Summary
現在のプロトコルは、機能的に相同脱ユビキチン化酵素の活性を測定する方法を詳述します。特殊なプローブは、共有結合酵素を変更し、検出を可能にします。この方法は、新たな治療標的を同定する可能性を保持しています。
Abstract
ユビキチン - プロテアソーム系は、最近、神経変性疾患および癌を含む種々の病態に関与しています。この観点から、このシステムの調節機構を研究するための技術は、上記疾患の細胞および分子プロセスを解明するために不可欠です。本稿で概説した赤血球凝集素由来のユビキチンプローブの使用は、このシステムの研究のための貴重なツールとして機能します。本稿では、酵素活性を脱ユビキチン化の直接的な可視化を与えるアッセイを実行することを可能にする方法を詳述します。脱ユビキチン化酵素は、プロテアソーム分解を制御し、ユーザーが1つのアッセイで複数の酵素の活性を調査することができ、それらの活性部位での機能的相同性を共有します。溶解物を、穏やかな機械的な細胞破壊を介して得られた活性部位指向プローブと共にインキュベートします。非アクティブな酵素が結合していないままで機能的酵素は、プローブでタグ付けされています。実行で寧このアッセイは、ユーザが迅速かつ簡単な方法で活動し、複数の脱ユビキチン化酵素の潜在的な発現の両方の情報を取得します。現在の方法は、ヒト細胞における予測百脱ユビキチン化酵素のための個々の抗体を使用するよりも大幅に効率的です。
Introduction
ユビキチン - プロテアソームシステム（UPS）は、哺乳動物細胞内の主要な分解経路の一つとして機能します。プロテアソームで分解のためにバインドされた基板は、共有結合、ユビキチン（Ubが）1のポリマーとタグ付けされています。標的基質は、分解のためのプロテアソームに入る前に、ポリユビキチンタグを削除する必要があります。脱ユビキチン化酵素として知られる酵素のクラス（のDUB）はユビキチン分子2の除去とリサイクルを担当しています。これは、セル3内の作業約100のDUBがあることがヒトゲノムから予測されています。 UB-媒介細胞プロセスを制御するのDUBのような大規模な数と、これらの酵素を研究するだけで発現レベルに関する情報を提供するmRNA技術が活性およびウェスタンブロッティングの情報を与えないので、課題を提示します。
インフルエンザ赤血球凝集素（HA）の使用は、共有結合を可能にするMOD活性部位指向プローブをUB-由来、タグ付け機能のDUBのification、したがって、ウェスタンブロット4のこれらの酵素の活性の直接可視化を提供します。プローブは、活性部位のシステイン残基5ため自殺基質として作用するC末端のチオール反応性基を有します。これらのプローブによれば、細胞の病理学的および生理学的状態の両方で、多くのDUB活性の潜在的な発現を研究することが可能です。
DUB活性の変化は、パーキンソン病、アルツハイマー病、貧血および様々な癌6-10のような病理学的条件の範囲に関与しています。この技術は、疾患の研究のための強力なツールを提供します。本論文では、ガラスビーズを用いて溶解されているHeLa細胞およびM17細胞におけるこの技術の適用を示します。さらに、我々は、マウスの脊髄組織サンプルでこのメソッドを使用する方法の概要を示します。この技術から得られた情報を識別するための出発点として使用することができ治療標的ならびに異なる疾患状態の研究のためのモデルを確立します。この技術の真の有用性は、単一のアッセイで複数のDUBに関する情報を提供する能力にあります。
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Protocol
1.溶解緩衝液の調製
- 2 Mのストック溶液を作るために、脱イオン（DI）水にスクロースを溶解します。 0.22μmのポリフッ化ビニリデン（PVDF）フィルタを駆動し、真空を用いて、スクロースの2M溶液をフィルタリングします。
- 嫌気条件下で500 mMのストック溶液およびストアを作成するためにDI水にジチオスレイトール（DTT）を溶解します。 100mMのストック溶液を作製するためにDI水に塩化マグネシウム（MgCl 2を） を溶解します。 50mMのストック溶液を作製するためにアデノシン三リン酸（ATP）DI水中の二ナトリウム水和物を溶解します。
- DI水中のトリズマ塩酸塩を溶解し、水酸化ナトリウム（NaOH）を用いてpHを調整することにより、pH7.4のTris溶液を作ります。
- 250 mMの、1mMの、5 mMとのMgCl 2濃度は、1mMとATP濃度及び50mMのトリス濃度のDTT濃度のスクロース濃度で溶解緩衝液を作製するためにDI水に原液の部分を組み合わせます。例えば、トリス、50の535.3μLを混ぜます溶解緩衝液の10ミリリットルを作るためにMgCl 2を0μlを、スクロースの1.25ミリリットル、DTT20μlの、ATPを200μlとDI水の7.4947ミリリットル。これは、約20の実験のために使用することができます。
実験2.細胞を培養します
- 50mlコニカルチューブにDMEM + 10％ウシ胎児血清（FBS）の30ミリリットルを小分けして、メディアを作成します。
- ぬるま湯を入れた小さなビーカーに液体窒素保存から冷凍M17またはヒーラ細胞を転送します。
- 50mlコニカルチューブに細胞を移します。まず、セルバイアルに、いくつかのメディアを追加。その後、解凍の5秒以内に再懸濁した細胞を移します。
