Summary
Det nuvarande protokollet detaljer ett förfarande för att mäta aktiviteten av funktionellt homologt deubiquitinating enzymer. Specialiserade prober kovalent modifiera enzymet och möjliggöra upptäckt. Denna metod har potential att identifiera nya terapeutiska mål.
Abstract
Ubiquitin-proteasom-systemet har nyligen satts i samband med olika patologier, inklusive neurodegenerativa sjukdomar och cancer. I ljuset av detta, tekniker för att studera den reglerande mekanismen hos detta system är viktiga för att klargöra de cellulära och molekylära processer av ovan nämnda sjukdomar. Användningen av hemagglutinin härledd ubiquitin prober som beskrivs i detta dokument utgör ett värdefullt verktyg för att studera detta system. Denna uppsats detaljer en metod som gör det möjligt för användaren att utföra analyser som ger en direkt visualisering av deubiquitinating enzymaktivitet. Deubiquitinating enzymer styr proteasomal nedbrytning och dela funktionell homologi i sina aktiva säten, som gör det möjligt för användaren att undersöka aktiviteten av flera enzymer i en analys. Lysat erhålls genom försiktig mekanisk cellsönderdelning och inkuberades med aktiv sätesriktad prober. Funktionella enzymer taggade med sonderna medan inaktiva enzymer förblir obunden. Genom körningning denna analys erhåller användaren information om både aktivitet och potentiell expression av multipla deubiquitinating enzymer på ett snabbt och enkelt sätt. Den nuvarande metoden är betydligt effektivare än att använda individuella antikroppar för de förutsagda hundra deubiquitinating enzymer i den mänskliga cellen.
Introduction
Ubiquitin-proteasom-systemet (UPS) fungerar som en av de större nedbrytningsvägar i däggdjurscellen. Underlag väg till nedbrytning i proteasomen är kovalent märkta med polymerer av ubiquitin (UB) 1. Innan den riktade substratet in i proteasomen för nedbrytning, måste poly-ubiquitin tag tas bort. En klass av enzymer som kallas deubiquitinating enzymer (Dubs) är ansvarig för avlägsnande och återvinning av ubiquitin-molekyler 2. Det har förutsagts från det mänskliga genomet att det finns nästan hundra Dubs arbetar i cellen 3. Med ett så stort antal Dubs styr Ub-förmedlade cellulära processer, studera dessa enzymer är en utmaning eftersom mRNA tekniker inte ger information om verksamheten och western blotting bara ger information om uttrycksnivåer.
Användningen av influensa hemagglutinin (HA) tagged, Ub-härledda aktivt ställe riktad prober möjliggör en kovalent modförgasning av de funktionella DUBS och därför ger en direkt visualisering av aktiviteten av dessa enzymer på en western blöt 4. Probema har en C-terminal tiol reaktiv grupp som fungerar som ett självmordssubstrat för det aktiva stället cysteinresten 5. Med dessa sönder, är det möjligt att studera aktiviteten och potentiell expression av många dubbar under både patologiska och fysiologiska tillstånd i cellen.
Förändringar i DUB-aktivitet har implicerats i ett antal patologiska tillstånd såsom Parkinsons, Alzheimers, anemi och olika cancerformer 6-10. Denna teknik ger ett kraftfullt verktyg för att studera sjukdom. I föreliggande dokument visar vi tillämpningen av denna teknik i HeLa och M17-celler som har lyserats med hjälp av glaspärlor. Dessutom, vi beskriva hur man använder den här metoden i mus ryggmärgsvävnadsprover. Den information som erhålls från denna teknik kan användas som en utgångspunkt för att identifieraterapeutiska mål samt upprättande av modeller för att studera olika sjukdomstillstånd. Den sanna användbarheten av denna teknik ligger i dess förmåga att tillhandahålla information om flera dubbar i en enda analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Lysis Buffer Förberedelse
- Lös sackaros i avjoniserat (DI) vatten för att göra en 2 M förrådslösning. Filtrera en 2 M lösning av sackaros med användning av en vakuumdriven 0,22 fim polyvinylidenfluorid (PVDF) filter.
- Lös ditiotreitol (DTT) i avjoniserat vatten till en 500 mM stamlösning och lagra under anaeroba betingelser. Lös magnesiumklorid (MgCl2) i avjoniserat vatten till en 100 mM stamlösning. Lös adenosintrifosfat (ATP) dinatrium-hydrat i DI-vatten för att göra en 50 mM stamlösning.
