Summary
현재 프로토콜은 기능적 상동 deubiquitinating 효소의 활성을 측정하는 방법을 자세히 설명. 전문화 된 프로브에 공유 효소를 검출하고 수정할 수 있도록. 이 방법은 새로운 치료 표적을 식별하는 잠재력을 보유하고있다.
Abstract
유비퀴틴 - 프로 테아 좀 시스템은 최근 신경 변성 질환 및 암을 비롯한 다양한 병리에 관여한다. 이러한 관점에서,이 시스템의 조절 메커니즘을 연구하는 기술은 전술 한 질환의 세포 및 분자 적 프로세스를 해명에 필수적이다. 이 논문에 설명 된 적혈구 응집소 유래 유비퀴틴 프로브의 사용은이 시스템의 연구를위한 유용한 도구로서 기능한다. 이 논문은 효소 활성을 deubiquitinating의 직접적인 시각화를 제공 분석을 수행 할 수 있도록 해주는 방법을 자세히 설명합니다. Deubiquitinating 효소는 프로 테오 열화를 제어하고, 사용자가 하나의 분석에서 여러 효소의 활성을 조사 할 수 있도록 자신의 활성 부위에서 기능적 유사성을 공유한다. 해물을 부드러운 기계 세포 파괴를 통해 얻은 액티브 사이트 감독 프로브와 함께 배양한다. 비활성 효소가 결합되지 않은 유지하면서 기능 효소는 프로브와 태그. 실행으로닝이 분석에서, 사용자는 활성 및 빠르고 손쉽게 방식으로 여러 deubiquitinating 전위 효소 발현 모두에 대한 정보를 획득한다. 현재의 방법은 인간 세포에서 예측 백 deubiquitinating 효소 개별 항체를 사용하는 것보다 훨씬 더 효율적이다.
Introduction
유비퀴틴 - 프로 테아 좀 시스템 (UPS)은 포유 동물 세포에서 주요 분해 경로의 하나로서 역할을한다. 프로 테아 좀 저하 행 기판을 공유 유비퀴틴 (UB) 1 중합체와 태그. 타겟 기판 분해 테아로 들어가기 전에, 폴리 - 유비퀴틴 태그는 제거되어야한다. 효소 (더빙) deubiquitinating 알려진 효소 클래스 유비퀴틴 분자 (2)의 제거 및 재활용 할 책임이있다. 이는 셀 3의 백 작업 거의 더빙이 있다는 인간 게놈으로부터 예측되어왔다. UB-매개 세포 과정을 조절 움직여 같은 많은 수의,이 효소를 공부에만 발현 수준에 대한 정보를 제공 mRNA의 기술 활동 및 서부 블로 팅에 대한 정보를 제공하지 않기 때문에 문제를 제시한다.
인플루엔자 헤 마글 루티 닌 (HA)의 사용은 공유 개조를 허용 활성 부위 지향 프로브 UB 유래, 태그기능 더빙 따라서의 형 치수는 웨스턴 블롯 4에이 효소의 활동의 직접적인 시각화를 제공합니다. 프로브는 활성 부위 시스테인 잔기 5 자살 기질로서 작용 C 말단 티올 반응성기를 갖는다. 이러한 프로브, 상기 셀의 양쪽 병리 생리 학적 상태에 따라 다수의 더빙의 활성 및 발현 가능성을 연구 할 수있다.
DUB 활성의 변화는 파킨슨, 알츠하이머, 빈혈 및 각종 암 6-10 같은 병리 적 상태의 범위에 연루되어왔다. 이 기술은 질병의 연구를위한 강력한 도구를 제공합니다. 본 논문에서는 유리 비드를 사용하여 용해 된 헬라 세포 및 M17에서이 기술의 애플리케이션을 도시한다. 또한, 우리는 마우스 척수 조직 샘플에서이 방법을 사용하는 방법을 설명합니다. 이 방법에서 얻은 정보를 식별하기위한 출발점으로 사용될 수있다치료 대상뿐만 아니라 다른 질병 상태의 연구를위한 모델을 확립. 이 기술의 진정한 유틸리티는 단일 분석에서 여러 더빙에 대한 정보를 제공 할 수있는 능력에있다.
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Protocol
1. 용해 버퍼 준비
- 2 M 원액을 만들기 위해 탈 (DI) 물에 설탕을 녹인다. 0.22 ㎛의 폴리 불화 비닐 리덴 (PVDF) 필터를 구동 진공을 사용하여 수크로오스 2 M 용액 필터.
- 혐기성 조건에서 500 mM의 스톡 용액을 저장하기 위해 DI 물에 디티 오 트레이 톨 (DTT)을 녹인다. 100 mM의 스톡 용액을 제조하기 위해 DI 물에 염화 마그네슘 (의 MgCl 2)을 녹인다. 50 mM의 스톡 용액을 제조하기 위해 DI 물에 아데노신 삼인산 (ATP) 나트륨 수화물을 녹인다.
