Summary
Текущий протокол детали метод для измерения активности функционально гомологичны deubiquitinating ферментов. Специализированный зонды, ковалентно модифицировать фермент и позволяют для обнаружения. Этот метод имеет потенциал для выявления новых терапевтических мишеней.
Abstract
Система убиквитин-протеасомный недавно был вовлечен в различных патологий в том числе нейродегенеративных заболеваний и рака. В свете этого, методы для изучения механизма регулирования этой системы имеют важное значение для выяснения клеточных и молекулярных процессов вышеупомянутых заболеваний. Использование гемагглютинина получены убиквитиновых зондов, описанных в этой статье служит ценным инструментом для изучения этой системы. В этом документе подробно описывается метод, который позволяет пользователю выполнять анализы, которые дают прямой визуализации deubiquitinating активность фермента. Deubiquitinating ферменты борьбы с деградацией протеасомной и поделиться функциональную гомологию в их активных сайтов, что позволяет пользователю исследовать деятельность нескольких ферментов в одном анализе. Лизаты получают посредством разрушения нежной механической клеток и инкубировали с активным сайтом направленных зондов. Функциональные ферменты помечены с зондами, а неактивные ферменты остаются несвязанными. По ходуНин этот анализ, пользователь получает информацию как о деятельности и потенциальных выражения нескольких deubiquitinating ферментов в быстрой и легкой манере. Нынешний метод является значительно более эффективным, чем при использовании отдельных антител для предсказанных сто deubiquitinating ферментов в клетке человека.
Introduction
Система убиквитин-протеасомный (ИБП) служит одним из основных путей деградации в клетке млекопитающего. Основания, связанные деградации в протеасоме ковалентно помечен полимеров убиквитином (UB) 1. Перед мишенью субстрат поступает в протеасомы для деградации, поли-убиквитин метка должна быть удалена. Класс ферментов, известных как deubiquitinating ферменты (DUBs) несет ответственность за удаление и утилизацию молекул убиквитиновых 2. Было предсказано, из генома человека, что почти в сто DUBs, работающие в клетке 3. При таком большом количестве Dubs контролирующих Ub-клеточные процессы, опосредованные, изучение этих ферментов представляет собой сложную задачу, поскольку методы мРНК не дают информацию о деятельности и вестерн-блоттинга только дает информацию о уровней экспрессии.
Использование гриппа гемагглютинина (HA) помечены, Ub, полученных активных сайтов направлены зонды позволяет ковалентной модафикация функциональных называет и поэтому дает прямой визуализации активности этих ферментов на вестерн-блоттинга 4. Зонды имеют С-концевой тиоловую реактивную группу, которая служит в качестве субстрата для самоубийства активного сайта цистеина остатком 5. С помощью этих зондов, можно изучать деятельность и потенциал экспрессию многих называет по обе патологических и физиологических состояниях клетки.
Изменения DUB активности были вовлечены в диапазоне патологических состояний, таких как болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, анемии и различных видов рака 6-10. Эта методика представляет собой мощный инструмент для изучения болезни. В настоящей работе мы показываем, применение этой методики в HeLa и M17 клеток, которые были лизированных с помощью стеклянных бусин. Кроме того, мы выделяем, как использовать этот метод в мышиных образцах ткани спинного мозга. Информация, полученная из этого метода могут быть использованы в качестве отправной точки для определениятерапевтические цели, а также устанавливающие модели для изучения различных заболеваний. Истинный полезность этого метода состоит в его способности обеспечивать информацию о нескольких называет в одном анализе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Лизис Подготовка буфера
- Растворите сахарозы в деионизованной (DI) воды, чтобы сделать маточный раствор 2 M. Фильтр 2 М раствора сахарозы при помощи вакуума, приводимый 0,22 мкм поливинилиденфторида (ПВДФ) фильтр.
- Растворите дитиотреитола (DTT) в деионизированной воде, чтобы сделать мМ маточного раствора и хранить 500 в анаэробных условиях. Растворить хлорид магния (MgCl 2) в деионизированной воде, чтобы сделать 100 мМ маточного раствора. Растворите аденозинтрифосфата (АТФ) динатриевой гидрат в DI воде, чтобы сделать 50 мМ маточного раствора.
- Составляют решение Трис при рН 7,4 путем растворения гидрохлорида Trizma в деионизированной воде и доведением рН, используя гидроксид натрия (NaOH).
