Summary
Le protocole actuel détaille un procédé pour mesurer l'activité des enzymes fonctionnellement homologue désubiquitination. Sondes spécialisées modifier de manière covalente l'enzyme et permettent de détecter. Cette méthode a le potentiel d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.
Abstract
Le système ubiquitine-protéasome a été récemment impliqué dans différentes pathologies dont les maladies neurodégénératives et des cancers. À la lumière de cela, des techniques pour étudier le mécanisme de régulation de ce système sont essentielles pour élucider les processus cellulaires et moléculaires des maladies susmentionnées. L'utilisation de l'hémagglutinine dérivée d'ubiquitine sondes décrites dans le présent document constitue un outil précieux pour l'étude de ce système. Ce document décrit en détail une méthode qui permet à l'utilisateur d'effectuer des tests qui donnent une visualisation directe de l'activité enzymatique désubiquitination. Enzymes de dé-ubiquitination contrôlent dégradation par le protéasome et partager homologie fonctionnelle sur leurs sites actifs, ce qui permet à l'utilisateur d'enquêter sur l'activité de plusieurs enzymes dans un essai. Lysats sont obtenus grâce à une rupture mécanique doux cellulaire et incubées avec site actif sondes dirigées. Enzymes fonctionnelles sont étiquetés avec les sondes en enzymes inactives demeurent non. En termeNing cet essai, l'utilisateur obtient des informations à la fois sur l'activité et l'expression potentielle de plusieurs enzymes de dé-ubiquitination d'une manière rapide et facile. La méthode actuelle est nettement plus efficace que d'utiliser des anticorps individuels pour les cent prédits enzymes de dé-ubiquitination dans la cellule humaine.
Introduction
Le système ubiquitine-protéasome (UPS) sert comme l'une des principales voies de dégradation dans la cellule de mammifère. Substrats liés à la dégradation dans le protéasome sont étiquetés de manière covalente avec des polymères de l'ubiquitine (Ub) 1. Avant le substrat ciblé entre le protéasome de dégradation, l'étiquette de poly-ubiquitine doit être retiré. Une classe d'enzymes appelées enzymes de dé-ubiquitination (DUB) est responsable de l'élimination et le recyclage des molécules d'ubiquitine 2. Il a été prédite à partir du génome humain qui, il ya près d'une centaine DUBs travaillant dans la cellule 3. Avec un si grand nombre de processus cellulaires DUBs contrôle Ub-médiation, l'étude de ces enzymes représente un défi, car les techniques d'ARNm ne donnent pas d'informations sur l'activité et western blot ne donne des informations sur les niveaux d'expression.
L'utilisation de la grippe hémagglutinine (HA) marqué, Ub sondes dérivées de sites actifs dirigée permet un mod covalenteification des DUBs fonctionnels et donc donne une visualisation directe de l'activité de ces enzymes sur un western blot 4. Les sondes ont un groupe réactif thiol C-terminal qui sert de substrat suicide pour le résidu cysteine du site actif 5. Avec ces sondes, il est possible d'étudier l'activité et l'expression de nombreux DUBs potentiel sous les deux états pathologiques et physiologiques de la cellule.
Changements dans l'activité DUB ont été impliqués dans une gamme de conditions pathologiques comme la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer, l'anémie et divers cancers 6-10. Cette technique fournit un outil puissant pour l'étude des maladies. Dans le présent article, nous montrons l'application de cette technique dans les cellules HeLa et M17 qui ont été lysées en utilisant des billes de verre. En outre, nous décrivons comment utiliser cette méthode dans des échantillons de tissus de la moelle épinière de souris. L'information obtenue à partir de cette technique peut être utilisée comme un point de départ pour identifiercibles thérapeutiques ainsi que l'établissement de modèles pour l'étude des différents états pathologiques. La véritable utilité de cette technique réside dans sa capacité à fournir des informations sur plusieurs DUBs dans un seul essai.
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Protocol
1. Préparation Lysis Buffer
- Dissoudre saccharose dans déminéralisée (DI) de l'eau pour faire un bouillon solution 2 M. Filtrer une solution 2 M de saccharose en utilisant un vide poussé de 0,22 um polyfluorure de vinylidène (PVDF) filtre.