- Gör upp en Tris-lösning vid pH 7,4 genom upplösning Trizma-hydroklorid i avjoniserat vatten och justering av pH med användning av natriumhydroxid (NaOH).
- Kombinera delar av stamlösningarna i avjoniserat vatten till en lysbuffert med en sackaroskoncentration av 250 mM, en DTT-koncentration av 1 mM, en MgCl2 koncentration av 5 mM, en ATP-koncentration av 1 mM och en Tris-koncentration av 50 mM . Till exempel, blanda 535,3 il Tris, 500 il MgCl2, 1,25 ml sackaros, 20 | il av DTT, 200 | il ATP och 7,4947 ml Dl-vatten för att göra 10 ml lyseringsbuffert. Detta kan användas i ungefär 20 experiment.
2. odling av celler för experimentet
- Gör media genom alikvotering 30 ml DMEM + 10% fetalt bovint serum (FBS) i en 50 ml koniska rör.
- Överför frysta M17 eller HeLa-celler från lagret flytande kväve till en liten bägare med ljummet vatten.
- Överföra celler till 50 ml koniska rör. Lägg först till vissa medier till flaskan cellen. Sedan överföra de resuspenderade cellerna inom 5 sekunder för upptining.
- Centrifugera cellsuspensionen vid 450 xg under 5 minuter för att erhålla en cellpellet. Tillsätt 20 ml av media i en T75 kolv.
- Ta bort materialet från cellerna med hjälp av sug. Tillsätt 5 ml färskt medium till cellpelleten och återsuspendera.
- Överför 5 ml cellsuspension till 20 ml medium i T75-flaska och inkubera vid 37 ° C. ChÅnge medierna var 3 dagar.
3. Cell Skörd
- Ta bort media via sug, var noga med att inte röra cellerna.
- Tvätta cellerna med 5 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Ta bort PBS med hjälp av sug.
- Lägg 3 ml trypsin-etylendiamintetraättiksyra (EDTA) till T75-flaska och inkubera vid 37 ° C under 3 minuter.
- Lägg 6 ml färskt medium till kolven och återsuspendera cellerna.
- Överför suspensionen till en 15 ml koniska rör och centrifugera vid 290 x g under 5 minuter.
- Avlägsna supernatanten och tillsätt 5 ml PBS. Knacka försiktigt på botten av röret för att bryta upp pelleten. Centrifugera vid 290 xg under 5 minuter.
- Upprepa steg 3,6 tre gånger.
- Ta bort PBS och resuspendera cellerna i 1 ml färsk PBS. Transfer till Eppendorf-rör (1,5 ml). Spin vid 290 xg under 5 minuter.
4. Cell Lysis
- Mät den ungefärliga volymen av pellets med hjälp av en pipett end väga ut glaspärlor i ett mass: volymförhållande av 1: 1. Lägg två gånger volymen av pelleten i lyseringsbuffert.
Obs: Lägg bufferten innan du lägger glaspärlor. - Lyse cellerna i Eppendorf-rör vid maximalt omrörning i 30 min vid 4 ° C genom att vortexa i ett kallt rum.
- Centrifugera kort vid 200 xg under 30 sekunder för att lösa pärlorna. Samla upp supernatanten.
- Tillsätt samma volym av glaspärlor som tidigare till supernatanten.
- Vortex gång vid maximal omröring under 30 min vid 4 ° C.
- Centrifugera kort vid 200 xg under 30 sekunder för att reglera glaspärlor. Samla upp supernatanten.
- Centrifugera vid 5030 xg under 5 minuter för att avlägsna kärnor, membran och hela celler. Samla upp supernatanten, som är cellysatet.
5. Vävnads Homogenisering
- Gör en massa: volym av 1: 9 lösning av mus ryggmärg till lysbuffert.
Obs: Denna metod är tillämplig på en mängd olika skiljerent vävnadsprover. - Homogenisera vävnaden med hjälp av en inställning av nivå 2 på homogenisator under 30 sekunder för att säkerställa att det inte finns några bitar kvar.
- Centrifugera ner vid 5030 xg under 3 min för att avlägsna kärnor, membran och hela celler.
- Samla upp supernatanten, vilket är lysatet.
6. Prov Derivatisering
- Utför en bicinkoninsyra (BCA) i en 96-brunnars platta-analys för att bestämma proteinkoncentrationen av vävnaden lysat med användning av en kolorimetrisk 96-brunnars plattavläsare såsom specificeras av Pierce BCA Protein Assay kit-protokollet.
- Ta en alikvot motsvarande 20 ^ g av totalt protein till 50 | al med användning av avjoniserat (DI) vatten.
