoek van 45 °, wat georiënteerdenaar de "staart" van de muizen. Laat de ingang van de katheter niet dwingen; bij resistentie, net draai de katheter zachtjes totdat deze glijdt in de urethra. Bij ongeveer 0.5-0.8 cm van de katheter in de urethra, voorzichtig plaats de katheter parallel aan de staart van de muizen en volledig invoegen.
- Met behulp van een 1 ml injectiespuit, naald waarvan in de katheter worden ingebracht, was de blaas van residuele urine door injectie 200-300 pi steriel PBS en zuig alle vloeistof uit de blaas.
- Opmerking: Bij het injecteren PBS, de blaas vullen en zwellingen zichtbaar tussen de achterpoten van de muizen; Dit bevestigt dat de catheterization correct is. De meeste katheters hebben een dood volume dat moet worden gehouden bij het berekenen van het injectievolume.
- Met behulp van een steriele 1 ml injectiespuit, injecteer 200 ul 0,1 N HCl. Vul de blaas om de gehele wand verbranden. Na 10 sec, verwijder alle zuur en onmiddellijk neutraliZe door het injecteren van 200 ui 0,1 N NaOH met een steriele injectiespuit. Bij injectie van het hoogste aantal cellen (0,5 x 10 6), wordt de aanzuringsstap niet vereist.
- Zuig de restvloeistof en onmiddellijk spoelen holte met 300 pl steriel PBS.
- Leeg de blaas door aspiratie, en injecteer 150 ul PBS die MB49 cellen (bereik 0,5 x 10 5-0,5 x 10 6) in de blaas. Laat de injectiespuit gemonteerd aan de catheter lekkage van cellen voorkomen. Het is beter om de spuit te waarborgen door bevestiging aan de pad met plakband.
- Na 1 uur, verwijder daarna voorzichtig de catheter van de urethra, en zet de muizen in de kooi onder een gloeilamp tot zij ontwaken dit gebeurt meestal tussen 1 en 2 uur na het einde van de behandeling.
4. Intravesicale Levering van HP-NAP
- Opmerking: Minimaal 3 dagen na instillatie cel, is het mogelijk om het startenbehandeling.
- Katheteriseren zoals beschreven in stappen 3,1-3,4. In dit stadium is het niet nodig de blaaswand branden met HCl.
- Met behulp van een injectiespuit 1 ml, was de blaas van residuele urine door injectie 200-300 pi steriel PBS en zuig alle vloeistof uit de blaas.
- Injecteer 50 ug HP-NAP per 150 ul PBS in de blaas. Laat de spuit bevestigd aan de katheter om lekkage van de eiwitoplossing te vermijden. Bevestig de spuit door de vaststelling van het aan de pad met plakband.
- Na 1 uur, verwijder daarna voorzichtig de catheter van de urethra en plaats de muizen in de kooi onder een gloeilamp, tot zij ontwaken.
5. Tumor Explantaten en histologische analyse
- Aan het eind van de behandeling, offeren de dieren, plaats ze in liggende positie en bevestig de achterpoten om de pad met plakband.
- Met behulp van een chirurgische scalpel een verticale snede ongeveer 1,52 cm lang door de huid en deperitoneum, beginnend juist boven uitwendige genitaliën van de "head end" van de muizen. Om het risico op beschadiging van de blaas te minimaliseren, bijzondere aandacht besteden aan de diepte van de snede.
- De blaas zal worden gepositioneerd in het centrum-links van de snede en de tumor wordt zichtbaar als een donkere roze / paarse massa. Bij de uitsnijding, plaatst u de gehele blaas in een histologische kooi en lossen in 10% gebufferde formaline voor het inbedden in paraffine.
- Voor histologische en immunologische histochemische analyse bereiden seriële secties van de blaas (46 urn dik) met een standaard microtoom.
- Vlekken op de secties met hematoxyline / eosine en de procedure voor berekening van tumorgrootte (D xd 2) en dat het percentage van necrose per dwarsdoorsnedeoppervlak behulp van een computer ondersteunde beeldanalyse.
- Voor vaartuig tellen, gaat door het kleuren van de secties voor de endotheliale marker CD31 / PECAM, met een standaard immunoperoxidasetechniek. Scan de secties eent laag vermogen (4 ×) naar het gebied van de hoogste vasculaire dichtheid identificeren. Binnen deze regio, tel individuele bloedvaten in vijf afzonderlijke willekeurige velden bij hoog vermogen (20 ×).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont de catheterisatie techniek; de muis katheter en ingeprent met 0,5 x 10 6 cellen MB49. De behandeling met HP-NAP wordt gestart 3 dagen na de injectie met tumorcellen, zodat zij hechten aan de blaaswand en prolifereren. Alle dieren van de controlegroep ontwikkelen de tumor; sommige kunnen vóór het einde van de periode van 13 dagen sterven als gevolg van occlusie van de urethra.