- DI 물에 후, Trizma 염산염을 용해시키고 수산화 나트륨 (NaOH)을 이용하여 pH를 조정하여 pH를 7.4 트리스 용액을 구성한다.
- 250 mm의 1mm를 5mm의의 MgCl 2 농도 1mM이 ATP 농도 및 50 mm의 트리스 농도 DTT 농도의 슈 크로스 농도의 용해 완충액을 만들기 위해 DI 물에 원액의 일부를 겸용 . 예를 들어, 트리스, 50 μL를 혼합 535.30의 MgCl 2 μL, 1.25 수크로오스 ㎖, 20 μL의 DTT, ATP 200 μL 및 DI 물 7.4947 ml의 용해 완충액 10 mL로한다. 이것은 약 20 실험에 사용될 수있다.
실험 2. 배양 세포
- DMEM + 10 %, 50㎖ 태아 소 혈청 (FBS) 원추형 튜브의 30 ㎖를 분취하여 미디어를 확인.
- 미지근한 물을 작은 비커에 액체 질소 저장에서 냉동 M17이나 헬라 세포를 전송합니다.
- 50 ML 원뿔 튜브에 세포를 전송합니다. 첫째, 세포 바이알에 일부 미디어를 추가합니다. 그리고 해동 5 초 이내에 재현 탁 세포를 전송합니다.
- 세포 펠렛을 얻기 위해 5 분 동안 450 XG에 세포 현탁액을 원심 분리기. T75 플라스크에 매체의 20 ML을 추가합니다.
- 흡입을 사용하여 세포에서 용지를 제거합니다. 세포 펠렛 및 재현 탁에 신선한 매체의 5 ML을 추가합니다.
- T75 플라스크에 미디어의 20 ㎖에 5 ml의 세포 현탁액을 전송하고 37 ° C에서 품어. 채널3 일마다 미디어를 앙.
3. 셀 수확
- 세포를 만지지 않도록 조심하면서, 흡입을 통해 용지를 제거합니다.
- 인산염 완충 생리 식염수 5 ㎖ (PBS)와 세포를 씻으십시오. 흡입을 사용하여 PBS를 제거합니다.
- T75 플라스크에 트립신 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 3 ㎖를 추가하고 3 분 동안 37 ℃에서 배양한다.
- 플라스크에 신선한 미디어 6 ML을 추가하고 세포를 재현 탁.
- 5 분 동안 290 × g에서 15 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기에 현탁액을 전송합니다.
- 상층 액을 제거하고 PBS 5 mL를 추가 할 수 있습니다. 조심스럽게 펠렛을 분쇄하기 위해 튜브의 바닥을 누릅니다. 5 분 동안 290 XG에 원심 분리기.
- 단계를 반복 3.6 세 번.
- PBS를 제거하고 신선한 PBS 1 ㎖로 세포를 재현 탁. 에펜 도르프 튜브 (1.5 ㎖)에 전송합니다. 5 분 동안 290 XG 스핀.
4. 세포 용해
- 피펫을 사용하여 펠릿의 대략적인 체적을 측정1 부피비 : 질량에 유리 비드를 달아 (D1). 용해 완충액의 펠릿 두번 볼륨.
참고 : 유리 구슬을 추가하기 전에 버퍼를 추가합니다. - 를 Lyse 냉장실의 텍싱하여 4 ° C에서 30 분 동안 교반 최대의 에펜 도르프 튜브에 세포.
- 200 XG 30 초 원심 분리기 짧게 구슬을 해결합니다. 상층 액을 수집합니다.
- 상층 액에 이전과 유리 구슬의 동일한 볼륨을 추가합니다.
- 다시 한번 최대 교반에서 4 ℃에서 30 분 동안 소용돌이.
- 200 XG 30 초 원심 분리기 짧게는 유리 구슬을 해결합니다. 상층 액을 수집합니다.
- 5 분 5,030 XG에 원심 분리기는 핵, 세포막 손상되지 않은 세포를 제거합니다. 세포 용 해물 인 상층 액을 수집합니다.
5. 조직의 균질화
- 용해 버퍼에 마우스 척수 조직의 9 해결책 : 1의 부피 : 질량을 확인합니다.
참고 :이 방법은 다른 다양한에 적용 할 수있다ENT 조직 샘플. - 남아있는 청크가 없다는 것을 보장하기 위해 30 초 동안 균질 기에서 2 레벨의 설정을 사용하여 조직을 균질화.
- 핵, 세포막 손상되지 않은 세포를 제거하기 위해 3 분 동안 5,030 XG에 스핀 다운.
- 해물 인 상층 액을 수집합니다.
6. 샘플 유도체 화
- 피어스 BCA 단백질 분석 키트 프로토콜에 의해 지정된대로 비색 96- 웰 플레이트 판독기를 사용하여 조직 파쇄 액의 단백질 농도를 결정하기 위해 96 웰 플레이트 분석 bicinchoninic 산 (BCA)을 수행한다.
