Summary
Auf den aktuellen Protokollinformationen ein Verfahren zur Messung der Aktivität der funktionell homolog Deubiquitinierungsenzyme. Specialized-Sonden, die das Enzym kovalent modifizieren und lassen für die Erkennung. Dieses Verfahren hält das Potenzial, neue therapeutische Targets zu identifizieren.
Abstract
Das Ubiquitin-Proteasom-System wurde vor kurzem in verschiedenen Pathologien einschließlich neurodegenerativen Krankheiten und Krebs in Verbindung gebracht. In diesem Licht sind, Verfahren für die Untersuchung der Regulationsmechanismus des Systems wesentlich, die Aufklärung der zellulären und molekularen Prozesse der zuvor genannten Erkrankungen. Die Verwendung von Hämagglutinin abgeleitet Ubiquitin Sonden vorliegenden Ausführungen dient als wertvolles Werkzeug zur Untersuchung des Systems. Dieses Papier Details eines Verfahrens, das dem Benutzer ermöglicht, Tests, die eine direkte Visualisierung der deubiquitinierenden Enzymaktivität geben, durchzuführen. Deubiquitinierungsenzyme steuern proteasomalen Abbau und teilen funktionelle Homologie in ihren aktiven Zentren, die es dem Benutzer, um die Aktivität mehrerer Enzyme in einem Test untersucht werden können. Lysate werden durch sanfte mechanische Zellaufschluss erhalten und mit der aktiven Stelle gerichtet Sonden inkubiert. Functional Enzyme werden mit den Sonden markiert, während inaktiver Enzyme ungebunden bleiben. Durch Laufning dieser Test erhält der Benutzer Informationen sowohl über die Aktivität und möglichen Expression mehrerer Deubiquitinierungsenzyme in einer schnellen und einfachen Weise. Das gegenwärtige Verfahren ist wesentlich effizienter als die Verwendung von einzelnen Antikörper für die vorhergesagten hundert Deubiquitinierungsenzyme in der menschlichen Zelle.
Introduction
Der Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) als eine der wichtigsten Abbauwege in der Säugerzelle ist. Substrate für den Abbau im Proteasom gebunden sind kovalent mit Polymeren von Ubiquitin (Ub) 1 markiert. Bevor die gezielte Substrat das Proteasom für den Abbau eintritt, muss der Poly-Ubiquitin-Tag entfernt werden. Eine Klasse von Enzymen als Deubiquitinierungsenzyme (DUBs) bekannt ist, ist für die Beseitigung und Verwertung von Ubiquitin-Moleküle 2 verantwortlich. Es wurde aus dem menschlichen Genom vorhergesagt, dass es fast hundert DUBs arbeiten in der Zelle 3. Mit solch einer großen Anzahl von DUBs Steuerung Ub-vermittelte zelluläre Prozesse, das Studium dieser Enzyme ist eine Herausforderung, da mRNA Techniken nicht geben Auskunft über Aktivität und Western-Blot nur gibt Informationen über die Expressionsniveaus.
Die Verwendung von Influenza-Hämagglutinin (HA) versehen, Ub abgeleitete aktive Zentrum gerichteten Sonden ermöglicht eine kovalente modifizierung der funktionellen DUBs und deshalb ergibt eine direkte Visualisierung der Aktivität dieser Enzyme auf einem Western-Blot-4. Die Sonden haben eine C-terminalen Thiol reaktionsfähigen Gruppe, die als Suizid-Substrat für das aktive Zentrum Cysteinrest 5 dient. Bei diesen Sonden ist es möglich, die Aktivität und möglichen Expression vieler DUBs unter beiden pathologischen und physiologischen Zuständen der Zelle zu untersuchen.