- Dissoudre dithiothréitol (DTT) dans de l'eau DI pour faire un mM solution et magasin 500 dans des conditions anaérobies. Dissoudre le chlorure de magnésium (MgCl 2) dans de l'eau DI pour faire un bouillon solution 100 mM. Dissoudre l'adénosine triphosphate (ATP) disodique hydraté dans de l'eau DI pour faire un bouillon solution à 50 mM.
- Préparer une solution de Tris à un pH de 7,4 en dissolvant le chlorhydrate de Trizma dans de l'eau DI et à ajuster le pH avec de l'hydroxyde de sodium (NaOH).
- Moissonneuse parties des solutions mères dans de l'eau désionisée pour faire un tampon de lyse avec une concentration en saccharose de 250 mM, une concentration de DTT de 1 mM, la concentration de MgCl2 5 mM, une concentration en ATP de 1 mM et une concentration de Tris de 50 mM . Par exemple, mélanger 535,3 ul de tris, 500 ul de MgCl2, 1,25 ml de saccharose, 20 ul de DTT, 200 ul d'ATP et de 7,4947 ml d'eau désionisée pour faire 10 ml de tampon de lyse. Ceci peut être utilisé pendant environ 20 expériences.
2. la culture de cellules pour l'expérience
- Assurez médias par aliquotage 30 ml de DMEM + 10% de sérum fœtal bovin (FBS) dans un tube conique de 50 ml.
- Transfert cellules HeLa M17 ou congelés de stockage d'azote liquide à un petit bécher avec de l'eau tiède.
- Transférer les cellules à 50 ml le tube conique. D'abord, ajouter certains médias à la fiole de cellule. Puis transférer les cellules remises en suspension dans les 5 secondes de la décongélation.
- Centrifuger la suspension de cellules à 450 xg pendant 5 minutes pour obtenir un culot cellulaire. Ajouter 20 ml de milieu dans un flacon T75.
- Retirez le support des cellules en utilisant aspiration. Ajouter 5 ml de milieu frais au culot cellulaire et remettre en suspension.
- Transférer la suspension cellulaire 5 ml à 20 ml de milieu dans le flacon T75 et incuber à 37 ° C. ChAnge les médias tous les 3 jours.
3. Cellule récolte
- Retirez les médias par l'intermédiaire aspiration, en faisant attention à ne pas toucher les cellules.
- Laver les cellules avec 5 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Retirer du PBS en utilisant une aspiration.
- Ajouter 3 ml de trypsine-acide éthylènediaminetétra-acétique (EDTA) au flacon T75 et incuber à 37 ° C pendant 3 min.
- Ajouter 6 ml de milieu frais dans le ballon et remettre en suspension les cellules.
- Transférer la suspension dans un tube conique de 15 ml et centrifuger à 290 g pendant 5 minutes.
- Eliminer le surnageant et ajouter 5 ml de PBS. Tapotez doucement le bas du tube pour briser le culot. Centrifuger à 290 g pendant 5 min.
- Répétez l'étape 3.6 trois fois.
- Retirer du PBS et remettre les cellules dans 1 ml de PBS frais. Transfert au tube Eppendorf (1,5 ml). Spin à 290 g pendant 5 min.
4. lyse cellulaire
- Mesurer le volume approximatif de la pastille en utilisant une pipette d'unD peser perles de verre dans une masse: rapport en volume de 1: 1. Ajouter deux fois le volume du culot dans un tampon de lyse.
Note: Ajouter le tampon avant d'ajouter les perles de verre. - Lyse des cellules dans le tube Eppendorf dans la agitation maximale pendant 30 minutes à 4 ° C par agitation par tourbillonnement dans une chambre froide.
- Centrifuger à 200 g pendant 30 secondes pour régler les perles. Recueillir le surnageant.
- Ajouter le même volume de billes de verre comme précédemment pour le surnageant.
- Vortex nouveau à une agitation maximale pendant 30 min à 4 ° C.
- Centrifuger brièvement à 200 xg pendant 30 sec à régler les perles de verre. Recueillir le surnageant.
- Centrifuger à 5030 g pendant 5 min pour éliminer les noyaux, les membranes et les cellules non rompues. Récupérer le surnageant, ce qui est le lysat cellulaire.
5. L'homogénéisation tissulaire
- Faites une masse: volume de 1: 9 solution de tissus de la moelle épinière de souris pour tampon de lyse.
