Summary
Den nåværende protokoll detaljer en metode for å måle aktiviteten av funksjonelt homologe deubiquitinating enzymer. Specialized sonder kovalent endre enzymet og gir mulighet for deteksjon. Denne metoden har potensiale for å identifisere nye terapeutiske mål.
Abstract
Den ubiquitin-proteasom-system er nylig blitt implisert i forskjellige sykdomstilstander, inkludert neurodegenerative sykdommer og kreft. I lys av dette, teknikker for å studere reguleringsmekanisme av dette systemet er avgjørende for å belyse de cellulære og molekylære prosesser i de nevnte sykdommene. Bruken av hemaglutinin avledet ubiquitin-prober som er beskrevet i dette papir tjener som et verdifullt verktøy for studium av dette systemet. Dette papiret detaljer en metode som gjør det mulig for brukeren å utføre analyser som gir en direkte visualisering av deubiquitinating enzymaktivitet. Deubiquitinating enzymer kontrollere proteasomal fornedrelse og dele funksjonelle homologi på sine aktive nettsteder, som gjør det mulig for brukeren å undersøke aktiviteten til flere enzymer i én analyse. Lysater oppnås gjennom milde mekanisk celle avbrudd og inkuberes med aktiv setestyrte sonder. Funksjonelle enzymer er merket med sondene mens inaktive enzymer forbli ubundet. Ved å kjørening av denne analysen, får brukeren informasjon om både aktiviteten og potensialet ekspresjon av flere deubiquitinating enzymer på en rask og enkel måte. Den nåværende metode er vesentlig mer effektiv enn å bruke individuelle antistoffer for de forutsagte hundre deubiquitinating enzymer i den humane celle.
Introduction
Den ubiquitin-proteasom system (UPS) fungerer som en av de viktigste nedbrytningsmekanismer i pattedyrcelle. Underlag bundet for nedbrytning i proteasome er kovalent merket med polymerer av ubiquitin (Ub) 1. Før den måls substratet kommer inn i proteasome for nedbrytning, må poly-ubiquitin merkelappen fjernes. En klasse av enzymer som kalles deubiquitinating enzymer (Dubs) er ansvarlig for fjerning og gjenvinning av ubiquitin molekyler to. Det har blitt spådd fra det menneskelige genom at det er nesten hundre Dubs arbeider i cellen tre. Med et så stort antall Dubs kontrollerende Ub-mediert cellulære prosesser, studerer disse enzymene presenterer en utfordring siden mRNA teknikker ikke gir informasjon om aktivitet og western blotting bare gir informasjon om uttrykket nivåer.
Bruken av influensa hemagglutinin (HA) merket, Ub-avledet aktive sete-rettet sonder gjør det mulig for en kovalent modreduser fuktighet av de funksjonelle Dubs og derfor gir en direkte visualisering av aktiviteten til disse enzymene på en Western blot-4. Sondene har en C-terminal tiol-reaktiv gruppe som fungerer som et substrat for selvmord det aktive sete cystein-rest 5. Med disse sonder, er det mulig å studere aktiviteten og potensialet ekspresjon av mange Dubs under begge patologiske og fysiologiske tilstander av cellen.
Endringer i DUB-aktivitet har vært implisert i en rekke patologiske tilstander, slik som Parkinsons, Alzheimers, anemi og ulike kreftformer 6-10. Denne teknikken gir et kraftig verktøy for studier av sykdommen. I det foreliggende papir, viser vi anvendelsen av denne teknikk i HeLa og M17-celler som er lysert ved hjelp av glassperler. I tillegg vi skissere hvordan du bruker denne metoden i museryggmargs vevsprøver. Informasjon fra denne teknikken kan brukes som et utgangspunkt for identifiseringterapeutiske mål samt etablere modeller for studiet av ulike sykdomstilstander. Den sanne nytten av denne teknikken ligger i dens evne til å gi informasjon om flere Dubs i en enkelt analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Lysis Buffer Forberedelse
- Oppløs sukrose i deionisert (DI) vann for å gi en 2 M stamløsning. Filtrer en 2 M løsning av sukrose ved anvendelse av en vakuumdrevet 0,22 um polyvinylidenfluorid (PVDF) filter.