Änderungen DUB Aktivität wurden in einer Reihe von pathologischen Zuständen, wie Parkinson, Alzheimer, Anämie und verschiedene Krebs 6-10 gebracht. Diese Technik bietet ein leistungsstarkes Werkzeug zur Untersuchung von Krankheiten. In der vorliegenden Arbeit zeigen wir die Anwendung dieser Technik in HeLa und M17-Zellen unter Verwendung von Glasperlen, die aufgeschlossen haben. Zusätzlich beschreiben wir, wie man diese Methode in der Maus Rückenmark Gewebeproben zu verwenden. Die von dieser Technik erhaltenen Informationen können als Ausgangspunkt für die Identifizierung verwendet werdentherapeutische Ziele sowie die Schaffung Modelle für die Untersuchung von verschiedenen Krankheitszuständen. Der wahre Nutzen dieser Technik liegt in ihrer Fähigkeit, Informationen zu mehreren DUBs in einem einzigen Assay bereitzustellen.
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Protocol
1. Lysis Buffer Vorbereitung
- Löse Saccharose in deionisiertem (DI) Wasser, um eine 2 M Stammlösung zu machen. Filtern einer 2 M Lösung von Saccharose mit einer Vakuum angetrieben 0,22 um aus Polyvinylidenfluorid (PVDF) Filter.
- Löse Dithiothreitol (DTT) in DI-Wasser, um eine 500 mM-Stammlösung und speichern unter anaeroben Bedingungen zu machen. Löse Magnesiumchlorid (MgCl 2) in DI-Wasser, um eine 100 mM-Stammlösung zu machen. Löse Adenosintriphosphat (ATP) Dinatrium-Hydrat in DI-Wasser, um eine 50 mM Stammlösung zu machen.
- Bilden eine Tris-Lösung bei pH 7,4 durch Auflösen Trizma-Hydrochlorid in entionisiertem Wasser und Einstellen des pH unter Verwendung von Natriumhydroxid (NaOH).
- Kombinieren Abschnitte der Stammlösungen in VE-Wasser auf einen Lysepuffer mit einer Saccharose-Konzentration von 250 mM, DTT einer Konzentration von 1 mM, einer MgCl 2 -Konzentration von 5 mM, einem ATP-Konzentration von 1 mM und einer Tris-Konzentration von 50 mM zu machen . Beispielsweise mischen 535,3 ul Tris, 500 & mgr; l MgCl 2, 1,25 ml Saccharose, 20 & mgr; l DTT, 200 & mgr; l ATP und 7,4947 ml DI-Wasser, um 10 ml Lysepuffer. Dies kann etwa 20 Experimente eingesetzt werden.
2. Kultivieren von Zellen für das Experiment
- Stellen Medien durch Aliquotieren von 30 ml DMEM + 10% fötalem Rinderserum (FBS) in einem 50 ml konischen Röhrchen.
- Übertragen gefrorenen M17 oder HeLa-Zellen aus Flüssigstickstofflager um einen kleinen Becher mit lauwarmem Wasser.
- Übertragen der Zellen an die 50 ml konischen Röhrchen. Fügen Sie zunächst einige Medien zur Zellfläschchen. Dann übertragen Sie die resuspendierten Zellen innerhalb von 5 Sekunden nach dem Auftauen.
- Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 450 xg für 5 min, um ein Zellpellet zu erhalten. 20 ml Medium in einem T75-Kolben.
- Entfernen Sie die Medien aus den Zellen mit Absaugung. Mit 5 ml frischem Medium zu dem Zellpellet und resuspendieren.
- Übertragen die 5 ml Zellsuspension in 20 ml Medium in T75-Kolben und Inkubieren bei 37 ° C. Change die Medien alle 3 Tage.
3. Zellernte
- Entfernen Sie die Medien über Saug-, man aufpassen, die Zellen nicht zu berühren.
- Mit 5 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen, die Zellen. Entfernen PBS mit Absaugung.
- 3 ml Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) an den T75-Kolben und Inkubieren bei 37 ° C für 3 min.
- 6 ml frischem Medium in den Kolben gegeben und die Zellen resuspendieren.
- Übertragen Sie die Suspension auf eine 15 ml konischen Rohr und Zentrifuge bei 290 xg 5 Minuten.
- Entfernen Sie den Überstand und 5 ml PBS. Klopfen Sie leicht den Boden der Röhre zum Aufbrechen der Pellets. Zentrifuge bei 290 × g für 5 min.