- Lägg 2 pl av 1,35 | iM av HA-Ub-vinylsulfon (VS) till lösningen och inkubera under 1 timme vid 37 ° C. Detta resulterar 20 ug av lysat till 50 nM sond i den slutliga reaktionsblandningen. Detta är i stort molärt överskott för att säkerställa märkning av funktionella DUBS.
- Jagncubate provet i Laemmlis provbuffert under 5 min vid 95 ° C. För en 52 ul reaktionsvolym användning 26 pl 2x provbuffert, 13 pl av 4x provbuffert eller 8,87 il av 6x provbuffert.
- Kyl på is innan du lägger gelen.
7. Western Blöt
- Fyll en 12-brunn 4-20% tris-glycin gel med 40 l av det beredda provet
- Kör gelen vid 95 V tills jonen front når botten.
- Utför en över natten överföring av gelén till en polyvinylidendifluorid (PVDF) membran.
- Inkubera membranet i amidosvart fläcken och skanna membane att erhålla en bild som visar mängden protein i varje spår.
- Avfärgning membranet och inkubera i 5% mjölk i PBS under 1 timme för att blockera.
- Inkubera membranet i det primära anti-HA-antikropp vid en koncentration av 1: 10000 i 5% mjölk i PBS, antingen över natten vid 4 ° C eller under 4 h vid rumstemperatur.
- Utför 3 tvättar feller 5 min vardera i PBS med 0,1% Tween-20 detergent.
- Inkubera membranet i en mus pepparrotsperoxidas vid en koncentration av 1: 10000 i 5% mjölk i PBS under minst 2 timmar.
- Utför tre tvättar i 5 minuter vardera i PBS med 0,1% Tween-20 detergent.
- Utför en tvätt för 5 minuter i PBS.
- Inkubera membranet i en kemiluminescerande detektionsreagens under 10 min och detektera med hjälp av en kemiluminescerande detektor. Använd den automatiska exponeringsinställningen på detektorn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Odlade M17 och HeLa-celler skördades med användning av metoden som beskrivs i protokollet (3. Cell Skörde) och mus ryggmärgsvävnad erhölls. Cellpelleten / ryggmärgsvävnad placerades i ett rör med lysbuffert beskrivs i avsnittet reagensberedning. Cellpelletar lyserades med användning av glaspärlor (figur 1A) och mus ryggmärgsvävnadsprover homogeniserades med användning av homogenisator (Figur 1B). Efter lys eller homogenisering ades provet centrifugeras sedan vid 5030 x g för att avlägsna glaspärlorna och / eller de obrutna membran och organeller (Figur 2). Båda dessa metoder är mekaniska medel för lys för att bevara enzymaktiviteten. Proteinkoncentrationen av cellerna bestämdes sedan med användning av BCA-metoden. 20 | j, g av totalt protein inkuberades med 2 ul av 1,35 ^ M sond för en timme vid 37 ° C (Figur 3). Proven inkuberades sedan i 4 x Laemmlisprovbuffert vid 95 ° C för att avbryta reaktionen. De framställda proverna laddades på en 4-20% tris-glycin gel och kördes vid 95 V tills jonen fronten nått botten. Proteinerna överfördes över natt på ett PVDF-membran. Den proteinladdning kontrollerades med användning av amidosvart färgning (fig 4). Denna styrsteget säkerställer att skillnaderna i aktivitet beror på faktiska cellulära processer och inte olika proteinladdning. Equal protein mängder användes i det första experimentet (Figur 4A). I det andra experimentet, var ojämlika proteinmängder laddades på grund av de förväntade skillnaderna i aktivitetsprofiler hos de olika cellinjerna (Fig 4B). Detta gjordes för att säkerställa detektering av en aktivitetsprofil för M17 cellysat inkuberades med N -ethylmaleimide (NEM), vilket är en cystein-hämmare och bör leda till en minskad signal på western blöt. Membranen inkuberades i anti-HA-primär antikropp, en mus-Horseradish peroxidas och sedan detekteras med användning av kemiluminiscerande imaging (Figur 5). Framgångsrik märkning av Dubs med hjälp av sonderna resulterar i en profil i varje spår av membranet (figur 5A, C). Intensiteten av banden vid olika molekylvikter motsvarar aktivitetsnivån i DUB-enzymet. Skillnaderna i aktivitetsnivå i olika Dubs över cellinjer blivit uppenbart när liknande proteiner såsom UCHL1 jämförs i HeLa och M17-celler (Figur 5). Den kemiluminescenta visualisering av gelén är kritisk eftersom till skillnad från den amidosvart fläcken, som visar den mängd protein laddades, visar detta den mängd aktivt protein som har reagerat med sondema. Ljusbilden av molekylviktsstandarder (figur 5B) tjänar som guide för att identifiera de olika DUBS. Massan av sonden måste läggas till storleken av proteinet vid analysen av resultaten för att karakterisera DUB s vid rätt molekylvikter.