Remarque: Cette méthode est applicable à une variété de différerdes échantillons de tissus ENT. - Homogénéiser le tissu en utilisant un réglage de niveau 2 de l'homogénéisateur pendant 30 s afin d'assurer qu'il n'y a pas de morceaux restants.
- Isoler à 5030 g pendant 3 min pour enlever les noyaux, les membranes et les cellules non rompues.
- Récupérer le surnageant, qui est le lysat.
6. La dérivation de l'échantillon
- Effectuer un acide bicinchoninique (BCA) dans une analyse de plaque de 96 puits pour déterminer la concentration en protéines du lysat de tissu en utilisant un lecteur de plaques à 96 puits colorimétrique comme spécifié par le Pierce BCA Protein Assay protocole de la trousse.
- Amener une partie aliquote correspondant à 20 pg de protéine totale à l'aide de 50 ul (DI) de l'eau de-ionisée.
- Ajouter 2 ul de 1,35 M de HA-Ub-vinyle sulfone (VS) à la solution et incuber pendant 1 heure à 37 ° C. Il en résulte 20 pg de lysat de 50 nM de sonde dans le mélange réactionnel final. Ceci est en grand excès molaire d'assurer le marquage de DUBs fonctionnels.
- JEncubate l'échantillon dans le tampon d'échantillon de Laemmli pendant 5 minutes à 95 ° C. Pour un volume de 52 ul de réaction utilisation 26 ul de tampon d'échantillon 2x, 13 ul de tampon d'échantillon 4x ou 8,87 pi de tampon d'échantillon 6x.
- Refroidir sur de la glace avant de charger le gel.
7. Western Blot
- Charger un 4-20% gel de tris-glycine 12 puits avec 40 pl de l'échantillon préparé
- Exécutez le gel à 95 V jusqu'à ce que le front d'ions atteint le fond.
- Effectuer un transfert durant la nuit du gel sur un polyfluorure de vinylidène (PVDF).
- Incuber la membrane dans la amido tache noire et de numériser l'membane pour obtenir une image montrant la quantité de protéine dans chaque voie.
- Destain la membrane et incuber dans 5% de lait dans du PBS pendant 1 heure pour bloquer.
- Incuber la membrane dans l'anticorps primaire anti-HA à une concentration de 1: 10000 dans 5% de lait dans du PBS, soit pendant une nuit à 4 ° C ou pendant 4 heures à température ambiante.
- Effectuez 3 lavages fou 5 minutes chacun dans du PBS avec 0,1% de Tween-20 détergent.
- Incuber la membrane à une peroxydase de raifort de la souris à une concentration de 1: 10000 dans 5% de lait dans du PBS pendant au moins 2 heures.
- Effectuer trois lavages pendant 5 minutes chacun dans du PBS avec 0,1% de détergent Tween-20.
- Effectuer 1 lavage pendant 5 min dans du PBS.
- Incuber la membrane dans un réactif de détection de chimioluminescence pendant 10 min et la détection en utilisant un détecteur à chimiluminescence. Utilisez le réglage sur le détecteur automatique de l'exposition.
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Representative Results
Cellules M17 et HeLa cultivées ont été récoltées en utilisant la méthode détaillée dans le (Cell récolte 3.) protocole et les tissus de la moelle épinière de souris a été obtenu. L'/ tissu de la moelle épinière culot cellulaire a été placé dans un tube avec le tampon de lyse décrit dans la section de préparation des réactifs. Les culots cellulaires ont été lysés en utilisant des billes de verre (Figure 1A) et des échantillons de tissus de moelle épinière de souris ont été homogénéisées en utilisant un homogénéisateur (figure 1B). Après la lyse ou l'homogénéisation, l'échantillon a été ensuite centrifugé à 5030 x g pour éliminer les billes de verre et / ou des membranes intactes et des organites (figure 2). Ces deux méthodes sont des moyens mécaniques de lyse pour préserver une activité enzymatique. La concentration en protéine des cellules a alors été déterminée en utilisant la méthode BCA. 20 ug de protéine totale ont été incubés avec 2 pi de sonde de 1,35 uM pendant 1 heure à 37 ° C (Figure 3). Les échantillons ont ensuite été incubées dans Laemmli 4x deun tampon d'échantillon à 95 ° C pour arrêter la réaction. Les échantillons préparés ont été chargés sur un gel de tris-glycine 4-20% et tournent à 95 V jusqu'à ce que le front d'ions atteint le fond. Les protéines ont été transférés pendant une nuit sur une membrane de PVDF. Le chargement des protéines a été vérifiée à l'aide de la tache noire amido (figure 4). Cette étape de contrôle veille à ce que les différences dans l'activité sont dues à des processus cellulaires réels et non inégal charge de protéine. Des quantités égales de protéines ont été utilisés dans la première expérience (figure 4A). Dans la deuxième expérience, des quantités inégales de protéines ont été chargés en raison des différences attendues dans les profils d'activité des différentes lignées cellulaires (figure 4B). Cela a été