- 細胞ペレットを得るために、5分間、450×gで細胞懸濁液を遠心。 T75フラスコに培地20mlのを追加します。
- 吸引を用いて細胞からメディアを取り出します。細胞ペレットを再懸濁に新鮮な培地の5ミリリットルを追加します。
- T75フラスコ中の培地20mlに5ミリリットルの細胞懸濁液を移し、37℃でインキュベートします。 CH3日ごとにメディアをANGE。
3.細胞の回収
- 細胞に触れないように注意しながら、吸引を介してメディアを取り出します。
- リン酸緩衝生理食塩水（PBS）5mlで細胞を洗浄します。吸引を使用してPBSを削除します。
- T75フラスコにトリプシン - エチレンジアミン四酢酸（EDTA）を3mlを加え、3分間37℃でインキュベートします。
- フラスコに新鮮な培地の6ミリリットルを追加し、細胞を再懸濁。
- 5分間290×gで15ミリリットルコニカルチューブと遠心分離機にサスペンションを転送します。
- 上清を除去し、5mlのPBSを追加します。静かにペレットを破壊するためにチューブの底をタップします。 5分間290×gで遠心分離します。
- 繰り返し手順3.6三回。
- PBSを除去し、新鮮な1mlのPBSで細胞を懸濁します。エッペンドルフチューブ（1.5ミリリットル）に移します。 5分間290×gでスピン。
4.細胞溶解
- ピペットANを用いてペレットのおおよその体積を測定大量にガラスビーズを秤量dは1：1：1の体積比。溶解緩衝液中のペレットの2倍容量を追加します。
注意：ガラスビーズを追加する前にバッファを追加します。 - を溶解低温室にボルテックスすることによって4℃で30分間攪拌最大でエッペンドルフチューブ中の細胞。
- ビーズを解決する30秒200×gで遠心分離する簡単。上清を収集します。
- 上清を前のように、ガラスビーズの同じ量を加えます。
- 4℃で30分間、最大攪拌で再びボルテックス。
- ガラスビーズを解決する30秒200×gで遠心分離する簡単。上清を収集します。
- 核、膜および破壊されていない細胞を除去するために5分間、5030×gで遠心分離します。細胞溶解物である上清を、収集します。
5.組織の均質化
- 溶解バッファーにマウス脊髄組織の9溶液：1の体積質量を行います。
注：このメソッドは、異なるさまざまなに適用可能ですENT組織サンプル。 - 残っていないチャンクが存在しないことを確実にするために30秒間均質化にレベル2の設定を使用して組織を均質化します。
- 核、膜および破壊されていない細胞を除去するために、3分間5030×gでスピンダウン。
- 溶解液である上清を、収集します。
6.サンプルの誘導体化
- ピアースBCAタンパク質アッセイキットプロトコルによって指定されるように、比色、96ウェルプレートリーダーを使用して組織溶解物のタンパク質濃度を決定するために、96ウェルプレート分析でビシンコニン酸（BCA）を実行します。
- 脱イオン（DI）水を用いて50μlに合計20μgのタンパク質に対応するアリコートを持参してください。
- 溶液に、HA-UB-ビニルスルホン（VS）の1.35μMの2μlを添加して、37℃で1時間インキュベートします。これは、最終反応混合物中のプローブの50 nmの溶解物20μgの結果。これは、機能のDUBのタグ付けを確実にするために、大モル過剰です。
- 私95℃で5分間のレムリ試料緩衝液中でサンプルをncubate。 52μlの反応体積の使用2×試料緩衝液26μlを、4×試料緩衝液13μlあるいは6×サンプル緩衝液8.87μlのため。
- ゲルをロードする前に、氷上で冷却します。
7.ウエスタンブロット
- 調製した試料の40μlの12ウェル4〜20％トリス - グリシンゲルをロード
- イオンフロントが底に到達するまで、95 Vでゲルを実行します。
- ポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜上のゲルの一晩の転送を行います。
- アミドブラック染色で膜をインキュベートし、各レーン中のタンパク質の量を示す画像を得ることがmembaneをスキャンします。
- 膜を脱色し、ブロックする1時間PBS中の5％ミルクでインキュベートします。
- 1の濃度の一次抗HA抗体で膜をインキュベートする：PBS中の5％ミルク10,000のいずれかを4℃で一晩または室温で4時間。
- fは3回の洗浄を行いますまたは0.1％のTween-20洗剤でPBS中で5分間ずつ。
- 1の濃度でマウス西洋ワサビペルオキシダーゼで膜をインキュベートする：少なくとも2時間、PBS 10,000 5％ミルク。
- 0.1％のTween-20洗剤でPBS中で5分間ずつ3回の洗浄を行います。
- PBSで5分間1回洗浄を行います。
- 10分間の化学発光検出試薬で膜をインキュベートし、化学発光検出器を用いて検出します。検出器の自動露出設定を使用してください。
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Representative Results