Na de eerste injectie met HP-NAP, worden de behandelde dieren om de drie dagen, in totaal vier injecties. Na afloop van het experiment op dag dertien, worden de dieren opgeofferd en de blazen verzameld voor histologische en immunologische histochemische analyse. Zoals getoond in figuur 2A, het volume van de tumor in de blaas van HP-NAP-behandelde muizen beduidend kleiner dan de tumoren van met drager behandelde muizen (220 ± 62 mm 3 vs 830 ± 180 mm 3).
Interessant, terwijl met drager behandelde dieren de tumor binnendringt het onderliggende vetweefsel, in 7 van de 8 HP-NAP-behandelde dieren de tumor beperkt in de blaaswand (figuur 2B). Tenslotte wordt vasculariteit verminderd en de mate van necrose wordt verhoogd in HP-NAP-behandelde muizen met betrekking tot dieren (figuur 2B en C) besturen.
Figuur 1. Muizen catheterisatie. Vrouwelijke muizen worden verdoofd en gecatheteriseerd met behulp van een 24 G steriele canule. Het rechter paneel is de vergroting van de zwarte doos. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Anti-tumoractiviteit van HP-NAP. Muizen, geïmplanteerd op dag 0 met MB49 cellen (0,5 x 10 6), behandeld met 50 ug HP-NAP of PBS (voertuig) op dagen 3, 6, 9 en 12. Alle dieren worden gedood op dag 13. (A) Vertegenwoordiger histologische analyse op blazen geïsoleerd van controle muizen en HP-NAP behandelde dieren, en de tumor volume kwantificering. (B) Vergroting van de gedeelten van paneel A en percentage van necrose in beide groepen dieren. (C) resected blazen, gekleurd voor CD31 / PECAM; representatieve secties van controle en HP-NAP behandelde dieren worden getoond. Kwantificering van microvessel dichtheid (C, rechter paneel); HPF, highpower velden. De gegevens representeren gemiddelde ± SD; n = 8 muizen per groep. Statistische significantie werd bepaald door Student's t-test (** p <0,01). Figuur gewijzigd ten opzichte van Codolo etal. 13. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De meeste vooruitgang in kankertherapie nodig tests diermodellen voordat klinische trials. De mogelijkheid van het bestuderen van de tumor biologie in vivo, gebruik te maken van diermodellen, vormt een essentieel instrument voor onderzoekers onderzoeken kanker pathogenese, waardoor de beoordeling van de verschillende therapeutische benaderingen. Orthotope modellen blijven de gouden standaard 14-15, zowel vanwege de enorme hoeveelheid cellijnen die beschikbaar zijn voor het opzetten van een tumor model en omdat ze het milieu van de natuurlijk voorkomende tumor 16 na te bootsen.
Bovendien opzetten orthotopische modellen van kanker in syngene muizen, zoals hier beschreven, is bijzonder belangrijk bij studies gericht op het onderzoeken van nieuwe therapieën op basis van immunotherapie, die immers niet mogelijk in immuundeficiënte muizen die xenoimplants ondergaan.
De afgebeelde in dit protocol beschrijft methodiek tHij catheterisatie van een vrouwtjes urethra dat zowel de inoculatie van tumorcellen en het toedienen van therapeutische middelen in de blaas holte toestaat.
Het voordeel van preconditionering de blaaswand door een zuur brandwonden (zoals hierboven beschreven, in plaats van andere methoden, zoals het gebruik van trypsine of poly-lysine), dat om de ontwikkeling van grote en sterk invasieve tumoren. Integendeel, voorconditionering met trypsine en poly-lysine, leidt tot kleinere en minder invasieve tumoren, waarschijnlijk als gevolg van een nadelig effect op residuen van deze verbindingen op levensvatbaarheid van tumorcellen 17. Het zuur branden heeft ook de voorkeur om een voorbehandeling op basis van elektrisch dichtschroeien omdat deze bijvoorbeeld de perforatie van de blaaswand en de verspreiding van de tumor in het peritoneum 18 veroorzaken.
Het protocol is geoptimaliseerd voor de korte-termijn studies (~ 13 dagen). Implanteren van de proper aantal cellen is kritisch, omdat een groter aantal cellen resulteert in een snellere tumorgroei en mogelijk verlies van dieren door grote tumorlast. Bovendien totdat de gebruiker wordt zeker met de techniek, is er een zeker risico op beschadiging van de urethra of de blaas, waardoor de dood van de dieren. In onze ervaring, maar als de dieren voldoende worden bediend (en dus niet overlijden tijdens de procedure), zij leven zonder lijden voor de duur van de experimenten (13 dagen). Bovendien, door vermindering van het aantal geïnjecteerde cellen, is het mogelijk om de duur van de experimenten verlengen.