- Wiederholen Sie Schritt 3.6 dreimal.
- Entfernen PBS und Resuspendieren der Zellen in 1 ml frischem PBS. Übertragen auf die Eppendorf-Röhrchen (1,5 ml). Spin bei 290 xg für 5 min.
4. Cell Lysis
- Messen Sie den ungefähren Volumen des Pellets mit einer Pipette eind abwiegen Glasperlen in einer Masse: Volumen-Verhältnis von 1: 1. Ist die doppelte Volumen des Pellets in Lyse-Puffer.
Hinweis: Fügen Sie den Puffer vor der Zugabe der Glasperlen. - Lysieren die Zellen im Eppendorf-Röhrchen bei der maximalen Rühren für 30 min bei 4 ° C durch Verwirbeln in einem kalten Raum.
- Kurz zentrifugieren bei 200 · g für 30 Sekunden, um die Perlen zu begleichen. Sammeln Sie den Überstand.
- Das gleiche Volumen von Glasperlen als vor dem Überstand.
- Wirbel wieder bei maximaler Rühren für 30 min bei 4 ° C.
- Kurz zentrifugieren bei 200 · g für 30 Sekunden, um die Glasperlen zu begleichen. Sammeln Sie den Überstand.
- Zentrifuge bei 5.030 xg für 5 Minuten, um die Kerne, Membranen und aufgebrochene Zellen zu entfernen. Sammeln Sie den Überstand, der das Zell-Lysat ist.
5. Gewebehomogenisierung
- Einen Masse: Volumen von 1: 9 Lösung von Maus-Rückenmarkgewebe zu Lysepuffer.
Hinweis: Dieses Verfahren ist für eine Vielzahl von unterschiedlichent Gewebeproben. - Homogenisierung mittels einer Einstellung der Ebene 2 auf der Homogenisator 30 sec lang in das Gewebe, um sicherzustellen, daß es keine Klumpen bleiben.
- Spin down bei 5.030 × g für 3 min, um die Kerne, Membranen und aufgebrochene Zellen zu entfernen.
- Sammeln Sie den Überstand, der das Lysat.
6. Proben Derivatisierung
- Führen eine Bicinchoninsäure (BCA) in einer 96-Well-Platte Analyse, um die Proteinkonzentration der Gewebelysat Verwendung eines kolorimetrischen 96-Well Plattenlesegerät, wie durch den Pierce BCA Protein Assay Kit Protokoll spezifiziert zu bestimmen.
- Bringen eines Aliquots, die 20 & mgr; g Gesamtprotein zu 50 & mgr; l mit deionisiertem (DI) Wasser.
- Add 2 ul 1,35 uM HA-Ub-Vinylsulfon (VS) zu der Lösung und Inkubation für 1 h bei 37 ° C. Dies führt zu 20 ug Lysat bis 50 nM Sonde in der endgültigen Reaktionsmischung. Dies ist zum großen molaren Überschuß an Kennzeichnungs funktioneller DUBs gewährleisten.
- ICHncubate die Probe in Laemmli-Probenpuffer für 5 Minuten bei 95 ° C. Für eine 52 & mgr; l Reaktionsvolumen Einsatz 26 ul 2x Probenpuffer, 13 ul Probenpuffer 4x oder 6x 8,87 ul Probenpuffer.
- Kühle auf Eis vor dem Laden des Gels.
7. Western Blot
- Laden Sie eine 12-Well-4-20% Tris-Glycin-Gel mit 40 ul der vorbereiteten Probe
- Führen Sie das Gel bei 95 V, bis der Ionenfront den Boden erreicht.
- Führen Sie eine Übernachtung Transfer des Gels auf eine Polyvinylidendifluorid (PVDF) Membran.
- Inkubieren der Membran in dem Amidoschwarz Fleck und tasten den membane um ein Bild, das die Menge an Protein in jeder Spur erhalten.
- Entfärben der Membran und Inkubation in 5% Milch in PBS für 1 Stunde zu blockieren.
- Inkubieren der Membran in dem primären anti-HA-Antikörper in einer Konzentration von 1: 10.000 in 5% Milch in PBS entweder über Nacht bei 4 ° C oder für 4 h bei Raumtemperatur.