培養M17およびHeLa細胞は、プロトコル（3細胞収穫）に詳述する方法を用いて回収し、マウスの脊髄組織が得られました。細胞ペレット/脊髄組織は、試薬調製の項に記載の溶解緩衝液を用いて管に入れました。細胞ペレットをホモジナイザー（ 図1B）を用いてホモジナイズしたガラスビーズ（ 図1A）およびマウス脊髄組織サンプルを用いて溶解しました。溶解または均質化の後、試料をガラスビーズおよび/ または破壊されていない膜およびオルガネラ（ 図2）を除去するために、5030×gで遠心分離しました。これらの方法の両方は、酵素活性を保持する溶解の機械的な手段です。細胞のタンパク質濃度は、その後、BCA法を用いて決定しました。全タンパク質の20μgを、37°C（ 図3）で1時間1.35μMプローブ2μlのインキュベートしました。次いで、試料を4倍のLaemmliの中でインキュベートしました。反応をクエンチするために95℃でサンプルバッファー。調製した試料は、4〜20％トリス - グリシンゲル上にロードし、イオンフロント下部に達するまで95 Vで実施しました。タンパク質をPVDF膜に一晩移しました。タンパク質負荷は、アミドブラック染色（ 図4）を用いて調べました。この制御ステップでは、活動の違いは、実際の細胞プロセスではなく、不均等なタンパク質負荷によるものであることが保証されます。等しいタンパク質の量は、最初の実験（ 図4A）で使用しました。第2の実験では、等しくないタンパク質の量は、異なる細胞株（ 図4B）の活性プロファイルにおける予想される差異に起因して充填しました。これは、システインの阻害剤であり、ウェスタンブロット上の低減された信号をもたらすはずであるNの -ethylmaleimide（NEM）とインキュベートしたM17細胞溶解物のための活性プロフィールの検出を確実にするために行われました。膜を抗HA一次抗体でインキュベートした、マウスHその後orseradishペルオキシダーゼおよび化学発光イメージング（ 図5）を用いて検出しました。膜（ 図5A、C）の各レーンにおけるプロファイルでのプローブの結果を使用してのDUBの成功したタグ付け。異なる分子量のバンドの強度は、DUB酵素の活性レベルに対応します。このようなUCHL1と同様のタンパク質はHeLaおよびM17細胞（ 図5）で比較すると細胞株の様々なのDUBの活性レベルの違いが明らかになる。ロードされたタンパク質の量を示し、アミドブラック染色とは異なり、これはプローブと反応した活性タンパク質の量を示しているため、ゲルの化学発光の視覚化が重要です。分子量標準の光画像（ 図5B）は、様々なのDUBを識別するためのガイドとして機能します。プローブの質量は、DUBを特徴付けるために、結果の分析の間にタンパク質のサイズを追加する必要があります正しい分子量での。
図1：細胞および組織のための溶解法画像（B）でポリトロン溶解対（A）において、ガラスビーズを用いて細胞溶解を示します。
図2：（A）に溶解し、遠心分離後の底部に沈降したガラスビーズと切れ目のない膜および細胞小器官を示す細胞および組織の細胞溶解物を遠心分離製品 。 （B）で均質化し、遠心分離後の下部に切れ目のない膜および細胞小器官を示す組織溶解物。
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図3：のDUBのタグ付けのためのメカニズムの活性部位のシステイン残基とHA-UB-VSの官能基間の共有結合を示す概略この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図4：膜のアミドブラック汚れ のN -ethylmaleimide（NEM）とインキュベートした溶解物で行わアミドブラック染色、HA-UB-ビニルスルホン（VS）でタグ付けし、ウエスタンブロット上で実行さを示す膜。左から右に次のようにサンプルがある- （A）HeLa細胞- NEM、HeLa細胞+ NEM; （B）氏規格、M17 - NEM、M17 + NEM。 CLICくださいこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをKです。
図5：ウェスタンブロットの結果 、抗HA用プローブすることによって決定されるような様々なのDUBの活性レベルを示す膜。左から右に次のようにサンプルがある- （A）HeLa細胞- NEM、HeLa細胞+ NEM; （B）氏規格。 （C）M17 - 。NEM、M17 + NEM この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Discussion
ユビキチン化は、基本的な細胞活動であるので、調節機構を理解することは、疾患や病態のプロセスを発掘するための鍵である可能性があります。 HAの使用は、UB-媒介タンパク質分解を研究するための簡単な、しかし非常に適用可能な方法を提供し、ここで報告したUb由来の活性部位特異的プローブをタグ付け。この方法は、個別のDUBのそれぞれの研究よりも速く、安価です。
ガラスビーズを用いた - この方法では、細胞の溶解は、機械的手段を介して達成されます。溶解のこの穏やかな方法は、代謝、細胞内の画像を保存します。しかしながら、この溶解法の主な欠点は、約60〜70％の低い効率です。これは、細胞の多くは、溶解物を実験のために十分に濃縮されていることを確認する必要があることを意味します。 80付きT75フラスコ - 90％コンフルエントの細胞層を濃縮溶解物を生成するために使用されるべきです。また、実験のトリプシン処理工程が非常に重要です付着した細胞のほとんどは、溶液中に懸濁させなければならないからです。培養中の細胞の大部分が50 mlチューブに移す前に浮遊していることを確認するために、顕微鏡下でフラスコを確認してください。正しく接着細胞をトリプシン処理に失敗すると、より低い濃度ではあまり溶解液小さいペレットにし、拡張することにより生じます。使用されていない溶解物を、使用前に-20℃で24の時間に移し、氷上で使用する日に解凍し、-80℃で保存してください。これは、溶解物を均一に解凍することができますし、急速解凍からの酵素へのダメージを軽減します。