We gebruikten dit model voor de anti-tumor activiteit van het eiwit HP-NAP door Helicobacter pylori evalueren, teneinde te verbeteren, en uiteindelijk vervanging, de huidige therapie op basis van BCG met een nieuwe begiftigd met hogere prestaties / bijwerkingen ratio. Meer in het algemeen, kan deze experimentele aanpak in alle pre-clini worden goedgekeurdcal evaluaties dat de afgifte van therapeutische middelen in de blaas holte vereisen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro, Italiaanse ministerie van Universiteit en Researchcentrum, Prin projecten en Progetti di Ricerca di Ateneo, verlenen N ° CPDA137871, Fondazione Cariplo verlenen N ° 2011-0485 MDB, en door Finanziamento Giovani Studiosi, Universiteit van Padua, op Gaia Codolo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| C57BL/6J female mice | Harlan Italy (Udine, Italy) | ||
| MB49 Cells | Obtained from Prof. O'Donnel, University of Iowa Carver College of Medicine, Iowa, USA | ||
| RPMI | Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) | R8758 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D1408 | 10X, to be diluted in apyrogenic water |
| Flask | Becton Dickinson (Franklin Lakes, New Jersey, USA) | 353135 | |
| Syringe 1ml | Becton Dickinson | 301358 | |
| Trypsin | Life Technologies (Waltham, Massachusetts, USA) | ||
| Gentamycin | Life Technologies | 15710-049 | |
| Xilor | Bio 98 s.r.l. (Milano, Italy) | 2% Xylazin | |
| Zoletil | Virbac (Carros, France) | 359713301992 | 5% Zolazepam + 5% Tiletamine |
| 24G Catheter | Terumo (Rome, Italy) | SR+DM2419PX | |
| HCl | Carlo Erba Reagents (Milano, Italy) | 403871 | Liquid |
| NaOH | JT Baker (Center Valley, Pennsylvania, USA) | 10095011 | Powder |
| Equipment | |||
| Surgical Scalpel | Albion Surgical Limited (Sheffield, England) | ||
| Microtome | Leica Microsystem ( Wetzlar, Germany) | RM2235 | |
| Microscope Slides | VWR International (Radnor, Pennsylvania, USA) | 631-0108 | |
| Image Analyzer | Zeiss (Jena, Germany) | Cyres System | |
References
- Siegel, R., Ma, J., Zou, Z., Cancerstatistics Jemal, A. CA Cancer J Clin. 64, 9-29 (2014).
- Saint, F., et al. Prognostic value of a T helper 1 urinary cytokine response after intravesical bacillus Calmette-Guerin treatment for superficial bladder cancer. J Urol. 167, 364-367 (2002).
- Shahin, O., Thalmann, G. N., Rentsch, C., Mazzucchelli, L., Studer, U. E. A retrospective analysis of 153 patients treated with or without intravesical bacillus Calmette-Guerin for primary stage T1 grade 3 bladder cancer: recurrence, progression and survival. J Urol. 169, 96-100 (2003).
- Lamm, D. L.
- De Jager, R., et al. Long-term complete remission in bladder carcinoma in situ with intravesical TICE bacillus Calmette Guerin. Overview analysis of six phase II clinical trials. Urology. 38, 507-513 (1991).
- Dovedi, S. J., Davies, B. R. Emerging targeted therapies for bladder cancer: a disease waiting for a drug. Cancer Metastasis Rev. 28, 355-367 (2009).
- Evans, D. J., et al. Characterization of a Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. Infect Immun. 63, 2213-2220 (1995).
- Grant, R. A., Filman, D. J., Finkel, S. E., Kolter, R., Hogle, J. M. The crystal structure of Dps, a ferritin homolog that binds and protects DNA. Nat Struct Biol. 5, 294-303 (1998).
- Amedei, A., et al. The neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori promotes Th1 immune responses. J Clin Invest. 116, 1092-1101 (2006).
- Bernard, M., D'Elios, M. M. The immune modulating activity of the Helicobacter pylori HP-NAP: Friend or foe. Toxicon. 56, 1186-1192 (2010).
- Codolo, G., et al. The neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori down-modulates Th2 inflammation in ovalbumin-induced allergic asthma. Cell Microbiol. 10, 2355-2363 (2008).
- Gunther, J. H., et al. Optimizing syngeneic orthotopic murine bladder cancer (MB49). Cancer Res. 59, 2834-2837 (1999).
- Codolo, G., et al. HP-NAP inhibits the growth of bladder cancer in mice by activating a cytotoxic Th1 response. Cancer Immunol Immunother. 61, 31-40 (2012).
- Chan, E., Patel, A., Heston, W., Larchian, W. Mouse orthotopic models for bladder cancer research. BJU Int. 104, 1286-1291 (2009).
- Kubota, T. Metastatic models of human cancer xenografted in the nude mouse: the importance of orthotopic transplantation. J Cell Biochem. 56, 4-8 (1994).
- Loi, M., et al. The use of the orthotopic model to validate antivascular therapies for cancer. Int J Dev Biol. 55, 547-555 (2011).
- Miyazaki, K., et al. Preconditioning methods influence tumor property in an orthotopic bladder urothelial carcinoma rat model. Mol Clin Oncol. 2, 65-70 (2014).
- Horiguchi, Y., et al. Establishment of orthotopic mouse superficial bladder tumor model for studies on intravesical treatments. Hum Cell. 21, 57-63 (2008).