- Oppløs ditiotreitol (DTT) i deionisert vann for å lage en 500 mM stamløsning og oppbevares under anaerobe betingelser. Oppløs magnesiumklorid (MgCl2) i deionisert vann for å lage en 100 mM stamløsning. Oppløs adenosin trifosfat (ATP) dinatrium-hydrat i deionisert vann for å lage en 50 mM stamløsning.
- Utgjør en Tris-løsning ved pH 7,4 ved å oppløse Trizma hydroklorid i DI vann og justering av pH-verdien ved hjelp av natrium-hydroksyd (NaOH).
- Kombiner deler av stamløsninger i deionisert vann for å gi en lyseringsbuffer med en sukrose-konsentrasjon på 250 mM, DTT en konsentrasjon på 1 mM, MgCl2 en konsentrasjon på 5 mM, en ATP-konsentrasjon på 1 mM og en konsentrasjon av Tris 50 mM . For eksempel, blande 535,3 ul tris, 500 mL av MgCl2, 1,25 ml sukrose, 20 ul DTT, 200 pl ATP og 7,4947 ml avionisert vann for å lage 10 ml lyseringsbuffer. Dette kan brukes i omtrent 20 eksperimenter.
2. Dyrknings Cells for Experiment
- Gjør media ved alikvoteringsprosessen 30 ml DMEM + 10% føtalt bovint serum (FBS) til en 50 ml konisk rør.
- Overfør frosne M17 eller HeLa-celler fra flytende nitrogen lagring til et lite begerglass med lunkent vann.
- Overfør cellene i 50 ml konisk rør. Først legger noen medier til cellen hetteglasset. Deretter overføre resuspendert celler i 5 sek til tining.
- Sentrifuger cellesuspensjonen ved 450 xg i 5 minutter for å oppnå en celle-pellet. Tilsett 20 ml av medier i en T75 kolbe.
- Fjern materialet fra cellene ved hjelp av sugekraft. Tilsett 5 ml friskt medium til cellepelleten og resuspender.
- Overfør 5 ml cellesuspensjon til 20 ml av mediet i T75-kolbe og inkuberes ved 37 ° C. Change media hver 3 dager.
3. Cell Høsting
- Fjern media via suge, være forsiktig med å berøre cellene.
- Vask cellene med 5 ml fosfatbufret saltvann (PBS). Fjern PBS bruker sugekraft.
- Tilsett 3 ml trypsin-etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) til en T75-kolbe og inkuberes ved 37 ° C i 3 minutter.
- Tilsett 6 ml frisk media til kolben og resuspender cellene.
- Overfør blandingen til et 15 ml konisk rør og sentrifuger ved 290 x g i 5 minutter.
- Fjern supernatanten og tilsett 5 ml PBS. Banke forsiktig på bunnen av røret for å bryte opp pellet. Sentrifuger ved 290 xg i 5 min.
- Gjenta steg 3,6 tre ganger.
- Fjern PBS og resuspender cellene i 1 ml frisk PBS. Overfør til Eppendorf-rør (1,5 ml). Snurr på 290 xg i 5 min.
4. cellelysis
- Mål omtrentlige volum av pellet ved hjelp av en pipette end veie ut glassperler i en masse: volumforhold på 1: 1. Legg til to ganger volumet av pelleten i lyseringsbuffer.
Merk: Legg bufferen før du legger glassperler. - Lysere cellene i Eppendorf-rør med maksimal omrøring i 30 minutter ved 4 ° C ved å virvle i et kaldt rom.
- Sentrifuger kort på 200 xg i 30 sek å bosette perlene. Samle supernatanten.