fait pour assurer la détection d'un profil d'activité pour les lysats cellulaires M17 incubées avec N -ethylmaleimide (NEM), qui est un inhibiteur de la cystéine et devrait conduire à un signal réduit sur le western blot. Les membranes ont été incubées dans un anticorps anti-HA primaire, un h de la sourisorseradish peroxydase et ensuite détecté en utilisant l'imagerie à chimiluminescence (figure 5). Marquage des DUBs réussie en utilisant les résultats des sondes dans un profil dans chaque voie de la membrane (Figure 5A, C). L'intensité des bandes de poids moléculaires différents correspondant au niveau de l'enzyme de DUB activité. Les différences dans les niveaux de différents DUBs travers des lignées cellulaires d'activité se manifestent lorsque des protéines similaires tels que UCHL1 sont comparées dans les cellules HeLa et M17 (Figure 5). La visualisation chimioluminescente du gel est critique, car contrairement à la amido tache noire, qui montre la quantité de protéine chargée, ce qui montre la quantité de protéine active qui a réagi avec les sondes. L'image la lumière des standards de poids moléculaire (figure 5B) sert de guide pour identifier les différents DUBs. La masse de la sonde doit être ajouté à la taille de la protéine au cours de l'analyse des résultats de caractériser le DUB s au poids moléculaires correctes.
Figure 1:. Modes de lyse de cellules et de tissus Image montrant la lyse des cellules en utilisant des billes de verre dans (A) par rapport au polytron dans lyse (B).
Figure 2: la centrifugation des produits de cellules et de tissus lysat cellulaire montrant les perles de verre et sédentaires membranes intactes et des organites au fond après la lyse et centrifugation dans (A).. lysat tissulaire montrant les membranes et les organites intacts au fond après homogénéisation et centrifugation en (B).
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Figure 3:.. Mécanisme pour le marquage des DUBs Un schéma montrant la liaison covalente entre le résidu cystéine site actif et le groupe fonctionnel de la HA-Ub-VS S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Amido taches noires des membranes des membranes montrant la coloration noir amido fait sur des lysats incubées avec N -ethylmaleimide (NEM), étiqueté avec HA-Ub-vinylsulfone (VS) et de fonctionner sur un western blot.. Les échantillons sont, de gauche à droite - (A) HeLa - NEM, HeLa + NEM; (B) M. normes, M17 -. NEM, M17 + NEM S'il vous plaît CLICk ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5: des transferts de Western résultats membranes montrant les niveaux des différents DUBs d'activité tel que déterminé par sondage pour les anti-HA.. Les échantillons sont, de gauche à droite - (A) HeLa - NEM, HeLa + NEM; (B) Monsieur normes; (C) M17 -. NEM, M17 + NEM S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Depuis ubiquitination est une activité cellulaire fondamental, la compréhension des mécanismes de régulation pourrait être la clé pour déterrer les processus de la maladie et de la pathologie. L'utilisation de HA marqué sites dirigé sondes actives Ub dérivés rapportés ici fournit une méthode simple, mais très applicable pour l'étude de la dégradation des protéines Ub-médiation. Cette méthode est plus rapide et moins coûteux que d'étudier chacun des DUBs individuellement.
Dans ce procédé, la lyse des cellules est réalisée par des moyens mécaniques - en utilisant des billes de verre. Cette méthode douce de lyse conserve une image intracellulaire métabolique. Cependant, un inconvénient majeur de cette méthode de la lyse est sa faible efficacité d'environ 60 à 70%. Cela signifie beaucoup de cellules sont nécessaires pour assurer lysats sont suffisamment concentrés pour des expériences. flacons T75 avec 80 - 90% des couches de cellules confluentes doivent être utilisés pour produire un lysat concentré. En outre, l'étape de traitement à la trypsine de l'expérience est critiqueparce que la plupart des cellules attachées doivent être suspendues dans la solution. Vérifiez le ballon sous un microscope pour faire en sorte qu'une partie importante des cellules en culture sont flottait avant de les transférer sur le tube de 50 ml. Le non-trypsiniser correctement cellules adhérentes se traduira par une pastille plus petite et moins par extension lysat à une concentration inférieure. Lysats qui ne sont pas en cours d'utilisation doivent être conservés à -80 ° C, transféré à -20 ° C 24 heures avant l'utilisation et décongelés sur de la glace le jour de l'utilisation. Cela permet au lysat décongeler uniformément et réduit les dommages aux enzymes de décongélation rapide.