- Смешайте части маточных растворов в деионизированной воде, чтобы сделать лизирующего буфера с концентрацией сахарозы 250 мм, концентрации DTT 1 мМ концентрации 5 мМ MgCl 2, концентрации АТФ и 1 мМ концентрации Трис 50 мМ , Например, смешать 535,3 мкл Трис, 500 мкл MgCl 2, 1,25 мл сахарозы, 20 мкл DTT, 200 мкл АТФ и 7,4947 мл деионизированной воды, чтобы сделать 10 мл буфера для лизиса. Это может быть использовано в течение приблизительно 20 экспериментов.
2. культивирования клеток для эксперимента
- Сделать носитель информации, на аликвоты 30 мл DMEM + 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), в 50 мл коническую пробирку.
- Перевести замороженные M17 или HeLa клетки от хранения в жидком азоте в небольшой стакан с теплой водой.
- Передача клеток в 50 мл коническую трубку. Во-первых, добавить некоторые средства массовой информации, чтобы флакон клеток. Затем перенесите Ресуспендированный клетки в течение 5 сек таяния.
- Центрифуга клеточной суспензии при 450 х г в течение 5 мин, чтобы получить клеточный осадок. Добавьте 20 мл среды в колбе Т75.
- Выньте носители из клеток с использованием всасывания. Добавьте 5 мл свежей среды к осадку клеток и ресуспендируют.
- Передача 5 мл клеточной суспензии в 20 мл среды в колбе Т75 и инкубируют при 37 ° С. Ч.Ange СМИ каждые 3 дня.
3. Сотовый урожая
- Удалить СМИ с помощью всасывания, стараясь не прикасаться к клеток.
- Промыть клетки 5 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS). Удалить PBS с помощью всасывания.
- Добавьте 3 мл трипсина-этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) с T75 колбу и инкубировать при 37 ° С в течение 3 мин.
- Добавить 6 мл свежей среды в колбу и ресуспендирования клеток.
- Перевести суспензии в 15 мл коническую трубку и центрифуги при 290 × г в течение 5 минут.
- Удалить супернатант и добавить 5 мл PBS. Аккуратно нажмите на нижнюю часть трубы, чтобы разбить шарик. Центрифуга при 290 мкг в течение 5 мин.
- Повторите шаг 3,6 три раза.
- Удалить PBS и клетки вновь суспендируют в 1 мл свежей PBS. Трансфер в пробирку Эппендорф (1,5 мл). Спин при 290 мкг в течение 5 мин.
4. лизиса клеток
- Измерьте Ориентировочный объем осадка с помощью пипетки апD взвесить стеклянные бусины в массы: объемном соотношении 1: 1. Добавить удвоенного объема осадка в буфере для лизиса.
Примечание: Добавить буфер перед добавлением стеклянных шариков. - Лизиса клеток в пробирку Эппендорфа на максимальной перемешивании в течение 30 мин при 4 ° С на вортексе в холодной комнате.
- Центрифуга кратко на 200 мкг в течение 30 сек, чтобы урегулировать бисером. Собирают супернатант.
- Добавить такой же объем, как стеклянные бусы, прежде чем к надосадочной жидкости.
- Вихревой раз при максимальной перемешивании в течение 30 мин при 4 ° С.
- Центрифуга кратко на 200 мкг в течение 30 сек, чтобы урегулировать стеклянные бусы. Собирают супернатант.
- Центрифуга при 5030 мкг в течение 5 мин, чтобы удалить ядра, мембран и неразрушенных клеток. Собирают супернатант, который клеточный лизат.
5. Ткань Гомогенизация
- Сделайте массы: объем 1: 9 решения мыши ткани спинного мозга к буфера для лизиса.
Примечание: Этот метод применим к различным отличаютсяОбразцы тканей ЛОР. - Однородный ткани с помощью настройки уровня 2 на гомогенизаторе в течение 30 сек, чтобы гарантировать, что нет никаких куски остальные.
- Спин вниз на 5030 мкг в течение 3 мин, чтобы удалить ядра, мембран и неразрушенных клеток.
- Собирают супернатант, который лизат.
6. Пример Дериватизация
- Выполнение бицинхониновой кислоты (BCA) в анализе 96-луночного планшета для определения концентрации белка в ткани лизата с использованием колориметрического 96-луночный планшет-ридера, как указано в протоколе набора для анализа белка Pierce BCA.
- Доведите аликвоту, соответствующую 20 мкг общего белка в 50 мкл с помощью деионизированной (ДИ) воды.