- Legg det samme volum av glassperler som før til supernatanten.
- Vortex igjen ved maksimal omrøring i 30 min ved 4 ° C.
- Sentrifuger kort på 200 xg i 30 sek for å gjøre opp glassperler. Samle supernatanten.
- Sentrifuger ved 5030 xg i 5 minutter for å fjerne kjerner, membraner og ubrutte celler. Samle supernatanten, som er cellelysatet.
5. Tissue Homogenisering
- Foreta en masse: volum på 1: 9 oppløsning av mus ryggmarg vev til lysis buffer.
Merk: Denne metoden er anvendelig til en rekke forskjelligent vevsprøver. - Homogenisere vevet ved hjelp av en innstilling på nivå 2 på homogenisator i 30 sekunder for å sikre at det ikke er noen gjenværende biter.
- Spinne ned ved 5030 x g i 3 minutter for å fjerne kjerner, membraner og ubrutte celler.
- Samle supernatanten, som er lysatet.
6. Prøve Derivatisering
- Utfør en bicinchoninic syre (BCA) i en 96-brønners plate-analyse for å bestemme proteinkonsentrasjonen i vevet ved hjelp av en kolorimetrisk lysat 96-brønners plateleser som angitt av Pierce BCA Protein Assay kit-protokoll.
- Ta en prøve svarende til 20 mikrogram av totalt protein i 50 pl ved bruk av deionisert (DI) vann.
- Tilsett 2 pl av 1,35 uM av HA-Ub-vinylsulfon (Vg) til løsningen og inkuberes i 1 time ved 37 ° C. Dette resulterer 20 ug lysat til 50 nM av probe i den endelige reaksjonsblandingen. Dette er i stor molart overskudd for å sikre merking av funksjonelle Dubs.
- Jegncubate prøven i Laemmli prøvebuffer i 5 minutter ved 95 ° C. For en 52 pl reaksjonsvolum bruk 26 mL av 2x prøvebuffer, 13 mL 4x sample buffer eller 8,87 mL av 6x sample buffer.
- Avkjøl på is før du legger i gel.
7. Western Blot
- Legg i en 12-brønnen 4-20% tris-glysin gel med 40 ul den tilberedte prøven
- Kjør gelen ved 95 V, inntil ion fronten når bunnen.
- Utføre en overnatting overføring av gelen til en polyvinylidendifluorid (PVDF) membran.
- Inkuber membranen på amido svart flekk og skanne membane for å oppnå et bilde som viser mengden av protein i hver bane.
- Destain membranen og inkuberes i 5% melk i PBS i 1 time for å blokkere.
- Inkuber membranen i den primære anti-HA-antistoff i en konsentrasjon på 1: 10.000 i 5% melk i PBS, enten over natten ved 4 ° C eller i 4 timer ved romtemperatur.
- Utfør 3 vasker feller 5 minutter hver i PBS med 0,1% Tween-20 detergent.
- Inkuber membranen i en mus pepperrot-peroksidase ved en konsentrasjon på 1: 10.000 i 5% melk i PBS i minst 2 timer.
- Utføre tre vaskinger i 5 minutter hver i PBS med 0,1% Tween-20 detergent.
- Utfør en vask i 5 min i PBS.