Pour appliquer cette méthode aux tissus soit un dounce ou homogénéisateur Polytron peuvent être utilisés à la place des perles de verre 11. Le lysat peut être obtenue avec les sondes marquées immédiatement ou stockée pour une utilisation à -80 ° C. Si le Dounce ou polytron est utilisé pour obtenir le lysat puis des billes de verre ne doivent pas être utilisés. Cela conduit à une réduction de la concentration totale en protéines du lysat. UNElternatively, en utilisant des procédés de culture de cellules primaires les échantillons de tissus solides pourrait être cultivées d'abord et ensuite lysées avec des billes de verre.
Une limitation majeure de cette méthode est que, même si elle permet à l'utilisateur de visualiser l'activité des enzymes, il ne donne pas d'informations précises sur les profils d'expression des DUBs individuels. Cette méthode utilise homologie fonctionnelle dans les enzymes pas d'homologie structurale. Par conséquent, d'autres expériences avec les différents anticorps devra être fait pour expliquer que la réduction de l'activité est une conséquence de défauts dans le site actif ou une perte réelle de l'enzyme. En outre, la méthode de lyse utilisée dans le présent protocole ne rompt pas ouvert les noyaux des cellules. DUBs dans le noyau pourraient fournir des informations critique sur des processus de la maladie.
Néanmoins, cette méthode est unique dans sa capacité à fournir de l'information qui ne peut être obtenu à partir d'une autre source. Les deux ARN méthods et l'utilisation d'anticorps individuelles ne fournissent pas des informations fonctionnelles sur les enzymes. Dans l'avenir, le potentiel existe pour l'application de cette méthode pour immunohistochimique (IHC) coloration. IHC coloration ne sera pas seulement donner des informations sur l'activité des enzymes, mais il sera également fournir des indications sur la localisation dans les tissus où les différents DUBs sont actifs. En outre, ce procédé pourrait être couplé avec une technique de fractionnement sous-cellulaire tel que celui détaillé par Colla et al. En 2012 pour étudier l'activité des DUBs organelles liées à la membrane 12. Bien que ce soit une technique relativement nouvelle en biologie moléculaire, il ya un énorme potentiel pour élargir les applications. En utilisant des sondes moléculaires actifs du site dirigée pourrait détenir la clé de l'élucidation de l'étiologie de nombreuses maladies.
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Disclosures
Les auteurs ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier le laboratoire Lee de l'Université du Minnesota pour fournir les échantillons de tissus de la moelle épinière de souris qui ont été utilisés. Ce travail a été soutenu par le ministère de la Défense Programme Cancer de l'ovaire de la recherche (OCRP) de OC093424 à MB, par le Fonds communautaire de recherche et cancer Randy Shaver MB et par le Minnesota Cancer de l'ovaire Alliance (MOCA) à MB. Les bailleurs de fonds ne jouaient aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier ou de la préparation du manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PowerGen 125 (homogenizer) | Fischer Scientific | 14-261-02P | |
| Vacuum-driven filters 0.22 µm | BPV2210 | ||
| Glass beads, acid washed ≤106 µm (~140 U.S. sieve) | Sigma-aldrich | G4649-10G | |
| Sucrose | Fischer Scientific | S6-212 | |
| DL-dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11965-092 | |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 10010-023 | |
| Tissue culture flask 75 cm2 w/ filter cup 250 ml 120/cs | Cellstar | T-3001-2 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| HI FBS | Life Technologies | 16140-071 | |
| Monoclonal anti-HA antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | H9658 | |
| Ubiquitin vinyl sulfone (HA-tag) | Enzo Life Sciences | BML-UW0155-0025 | |
| Laemmli's SDS-Sample Buffer (4x, reducing) | Boston BioProducts | BP-110R | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 |
References
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