ダウンスまたはPolytronホモジナイザーのいずれかは、ガラスビーズ11の代わりに使用することができる組織にこの方法を適用します。得られた溶解物をすぐにプローブでタグ付きまたは-80°Cでの使用のために保存することができます。ダウンスまたはポリトロンを溶解物を得るために使用される場合、ガラスビーズを使用すべきではありません。これは、溶解物の総タンパク質濃度の減少をもたらします。 Alternatively、固体組織試料を最初に培養した後、ガラスビーズを用いて溶解することができる初代細胞培養法を用いて。
この方法の主な制限は、ユーザが、酵素の活性を可視化することができるにもかかわらず、それは個々のDUBの発現パターンに正確な情報を与えないということです。この方法は、酵素ではない構造的相同性に機能的相同性を使用しています。したがって、個々の抗体とのさらなる実験は、活性の低下は、活性部位または酵素の実際の損失の欠陥の結果であるかどうかを説明するために行う必要があります。さらに、このプロトコルで使用される溶解法は、細胞の核を開いて壊れません。核内でのDUBは、疾患プロセスに関するさらに重要な情報を提供することができます。
それにもかかわらず、この方法は、任意の他の供給源から得ることができない情報を提供する能力において独特です。両方のRNAメトDSおよび個々の抗体の使用は、酵素に関する機能情報を提供していません。将来的には、潜在的には、免疫組織化学（IHC）染色にこの方法を適用するために存在します。 IHC染色は、酵素の活性についての情報を与えるだけでなく、様々なのDUBがアクティブになっている組織内の場所への洞察を提供します。また、この方法は、このようなコラらによって詳述一つとして、細胞下分画技術と結合することができる。2012年には、膜結合オルガネラ12中のDUBの活性を研究します。これは分子生物学では比較的新しい技術であるが、用途を拡大する大きな可能性があります。活性部位指向分子プローブを使用すると、多くの疾患の病因の解明の鍵を握るかもしれません。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
我々は、使用されたマウスの脊髄の組織サンプルを提供するためのミネソタ大学の李研究室に感謝したいと思います。この作品は、MBにMBに、ランディシェーバーがん研究とコミュニティ基金MBにミネソタ卵巣癌アライアンス（MOCA）による国防総省の卵巣癌研究プログラム（OCRP）OC093424によってサポートされていました。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、公開することを決定または原稿の準備で何の役割も持っていません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PowerGen 125 (homogenizer) | Fischer Scientific | 14-261-02P | |
| Vacuum-driven filters 0.22 µm | BPV2210 | ||
| Glass beads, acid washed ≤106 µm (~140 U.S. sieve) | Sigma-aldrich | G4649-10G | |
| Sucrose | Fischer Scientific | S6-212 | |
| DL-dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11965-092 | |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 10010-023 | |
| Tissue culture flask 75 cm2 w/ filter cup 250 ml 120/cs | Cellstar | T-3001-2 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| HI FBS | Life Technologies | 16140-071 | |
| Monoclonal anti-HA antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | H9658 | |
| Ubiquitin vinyl sulfone (HA-tag) | Enzo Life Sciences | BML-UW0155-0025 | |
| Laemmli's SDS-Sample Buffer (4x, reducing) | Boston BioProducts | BP-110R | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 |
References
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