- Inkuber membranen i en kjemiluminescerende deteksjonsreagensen i 10 min og detektere ved hjelp av en kjemiluminescerende detektor. Bruk automatiske eksponeringsinnstillinger på detektoren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dyrkede M17 og HeLa-celler ble høstet ved anvendelse av metoden beskrevet i protokollen (3. cellehøstings) og mus ryggmarg vev ble oppnådd. Cellepelleten / ryggmarg vev ble plassert i et rør med lysis buffer som er beskrevet i reagenset fremstillings-avsnittet. Cellepelleter ble lysert ved bruk av glasskuler (figur 1 A) og muse ryggmarg vevsprøver ble homogenisert ved hjelp av homogenisator (figur 1B). Etter lysis eller homogenisering ble prøven deretter sentrifugert ved 5030 x g for å fjerne glasskulene, og / eller de ubrutte membraner og organeller (figur 2). Begge disse metodene er mekaniske midler for lysering for å bevare enzymaktivitet. Proteinkonsentrasjonen av cellene ble deretter bestemt ved anvendelse av BCA-metoden. 20 mikrogram av totalt protein ble inkubert med 2 mL av 1,35 uM probe i 1 time ved 37 ° C (figur 3). Prøvene ble deretter inkubert i 4 x Laemmlisprøvebuffer ved 95 ° C for å stanse reaksjonen. De preparerte prøver ble applisert på en 4-20% Tris-glysingel ved og kjør ved 95 V, inntil ion fremre nådd bunnen. Proteinene ble overført natten over til en PVDF-membran. Proteinet lasting ble kontrollert ved hjelp av amido- svart flekk (figur 4). Denne kontrollen trinnet sikrer at forskjellene i aktivitet skyldes faktiske cellulære prosessene og ikke ulik protein lasting. Like proteinmengder ble anvendt i det første eksperiment (figur 4A). I det andre eksperiment ble ulike mengder protein lastet grunn av den forventede forskjeller i virkningsprofilen til de forskjellige cellelinjer (figur 4b). Dette ble gjort for å sikre deteksjon av en aktivitetsprofil for de M17-cellelysatene inkubert med N -ethylmaleimide (NEM), som er en inhibitor cystein og skal føre til en redusert signal på Western blot. Membranene ble inkubert i anti-HA primært antistoff, en mus H-orseradish peroksidase og deretter oppdaget ved hjelp kjemiluminiscerende imaging (Figur 5). Vellykket merking av Dubs ved hjelp av sonder resulterer i en profil i hvert kjørefelt av membranen (figur 5A, C). Intensiteten av båndene med forskjellige molekylvekter svarer til aktivitetsnivået for DUB enzymet. Forskjellene i aktivitet av forskjellige Dubs over cellelinjer bli tydelig når lignende proteiner som UCHL1 er sammenlignet i HeLa og M17-celler (Figur 5). Den kjemiluminescerende visualisering av gelen er viktig, fordi i motsetning til den amido svart flekk, som viser mengden av protein lastet, viser mengden av aktivt protein som har reagert med probene. Lyset bilde av molekylvektstandarder (figur 5B) tjener som veiledning for å identifisere de forskjellige Dubs. Massen av sonden må legges til størrelsen av proteinet i løpet av analysen av resultatene for å karakterisere DUB s på riktig molekylvekt.
Fig. 1: Lyseringsfor Metoder for celler og vev Bilde som viser cellelysering ved hjelp av glasskuler i (A) mot Polytron lysis i (B).
Figur 2: sentrifugering produkter av celler og vev Cellelysatet som viser den sedimenterte glassperler og ubrutt membraner og organeller på bunnen etter lysering og sentrifugering i (A).. Tissue lysat viser ubrutte membraner og organeller i bunnen etter homogenisering og sentrifugering i (B).
700 "/>
Figur 3:.. Mekanisme for tagging av Dubs En skjematisk viser kovalent binding mellom det aktive området cysteinresidie og den funksjonelle gruppen av HA-Ub-VS Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: AMIDO svarte flekker av membraner Membraner viser amido- svart flekker gjort på lysates inkubert med N -ethylmaleimide (NEM), merket med HA-Ub-VinylSulfone (VS) og kjøre på en western blot.. Prøvene er som følger: fra venstre mot høyre - (A) HeLa - NEM, HeLa + NEM; (B) Mr Standards, M17 -. NEM, M17 + NEM Vennligst CLICk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Western blot resultater Membraner som viser aktivitetsnivået i de ulike Dubs som bestemt ved sondering for Anti-HA.. Prøvene er som følger: fra venstre mot høyre - (A) HeLa - NEM, HeLa + NEM; (B) Mr standarder; (C) M17 -. NEM, M17 + NEM Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Siden ubiquitinering er en grunnleggende celleaktivitet, kunne forstå de regulatoriske mekanismer være nøkkelen til å undergrave prosesser av sykdom og patologi. Bruken av HA tagget Ub-avledet aktive site rettet sonder som presenteres her gir en enkel, men svært anvendelig metode for å studere Ub-mediert protein degradering. Denne metoden er raskere og mindre kostbar enn å studere hver og en av de Dubs individuelt.