- Добавьте 2 мкл 1,35 мкМ HA-UB-винилсульфона (VS) к раствору и инкубируют в течение 1 ч при 37 ° С. Это приводит 20 мкг лизата до 50 нМ зонда в конечной реакционной смеси. Это в значительной молярном избытке, чтобы обеспечить мечение функциональных называет.
- Яncubate образца в буфере образца Лэммли в течение 5 минут при 95 ° С. Для 52 мкл реакционной объем использования 26 мкл 2x буфера для образца, 13 мкл буфера для образца 4-кратным или 8,87 мкл 6x буфера для образца.
- Прохладный на льду перед загрузкой геля.
7. Вестерн-блот
- Загрузка 12-луночного 4-20% Трис-глицина гель с 40 мкл приготовленной пробы
- Запустите гель при 95 V до ионов фронт не достигнет дна.
- Провести ночь передачу геля на поливинилидендифторидную (ПВДФ) мембраны.
- Инкубируйте мембраны в амидной черного красителя и сканировать membane, чтобы получить изображение, показывающее количество белка в каждой полосе.
- Destain мембраны и инкубируют в 5% молоке в PBS в течение 1 ч, чтобы блокировать.
- Инкубируйте мембраны в основной анти-HA антитела в концентрации 1: 10000 в 5% молоке в PBS либо течение ночи при 4 ° С или в течение 4 ч при комнатной температуре.
- Выполните 3 моет еили 5 мин каждый в PBS с 0,1% твина-20 моющего средства.
- Инкубируйте мембраны в мышиной пероксидазы хрена в концентрации 1: 10000 в 5% молока в PBS в течение по крайней мере 2 ч.
- Выполнение 3 промывок в течение 5 мин каждый в PBS с 0,1% твина-20 моющего средства.
- Выполните 1 мытье в течение 5 мин в PBS.
- Инкубируйте мембраны в хемилюминесцентного реагента обнаружения в течение 10 мин и обнаруживать с использованием хемилюминесцентного детектора. Используйте автоматическую экспозицию на детекторе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Искусственный M17 и HeLa клетки собирают, используя метод подробно в (Cell извлечении 3.) протокол и мыши ткани спинного мозга был получен. Осадок клеток / ткани спинного мозга, помещают в пробирку с буфером для лизиса, описанной в разделе Подготовка реагентов. Сотовые гранулы лизируют с использованием стеклянных бусин (рис 1а) и мыши образцы ткани спинного мозга гомогенизировали с помощью гомогенизатора (рис 1B). После лизиса или гомогенизации, образец затем центрифугируют при 5030 мкг для удаления стеклянных шариков и / или непрерывная мембран и органелл (рисунок 2). Оба этих метода являются механические средства лизиса направленные на сохранение ферментативной активности. Концентрацию белка из клеток затем определяли с использованием метода BCA. 20 мкг общего белка инкубировали с 2 мкл 1,35 мкМ зонда в течение 1 ч при 37 ° С (рисунок 3). Затем образцы инкубируют в 4x ЛэммлиОбразец буфера при 95 ° С, чтобы погасить реакцию. Подготовленные образцы наносили на 4-20% Трис-глицина геле и работать на 95 V до ион передней не достигли дна. Белки переносили на ночь на ПВДФ-мембраны. Загрузка белок проверяется с помощью хромамидного черное пятно (рисунок 4). Этот шаг управления обеспечивает, что различия в активности за счет фактических клеточных процессов и не Неравномерное распределение нагрузки белка. Равные количества белка были использованы в первом эксперименте (фиг.4А). Во втором эксперименте, неравные количества белка были загружены в связи с ожидаемым различий в активности профилей различных клеточных линий (фиг.4В). Это было сделано, чтобы обеспечить обнаружение профилем деятельности для клеточных лизатов M17 инкубировали с N -ethylmaleimide (NEM), что ингибитор цистеин и должно привести к снижению сигнала на вестерн-блоттинга. Мембраны инкубировали в анти-Ха первичного антитела, мыши чorseradish пероксидазы, а затем обнаружены с помощью хемилюминесцентного изображений (рисунок 5). Успешное пометки из Dubs использованием зондов результаты в профиль в каждой полосе мембраны (фиг.5А, С). Интенсивность полос на разных молекулярных весов соответствует уровню активности фермента DUB. Различия в уровнях деятельности различных называет всей клеточных линий стало очевидным, когда подобные белки, такие как UCHL1 сравниваются в клетках HeLa и M17 (рисунок 5). Хемилюминесцентный визуализация геля является критическим, поскольку в отличие от амидной черного красителя, который показывает количество белка, загруженного, это показывает количество активного белка, который взаимодействует с зондов. Свет образ стандартов молекулярной массы (5В) служит в качестве руководства для определения различных DUBs. Масса зонда должна быть добавлена к размеру белка при анализе результатов, чтобы охарактеризовать DUB с при правильных молекулярных масс.