- Führen Sie 3 Waschungen foder jeweils 5 min in PBS mit 0,1% Tween-20 Detergens.
- Inkubieren der Membran in eine Maus Meerrettichperoxidase in einer Konzentration von 1: 10.000 in 5% Milch in PBS für mindestens 2 Std.
- Zuführen 3 Waschungen jeweils 5 min in PBS mit 0,1% Tween-20 Detergens.
- Führen Sie 1 Wasch für 5 min in PBS.
- Inkubieren der Membran in eine chemilumineszierende Nachweisreagenz für 10 min und zu detektieren unter Verwendung eines Chemilumineszenz-Detektor. Verwenden Sie die automatische Belichtungseinstellung auf dem Detektor.
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Representative Results
Kultiviert M17 und HeLa-Zellen wurden unter Verwendung des Verfahrens in dem Protokoll (3. Zellernte) detailliert und Maus-Rückenmarksgewebe wurde erhalten geerntet. Das Zellpellet / Rückenmarksgewebe wurde in ein Röhrchen mit der in der Zubereitung der Reagenzien beschrieben Lysepuffer gegeben. Zellpellets mit Glasperlen (1A) und Rückenmark der Maus Gewebeproben wurden unter Verwendung eines Homogenisators (1B) homogenisiert lysiert. Nach der Lyse oder Homogenisierung wurde die Probe dann bei 5.030 × g zentrifugiert, um die Glasperlen und / oder die ungebrochene Membranen und Organellen (Abbildung 2) zu entfernen. Beide dieser Verfahren sind mechanisch mittels Lyse enzymatische Aktivität zu erhalten. Die Proteinkonzentration der Zellen wurde dann unter Verwendung des BCA-Methode bestimmt. 20 ug Gesamt-Protein wurde mit 2 ul 1,35 uM Sonde für 1 Stunde bei 37 ° C (Figur 3) inkubiert. Die Proben wurden dann in 4x Laemmli inkubiertProbenpuffer bei 95 ° C, um die Reaktion zu quenchen. Die hergestellten Proben wurden auf einem 4-20% Tris-Glycin-Gel aufgetragen und bei 95 V laufen, bis die Ionenfront den Boden erreicht. Die Proteine wurden über Nacht auf eine PVDF-Membran übertragen. Die Proteinbeladung wurde mit der Amido schwarzen Fleck (4) überprüft. Diese Steuerung wird sichergestellt, dass die Unterschiede in der Aktivität aufgrund der tatsächlichen zellulären Prozessen und nicht ungleich Proteinbeladung sind. Gleiche Proteinmengen wurden in dem ersten Experiment (4A) eingesetzt. Im zweiten Experiment wurden ungleiche Proteinmengen auf Grund der erwarteten Unterschiede in den Aktivitätsprofile der verschiedenen Zelllinien (4B) geladen. Dies wurde getan, um die Erfassung einer Aktivitätsprofil für die M17-Zelllysate N -ethylmaleimide (NEM), einem Cystein-Inhibitor und auf ein reduziertes Signal auf der Western-Blot führen inkubiert gewährleisten. Die Membranen wurden in anti-HA primären Antikörper inkubiert, einer Maus horseradish Peroxidase und mittels Chemilumineszenz Aufnahmen (5) dann nachgewiesen. Erfolgreiche Markierung der DUBs Verwendung der Sonden führt zu einem Profil in jeder Spur der Membran (5A, C). Die Intensität der Banden bei unterschiedlichen Molekulargewichten entspricht dem Aktivitätsniveau des DUB Enzyms. Die Unterschiede des Aktivitätsniveaus verschiedener DUBs über Zellinien offensichtlich werden, wenn ähnliche Proteine wie UCHL1 sind in den HeLa und M17-Zellen (5) verglichen. Das chemilumineszierende Visualisierung des Gels ist kritisch, weil im Gegensatz zu den Amido schwarzer Fleck, der die Menge an Protein geladen zeigt, zeigt dies die Menge an aktivem Protein, das mit den Sonden reagiert hat. Das Lichtbild der Molekulargewichtsstandards (5B) dient als Führung für die Identifizierung der verschiedenen DUBs. Die Masse der Sonde muss bei der Analyse der Ergebnisse, die DUB Charakterisierung der Größe des Proteins hinzugefügt werden s an den richtigen Molekulargewichten.