Figur 1:. Lysis Metoder för celler och vävnader Bild som visar cellys med användning av glaspärlor i (A) jämfört med polytron lys i (B).
Figur 2: Centrifuge Produkter av celler och vävnader Cellysat visar fasta glaspärlor och obrutna membran och organeller i botten efter lys och centrifugering i (A).. Vävnads lysat som visar de obrutna membran och organeller i botten efter homogenisering och centrifugering i (B).
700 "/>
Figur 3:.. Mekanism för märkning av Dubs Ett schema som visar den kovalenta kopplingen mellan det aktiva stället cysteinrest och den funktionella gruppen av HA-Ub-VS Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: amidosvart fläckar av membranen Membran visar amidosvart-färgning görs på lysat inkuberade med N -ethylmaleimide (NEM), märkt med HA-Ub-vinylsulfon (VS) och kördes på en Western blöt.. Proverna är följande från vänster till höger - (A) HeLa - NEM, HeLa + NEM; (B) Herr Standards, M17 -. NEM, M17 + NEM Vänligen CLICk här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Western blöts resultat Membran visar aktivitetsnivåerna för de olika Dubs bestämt genom sondering för anti-HA.. Proverna är följande från vänster till höger - (A) HeLa - NEM, HeLa + NEM; (B) Mr standarder; (C) M17 -. NEM, M17 + NEM Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eftersom ubikitinering är en grundläggande cellulär aktivitet, kunde förstå regleringsmekanismer vara nyckeln till att avslöja processerna för sjukdomen och patologi. Användningen av HA märkt Ub-härledda aktiva sätesriktad prober som redovisas här är ett enkelt, men mycket användbar metod för att studera Ub-medierad proteinnedbrytning. Denna metod är snabbare och billigare än att studera var och en av de dubbar individuellt.
I denna metod är lys av cellerna uppnås genom mekaniska medel - med hjälp av glaspärlor. Denna milda metod för lys bevarar en metabolisk intracellulär bild. Emellertid är en stor nackdel med denna lysmetoden dess låga verkningsgrad av ca 60-70%. Detta innebär en hel del celler erfordras för att säkerställa lysaten koncentreras tillräckligt för experiment. T75-kolvar med 80-90% sammanflytande cellskikt bör användas för att producera en koncentrerad lysat. Vidare är trypsinering steget av experimentet kritiskaeftersom de flesta av de bifogade celler skall suspenderas i lösningen. Kontrollera kolven under ett mikroskop för att se till att en betydande del av cellerna i odling är flytande innan de överförs till 50 ml rör. Underlåtenhet att korrekt trypsinize vidhäftande celler kommer att resultera i en mindre pelleten och i förlängningen mindre lysat vid en lägre koncentration. Lysat som inte används ska förvaras vid -80 ° C, överfördes till -20 ° C 24 timmar före användning och tinas på is användningsdagen. Detta gör att lysatet tina jämnt och minskar skador på enzymer från snabb upptining.
Om du vill använda den här metoden på vävnader antingen en dounce eller polytron homogenisator kan användas i stället för glaspärlor 11. Den erhållna lysatet kan märkas med sonderna omedelbart eller lagras för användning vid -80 ° C. Om Dounce eller polytron används för att erhålla lysatet sedan glaspärlor inte bör användas. Detta leder till en minskning av den totala proteinkoncentrationen av lysatet. ENlternatively, med användning av primära cellkulturmetoder de fasta vävnadsprover kan vara odlas först och sedan lyserades med glaspärlorna.
En viktig begränsning med denna metod är att även om det tillåter användaren att visualisera aktiviteten hos de enzymer, ger det inte korrekt information om expressionsmönstren för de individuella dubbar. Denna metod använder funktionell homologi i de enzymer som inte strukturell homologi. Därför kommer ytterligare experiment med de individuella antikropparna måste göras för att klargöra om den minskade aktiviteten är ett resultat av brister i det aktiva stället eller en faktisk förlust av enzymet. Dessutom anser lys metod som används i detta protokoll inte bryta upp cellkärnorna. Dubbar i kärnan skulle kunna tillhandahålla ytterligare kritisk information om sjukdomsprocesser.