I denne metoden, blir lysering av cellene oppnås via mekaniske midler - ved hjelp av glassperler. Denne milde metoden for lyse bevarer en metabolsk intracellulær bilde. Imidlertid er en vesentlig ulempe ved denne lysemetode er den lave virkningsgrad på omkring 60-70%. Dette betyr at mange celler er nødvendig for å sikre lysater er konsentrert nok til eksperimenter. T75-kolber med 80 - 90% sammenflytende cellelag bør brukes til å fremstille en konsentrert lysat. Videre er kritisk trypsinering trinn av forsøketfordi de fleste av de festede celler må være suspendert i løsning. Kontroller kolben under et mikroskop for å sørge for at en vesentlig del av cellene i kultur blir flytende før de overføres til 50 ml røret. Hvis man trypsineres adherente celler vil resultere i et mindre pellet og forlengelse ved mindre løsningen ved en lavere konsentrasjon. Lysater som ikke er i bruk bør lagres ved -80 ° C, overført til -20 ° C 24 timer før bruk og tint på is bruksdagen. Dette gjør at lysatet for å tine jevnt og reduserer skade på enzymer fra rask tining.
For å bruke denne metoden til vev enten en Dounce eller polytron homogenisator kan anvendes i stedet for glassperlene 11. Det oppnådde Lysatet kan være merket med probene umiddelbart eller lagres for bruk ved -80 ° C. Dersom dounce eller Polytron benyttes for å oppnå lysatet deretter glassperler bør ikke brukes. Dette fører til en reduksjon i den totale proteinkonsentrasjonen av løsningen. Alternatively, ved hjelp av primære cellekultur metoder de faste vevsprøver kan dyrkes først og deretter lysert med glassperlene.
En viktig begrensning ved denne metode er at selv om den gjør det mulig for brukeren å visualisere aktiviteten av enzymene, vil det ikke gi nøyaktig informasjon om de uttrykk mønstre for de enkelte Dubs. Denne metoden bruker funksjonelle homologi i enzymene ikke strukturell homologi. Derfor vil ytterligere eksperimenter med de enkelte antistoffer må gjøres for å forklare hvorvidt reduksjonen i aktiviteten er et resultat av feil i det aktive sete, eller en faktisk tap av enzymet. I tillegg gjør den lysis metoden som brukes i denne protokollen ikke brekkes opp kjerner av cellene. Dubs i kjernen kunne gi ytterligere viktig informasjon om sykdomsprosesser.