Abb. 1: Lyseverfahren für Zellen und Gewebe Bild zeigt Zelllyse unter Verwendung von Glasperlen in (A) im Vergleich Polytron Lyse in (B).
Abbildung 2: Die Zentrifugation Produkte von Zellen und Gewebe Zelllysat, die die ständigen Glasperlen und ungebrochene Membranen und Organellen am Boden nach der Lyse und Zentrifugation in (A).. Gewebelysat welche die ununterbrochene Membranen und Organellen an der Unterseite nach der Homogenisierung und Zentrifugation in (B).
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Abbildung 3:.. Mechanismus zur Kennzeichnung von DUBs Eine schematische Darstellung der kovalenten Verknüpfung zwischen dem aktiven Zentrum Cysteinrest und der funktionellen Gruppe des HA-Ub-VS Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Amidoschwarz Flecken der Membranen Membranen, die die Amidoschwarz Färbung auf Lysaten mit N -ethylmaleimide (NEM) inkubiert gemacht, mit HA-Ub-Vinylsulfon (VS) markiert und auf einem Western-Blot-Funktionalität.. Die Proben werden als von links nach rechts folgt - (A) HeLa - NEM, HeLa + NEM; (B) Herr Standards, M17 -. NEM, M17 + NEM Bitte click Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: Western-Blots Ergebnisse Membranen, die die Aktivitätsniveaus der verschiedenen DUBs wie durch Sondieren für Anti-HA bestimmt.. Die Proben werden als von links nach rechts folgt - (A) HeLa - NEM, HeLa + NEM; (B) Herr Standards; (C) M17 -. NEM, M17 + NEM Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Seit Ubiquitinierung ist eine grundlegende zelluläre Aktivität, könnte das Verständnis der Regulationsmechanismen der Schlüssel, um auszugraben die Prozesse der Krankheit und Pathologie. Die Verwendung von HA getaggt Ub abgeleitete aktive Zentrum gerichteten Sonden hier berichteten bietet eine einfache, aber sehr zutreffend Methode zur Untersuchung Ub-vermittelten Proteinabbau. Dieses Verfahren ist schneller und weniger kostspielig als das Studium jedes der DUBs einzeln.
In diesem Verfahren wird die Lyse der Zellen durch mechanische Mittel erreicht wird - unter Verwendung der Glasperlen. Diese schonende Methode zur Lyse bewahrt eine intrazelluläre Stoffwechsel Bild. Ist ein Hauptnachteil dieses Lyseverfahren jedoch ihre geringe Effizienz von etwa 60-70%. Das bedeutet eine Menge von Zellen werden benötigt, um sicherzustellen Lysate genug Experimenten konzentriert. T75-Kolben mit 80 bis 90% konfluenten Zellschichten verwendet werden, um einen konzentrierten Lysat herzustellen. Weiterhin ist die Trypsinisierung Schritt des Experiments kritischenda die meisten der anhaftenden Zellen müssen in der Lösung suspendiert werden. Der Kolben wird unter einem Mikroskop zu überprüfen, um sicherzustellen, dass ein signifikanter Anteil der Zellen in Kultur vor der Übertragung auf die 50-ml-Röhrchen schweben. Versagen bei der angemessenen trypsinize adhärenten Zellen werden in einem kleineren Pellets und durch Erweiterung weniger Lysat bei einer niedrigeren Konzentration führen. Lysate, die nicht verwendet werden sollten bei -80 ° C gelagert werden, übertragen auf -20 ° C 24 Stunden vor der Verwendung auf Eis aufgetaut und der Tag der Nutzung. Dies ermöglicht das Lysat gleichmäßig aufzutauen und reduziert Beschädigungen der Enzyme aus schnelles Auftauen.