Рисунок 1:. Лизис Методы клеток и тканей Изображение, показывающее лизис клеток, используя стеклянные бусы в (А) в зависимости от Polytron лизиса в (B).
Рисунок 2: Продукты центрифугирования клеток и тканей клеточного лизата, показывающих осевшей стеклянных шариков и неразрывные мембраны и органеллы в нижней после лизиса и центрифугировали в (а).. Ткань лизат показывающий сплошными мембраны и органеллы в нижней после гомогенизации и центрифугированию в (б).
700 "/>
Рисунок 3:.. Механизм пометки называет схематическое ковалентную связь между активным остатком цистеина на сайте и функциональной группой HA-UB-VS Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Amido черные пятна мембран Мембраны, показывающие хромамидного черный окрашивание делается на лизатов инкубировали с N -ethylmaleimide (NEM), маркированный HA-UB-винилсульфон (VS) и запустить на вестерн-блоттинга.. Образцы, как следует из Слева направо - (A) HeLa - NEM, NEM + HeLa; (B), г-н Стандарты, М17 -. NEM, NEM + M17 Пожалуйста, сделайте кликК здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: вестерн-блоттинга Мембраны результаты, показывающие уровни активности различных называет, как определено с помощью зондирования для анти-Ха.. Образцы, как следует из Слева направо - (A) HeLa - NEM, NEM + HeLa; (В) Г-н стандартов; (С) М17 -. NEM, NEM + M17 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Так убиквитинирования является фундаментальным клеточная активность, понимание механизмов регулирования может быть ключом к раскопкам процессы болезни и патологии. Использование ГК помечены Ub-активные производные сайт направлено зонды, описанные здесь, обеспечивает легкий, но очень применимый метод для изучения Ub-опосредованной деградации белка. Этот метод быстрее и дешевле, чем изучение каждого из DUBs индивидуально.
В этом методе, лизис клеток достигается с помощью механических средств - с помощью стеклянных шариков. Это щадящий метод лизиса сохраняет метаболизма внутриклеточный картину. Однако основным недостатком этого метода лизиса является низкая эффективность примерно 60-70%. Это означает много клеток необходимы для обеспечения лизаты сконцентрированы достаточно для экспериментов. T75 колбы с 80 - 90% сплошности слоев клеток должны быть использованы для получения концентрированного лизата. Кроме того, трипсинизации шаг эксперимента является критическимпотому что большинство из прилагаемых клеток должно быть приостановлено в растворе. Проверьте колбу под микроскопом, чтобы убедиться, что значительная часть клеток в культуре с плавающей перед передачей в 50 мл трубки. Неправильное Trypsinize прилипшие клетки приведет к меньшим гранул и расширения меньше лизата при более низкой концентрации. Лизаты, которые не используются, должны храниться при температуре -80 ° С, передается от -20 ° C 24 часов перед использованием и оттаивали на льду в день использования. Это позволяет лизат таять равномерно и уменьшает повреждения ферментов быстрого оттаивания.
Чтобы применить этот метод для тканей либо Даунса или Polytron гомогенизаторе можно использовать вместо стеклянных шариков 11. Полученный лизат могут быть помечены с зондами сразу или хранить для использования при -80 ° С. Если Dounce или политрон используется для получения лизата затем стеклянные бусы не должны быть использованы. Это приводит к снижению общей концентрации белка в лизате.lternatively, используя методы первичной культуре клеток образцов твердых тканей может быть культурным, а затем лизируют с стеклярусом.
Основным недостатком этого метода является то, что, хотя она позволяет пользователю визуализировать активность ферментов, она не дает точной информации о паттернов экспрессии отдельных называет. Этот метод использует функциональную гомологию в ферментов не структурную гомологию. Таким образом, дальнейшие эксперименты с отдельными антитела должны быть сделаны, чтобы объяснить ли снижение активности является результатом дефектов в активном сайте или фактических потерь фермента. Кроме того, метод лизиса используется в этом протоколе не вскрывать ядер клеток. DUBs в ядре может обеспечить дальнейшее важную информацию о процессах заболеваний.