Trots denna metod är unik i sin förmåga att tillhandahålla information som inte kan erhållas från någon annan källa. Både RNA-metods och användningen av enskilda antikroppar ger inte funktionell information om enzymer. I framtiden finns potential för tillämpning av denna metod för att immunhistokemisk (IHC) färgning. IHC färgning kommer inte bara ge information om aktiviteten hos de enzymer, men det kommer också att ge en inblick i den plats i vävnaden där de olika Dubs är aktiva. Dessutom kan denna metod kopplas med en subcellulär fraktioneteknik såsom den som beskrivs av Colla et al., I 2012 för att studera aktiviteten av Dubs i membranbundna organeller 12. Även om detta är en relativt ny teknik i molekylärbiologi, det finns en enorm potential att expandera ansökningarna. Använda aktiva sätesriktad molekylära prober kan vara nyckeln till att belysa etiologin av många sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi vill tacka Lee labb vid University of Minnesota för att ge ryggmärgen hos möss vävnadsprover som användes. Detta arbete stöddes av försvarsdepartementet äggstockscancer Research Program (OCRP) OC093424 till MB, av Randy Shaver cancerforskning och gemenskapens fond till MB och Minnesota äggstockscancer Alliance (MOCA) till MB. De finansiärer hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut om att offentliggöra eller beredning av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PowerGen 125 (homogenizer) | Fischer Scientific | 14-261-02P | |
| Vacuum-driven filters 0.22 µm | BPV2210 | ||
| Glass beads, acid washed ≤106 µm (~140 U.S. sieve) | Sigma-aldrich | G4649-10G | |
| Sucrose | Fischer Scientific | S6-212 | |
| DL-dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11965-092 | |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 10010-023 | |
| Tissue culture flask 75 cm2 w/ filter cup 250 ml 120/cs | Cellstar | T-3001-2 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| HI FBS | Life Technologies | 16140-071 | |
| Monoclonal anti-HA antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | H9658 | |
| Ubiquitin vinyl sulfone (HA-tag) | Enzo Life Sciences | BML-UW0155-0025 | |
| Laemmli's SDS-Sample Buffer (4x, reducing) | Boston BioProducts | BP-110R | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 |
References
- Ovaa, H., Kessler, B. M., Rolén, U., Galardy, P. J., Ploegh, H. L., Masucci, M. G. Activity- based ubiquitin-specific (USP) profiling of virus-infected and malignant human cells. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (8), 2253-2258 (2004).
- Wilkinson, K. D. Ubiquitination and deubiquitination: Targeting of proteins for degradation by the proteasome. Semin Cell Dev Biol. 11 (3), 141-148 (2000).
- Ziad, M. E., Wilkinson, K. D. Regulation of proteolysis by human deubiquitinating enzymes. Biochim Biophys Acta. 1843 (1), 114-128 (2014).
- Rolén, U., et al. Activity Profiling of Deubiquitinating Enzymes in Cervical Carcinoma Biopsies and Cell Lines. Mol Carcinog. 45 (4), 260-269 (2006).
- Borodovsky, A., et al. Chemistry-Based Functional Proteomics Reveals Novel Members of the Deubiquitinating Enzyme Family. Chem Biol. 9 (10), 1149-1159 (2002).
- Andersson, F. L., et al. The effect of Parkinson’s-disease-associated mutations on the deubiquitinating enzyme UCH-L1. J Mol Biol. 407 (2), 261-272 (2011).
- Poon, W. W., et al. β-Amyloid (Aβ) oligomers impair brain-derived neurotrophic factor retrograde trafficking by down-regulating ubiquitin C-terminal hydrolase UCH-L1. J Biol Chem. 288 (23), 16937-16948 (2013).
- Nijman, S. M., et al. The deubiquitinating enzyme USP1 regulates the Fanconi anemia pathway. Mol Cell. 17 (3), 331-339 (2005).
- Stevenson, L. F., Sparks, A., Allende-Vega, N., Xirodimas, D. P., Lane, D. P., Saville, M. K. The deubiquitinating enzyme USP2a regulates the p53 pathway by targeting Mdm2. EMBO J. 26 (4), 976-986 (2007).
- Coughlin, K., et al. Small-molecule RA-9 inhibits proteasome-associated DUBs and ovarian cancer in vitro and in vivo via exacerbating unfolded protein responses. Clin Cancer Res. 20 (12), 3174-3186 (2014).
- Colla, E., et al. Endoplasmic Reticulum Stress Is Important for the Manifestations of α-Synucleinopathy In. Vivo. J Neurosci. 32 (10), 3306-3320 (2012).