Um diese Methode zu Geweben entweder einem Dounce oder Polytronhomogenisators kann anstelle der Glasperlen 11 geeignet gelten. Das erhaltene Lysat mit den Sonden sofort markiert oder zur Verwendung bei -80 ° C gelagert werden. Wenn die Dounce oder Polytron wird die Lysat erhalten dann Glaskugeln sollten nicht verwendet werden. Dies führt zu einer Verringerung der Gesamtproteinkonzentration des Lysats. EINlternativ, unter Verwendung von primären Zellkulturverfahren die festen Gewebeproben könnte kultiviert und dann mit den Glasperlen lysiert werden.
Eine wesentliche Einschränkung dieses Verfahrens ist, dass, obwohl sie dem Benutzer erlaubt, die Aktivität der Enzyme zu visualisieren, ist es nicht die Informationen korrekt auf die Expressionsmuster der einzelnen DUBs. Diese Methode verwendet funktionelle Homologie in den Enzymen nicht strukturelle Homologie. Daher werden weitere Versuche mit den einzelnen Antikörpern müssen durchgeführt, um zu erklären, ob die Reduktion der Aktivität ist ein Ergebnis von Fehlern in der aktiven Stelle oder einem tatsächlichen Verlust der Enzym werden. Darüber hinaus wird der in diesem Protokoll verwendet Lyse-Verfahren nicht aufbrechen die Kerne der Zellen. DUBs im Kern könnte liefern weitere wichtige Informationen über Krankheitsprozesse.
Dennoch ist dieses Verfahren in seiner Fähigkeit, Informationen, die nicht von irgendeiner anderen Quelle erhalten werden kann einzigartig. Sowohl RNA methods und die Verwendung von einzelnen Antikörper bieten keine funktionellen Informationen über Enzyme. In der Zukunft, besteht die Möglichkeit für die Anwendung dieses Verfahrens auf immunhistochemische (IHC) Färbung. IHC-Färbung wird nicht nur Informationen über die Aktivität der Enzyme, aber es wird auch einen Einblick in die Lage in Gewebe, in dem die verschiedenen DUBs aktiv sind. Auch könnte dieses Verfahren mit einer subzellulären Fraktionierung Technik wie der von Colla et al ausführlich gekoppelt werden. 2012, um die Aktivität der DUBs in membrangebundenen Organellen 12 zu studieren. Obwohl dies eine relativ neue Technik in der Molekularbiologie gibt es ein großes Potential, um die Anwendungen zu erweitern. Verwenden aktive Zentrum gerichteten molekularen Sonden könnte den Schlüssel zur Aufklärung der Ätiologie vieler Krankheiten zu halten.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir möchten die Lee-Labor der Universität von Minnesota für die Bereitstellung der Maus Rückenmark Gewebeproben, die verwendet wurden bedanken. Diese Arbeit wurde durch das Department of Defense Ovarian Cancer Research Program (OCRP) OC093424 auf MB, die von den Randy Shaver Cancer Research und Gemeinschaftsfonds zur MB und die Minnesota Ovarian Cancer Alliance (MOCA) bis MB. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerhebung und -analyse, Entscheidung, zu veröffentlichen oder zu Erstellung des Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PowerGen 125 (homogenizer) | Fischer Scientific | 14-261-02P | |
| Vacuum-driven filters 0.22 µm | BPV2210 | ||
| Glass beads, acid washed ≤106 µm (~140 U.S. sieve) | Sigma-aldrich | G4649-10G | |
| Sucrose | Fischer Scientific | S6-212 | |
| DL-dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11965-092 | |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 10010-023 | |
| Tissue culture flask 75 cm2 w/ filter cup 250 ml 120/cs | Cellstar | T-3001-2 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| HI FBS | Life Technologies | 16140-071 | |
| Monoclonal anti-HA antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | H9658 | |
| Ubiquitin vinyl sulfone (HA-tag) | Enzo Life Sciences | BML-UW0155-0025 | |
| Laemmli's SDS-Sample Buffer (4x, reducing) | Boston BioProducts | BP-110R | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 |
References
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