Likevel denne metoden er unik i sin evne til å gi informasjon som ikke kan hentes fra en annen kilde. Både RNA methods og anvendelsen av individuelle antistoffer som gir ikke funksjonell informasjon om enzymer. I fremtiden er det mulighet for anvendelse av denne metoden for å immunhistokjemisk (IHC) farging. IHC farging vil ikke bare gi informasjon om aktiviteten til enzymer, men det vil også gi innsikt i plasseringen i vev hvor de ulike Dubs er aktive. Dessuten kan denne fremgangsmåte være kombinert med en subcellulære fraksjone teknikk, slik som den som er beskrevet av Colla et al. I 2012 for å undersøke aktiviteten til Dubs i membranbundet 12 organeller. Selv om dette er en relativt ny teknikk i molekylærbiologi, er det et stort potensial for å utvide programmene. Bruke aktive site rettet molekylære prober kan holde nøkkelen til å belyse etiologi av mange sykdommer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Lee laboratoriet ved Universitetet i Minnesota for å gi musen ryggmargs vevsprøver som ble brukt. Dette arbeidet ble støttet av det amerikanske forsvarsdepartementet Ovarian Cancer Research Program (OCRP) OC093424 til MB, med Randy Shaver Cancer Research and Community Fund til MB og ved Minnesota Eggstokkreft Alliance (MOCA) til MB. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PowerGen 125 (homogenizer) | Fischer Scientific | 14-261-02P | |
| Vacuum-driven filters 0.22 µm | BPV2210 | ||
| Glass beads, acid washed ≤106 µm (~140 U.S. sieve) | Sigma-aldrich | G4649-10G | |
| Sucrose | Fischer Scientific | S6-212 | |
| DL-dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11965-092 | |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 10010-023 | |
| Tissue culture flask 75 cm2 w/ filter cup 250 ml 120/cs | Cellstar | T-3001-2 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| HI FBS | Life Technologies | 16140-071 | |
| Monoclonal anti-HA antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | H9658 | |
| Ubiquitin vinyl sulfone (HA-tag) | Enzo Life Sciences | BML-UW0155-0025 | |
| Laemmli's SDS-Sample Buffer (4x, reducing) | Boston BioProducts | BP-110R | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 |
References
- Ovaa, H., Kessler, B. M., Rolén, U., Galardy, P. J., Ploegh, H. L., Masucci, M. G. Activity- based ubiquitin-specific (USP) profiling of virus-infected and malignant human cells. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (8), 2253-2258 (2004).
- Wilkinson, K. D. Ubiquitination and deubiquitination: Targeting of proteins for degradation by the proteasome. Semin Cell Dev Biol. 11 (3), 141-148 (2000).
- Ziad, M. E., Wilkinson, K. D. Regulation of proteolysis by human deubiquitinating enzymes. Biochim Biophys Acta. 1843 (1), 114-128 (2014).
- Rolén, U., et al. Activity Profiling of Deubiquitinating Enzymes in Cervical Carcinoma Biopsies and Cell Lines. Mol Carcinog. 45 (4), 260-269 (2006).
- Borodovsky, A., et al. Chemistry-Based Functional Proteomics Reveals Novel Members of the Deubiquitinating Enzyme Family. Chem Biol. 9 (10), 1149-1159 (2002).
- Andersson, F. L., et al. The effect of Parkinson’s-disease-associated mutations on the deubiquitinating enzyme UCH-L1. J Mol Biol. 407 (2), 261-272 (2011).
- Poon, W. W., et al. β-Amyloid (Aβ) oligomers impair brain-derived neurotrophic factor retrograde trafficking by down-regulating ubiquitin C-terminal hydrolase UCH-L1. J Biol Chem. 288 (23), 16937-16948 (2013).
- Nijman, S. M., et al. The deubiquitinating enzyme USP1 regulates the Fanconi anemia pathway. Mol Cell. 17 (3), 331-339 (2005).
- Stevenson, L. F., Sparks, A., Allende-Vega, N., Xirodimas, D. P., Lane, D. P., Saville, M. K. The deubiquitinating enzyme USP2a regulates the p53 pathway by targeting Mdm2. EMBO J. 26 (4), 976-986 (2007).
- Coughlin, K., et al. Small-molecule RA-9 inhibits proteasome-associated DUBs and ovarian cancer in vitro and in vivo via exacerbating unfolded protein responses. Clin Cancer Res. 20 (12), 3174-3186 (2014).
- Colla, E., et al. Endoplasmic Reticulum Stress Is Important for the Manifestations of α-Synucleinopathy In. Vivo. J Neurosci. 32 (10), 3306-3320 (2012).