Тем не менее этот метод является уникальным в своей способности предоставить информацию, которая не может быть получена из любого другого источника. Оба РНК-метоDS и использование отдельных антител не обеспечивают функциональную информацию о ферментов. В будущем, существует потенциал для применения этого метода к иммуногистохимического окрашивания (IHC). Окрашивание IHC будет не только давать информацию о деятельности ферментов, но он также будет дать ответ на том месте, где ткани различные DUBs активны. Кроме того, этот метод может быть соединен с субклеточном фракционирования техники, таких как один список по Колла и соавт. В 2012 году для изучения активности называет в мембранных органелл, связанных 12. Хотя это относительно новый метод в молекулярной биологии, есть огромный потенциал для расширения приложений. Использование активных сайтов направлены молекулярные зонды могут дать ключ к выяснению этиологии многих заболеваний.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить лабораторию Ли из Университета Миннесоты за предоставление образцов мыши ткани спинного мозга, которые были использованы. Эта работа была поддержана Департаментом оборонной программы рака яичников исследований (ОГОС) OC093424 к МБ, научно-исследовательским и сообщества Рак фонда Рэнди бритвы к МБ и Миннесота яичников Рак Альянс (MOCA) в МБ. Доноры не было никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PowerGen 125 (homogenizer) | Fischer Scientific | 14-261-02P | |
| Vacuum-driven filters 0.22 µm | BPV2210 | ||
| Glass beads, acid washed ≤106 µm (~140 U.S. sieve) | Sigma-aldrich | G4649-10G | |
| Sucrose | Fischer Scientific | S6-212 | |
| DL-dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11965-092 | |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 10010-023 | |
| Tissue culture flask 75 cm2 w/ filter cup 250 ml 120/cs | Cellstar | T-3001-2 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| HI FBS | Life Technologies | 16140-071 | |
| Monoclonal anti-HA antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | H9658 | |
| Ubiquitin vinyl sulfone (HA-tag) | Enzo Life Sciences | BML-UW0155-0025 | |
| Laemmli's SDS-Sample Buffer (4x, reducing) | Boston BioProducts | BP-110R | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 |
References
- Ovaa, H., Kessler, B. M., Rolén, U., Galardy, P. J., Ploegh, H. L., Masucci, M. G. Activity- based ubiquitin-specific (USP) profiling of virus-infected and malignant human cells. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (8), 2253-2258 (2004).
- Wilkinson, K. D. Ubiquitination and deubiquitination: Targeting of proteins for degradation by the proteasome. Semin Cell Dev Biol. 11 (3), 141-148 (2000).
- Ziad, M. E., Wilkinson, K. D. Regulation of proteolysis by human deubiquitinating enzymes. Biochim Biophys Acta. 1843 (1), 114-128 (2014).
- Rolén, U., et al. Activity Profiling of Deubiquitinating Enzymes in Cervical Carcinoma Biopsies and Cell Lines. Mol Carcinog. 45 (4), 260-269 (2006).
- Borodovsky, A., et al. Chemistry-Based Functional Proteomics Reveals Novel Members of the Deubiquitinating Enzyme Family. Chem Biol. 9 (10), 1149-1159 (2002).
- Andersson, F. L., et al. The effect of Parkinson’s-disease-associated mutations on the deubiquitinating enzyme UCH-L1. J Mol Biol. 407 (2), 261-272 (2011).
- Poon, W. W., et al. β-Amyloid (Aβ) oligomers impair brain-derived neurotrophic factor retrograde trafficking by down-regulating ubiquitin C-terminal hydrolase UCH-L1. J Biol Chem. 288 (23), 16937-16948 (2013).
- Nijman, S. M., et al. The deubiquitinating enzyme USP1 regulates the Fanconi anemia pathway. Mol Cell. 17 (3), 331-339 (2005).
- Stevenson, L. F., Sparks, A., Allende-Vega, N., Xirodimas, D. P., Lane, D. P., Saville, M. K. The deubiquitinating enzyme USP2a regulates the p53 pathway by targeting Mdm2. EMBO J. 26 (4), 976-986 (2007).
- Coughlin, K., et al. Small-molecule RA-9 inhibits proteasome-associated DUBs and ovarian cancer in vitro and in vivo via exacerbating unfolded protein responses. Clin Cancer Res. 20 (12), 3174-3186 (2014).
- Colla, E., et al. Endoplasmic Reticulum Stress Is Important for the Manifestations of α-Synucleinopathy In. Vivo. J Neurosci. 32 (10), 3306-3320 (2012).