- 탈 이온화 (DI) 물을 사용하여 50 μL에 총 단백질의 20 μg의에 해당하는 나누어지는 가져와.
- 솔루션 HA-UB-비닐 설폰 (VS)의 1.35 μm의 2 μl를 추가하고 37 ℃에서 1 시간 동안 배양한다. 이것은 최종 반응 혼합물에 프로브를 50 nm의 용 해물 20 μg의 결과. 이 더빙 기능들의 태깅을 위해 큰 몰 과량이다.
- 나는95 ° C에서 5 분간의 램 믈리 시료 완충액에서 샘플 ncubate. 52 ㎕의 반응 부피로 사용 배 샘플 완충액 26 μL, 4X 샘플 완충액 13 μL 또는 6X 샘플 완충액 8.87 μL를 들어.
- 젤을로드하기 전에 얼음 쿨.
7. 서쪽 오점
- 준비된 샘플의 40 μL와 12 웰 4-20% 트리스 - 글리신 젤로드
- 이온 전면이 바닥에 도달 할 때까지 95 V에서 젤을 실행합니다.
- 폴리 비닐 리덴 디 플루오 라이드 (PVDF) 멤브레인 상에 겔의 하룻밤 전송을 수행합니다.
- 아미 검은 얼룩의 막을 인큐베이션하고 각 레인에있는 단백질의 양을 보여주는 화상을 얻을 membane 스캔.
- 막 Destain 및 차단하는 1 시간 동안 PBS에 5 % 우유에 품어.
- 1의 농도 차 항 HA 항체에 막을 인큐베이션 : 어느 밤새 4 ℃에서 또는 실온에서 4 시간 동안 PBS에서 10,000 5 % 우유.
- f를 3 세척을 수행0.1 % 트윈 20 세제와 PBS에 5 분마다.
- 1의 농도로 마우스 고추 냉이 퍼 옥시 다제에 막을 인큐베이션 : PBS 10,000 5 % 우유를 적어도 2 시간 동안.
- 0.1 % 트윈 20 세제와 PBS에 5 분마다 3 세척을 수행합니다.
- PBS에서 5 분 동안 1 세척을 수행합니다.
- 10 분 동안 화학 발광 검출 시약에서 부화 막과 화학 발광 검출기를 이용하여 검출한다. 검출기에 자동 노출 설정을 사용합니다.
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Representative Results
배양 된 M17과 헬라 세포는 프로토콜 (3 셀 수확)에 자세히 방법 및 마우스 척수 조직을 얻었다을 사용하여 수확했다. 세포 펠렛 / 척수 조직은 시약 제조 섹션에 기재된 용해 완충액으로 튜브에 넣었다. 세포 펠릿을 균질화 (도 1b)를 이용하여 균질화시켰다 유리 비드 (도 1a) 및 마우스 척수 조직 샘플을 사용하여 용해시켰다. 용해 또는 균질화 한 후, 샘플을 유리 비드 및 / 또는 막 파손되지 소기관 및 (도 2)를 제거하기 위해 5030 XG에서 원심 분리 하였다. 이들 방법은 모두 효소 활성을 유지하기 용해의 기계적인 수단이다. 세포의 단백질 농도는 BCA 방법을 사용하여 측정 하였다. 총 단백질의 20 μg의 37 ° C (그림 3)에서 1 시간 동안 1.35 μm의 프로브의 2 μL와 함께 배양 하였다. 샘플은 다음의 4X 램리 배양 하였다95 ° C에서 샘플 버퍼는 반응을 종결. 준비된 시료는 4-20 %의 트리스 - 글리신 겔에서 로딩 이온 전면 하단에 도달 할 때까지 95 V에서 작동시켰다. 단백질을 PVDF 막에 밤새 옮겼다. 단백질 로딩 아미 검은 얼룩 (그림 4)를 사용하여 조사 하였다. 이 컨트롤 단계는 활동의 차이가 실제 세포 과정이 아니라 불평등 한 단백질 로딩에 기인 것을 보장한다. 동일 양의 단백질은 첫 번째 실험 (도 4a)에 사용 하였다. 두 번째 실험에서, 불평등 한 단백질의 양이 다른 세포 라인 (그림 4B)의 활성 프로파일에서 예상되는 차이로 인해로드되었다. 이것을 시스테인 억제제 및 웨스턴 블롯에 감소 된 신호로 연결되어야 N의 -ethylmaleimide (NEM)와 함께 배양 M17 세포 용 해물에 대한 활성 프로파일의 검출을 보장하기 위해 이루어졌다. 막은 항 HA 차 항체로 배양하고, 마우스 Horseradish 퍼 옥시 다제하고 화학 발광 영상 (그림 5)를 이용하여 검출. 막 (도 5A, C)의 각각의 레인 프로필 프로브 결과를 이용하여 더빙을 성공적 태그. 상이한 분자량의 밴드의 강도 DUB 효소의 활동 레벨에 대응한다. 같은 UCHL1와 유사한 단백질 헬라와 M17 세포 (그림 5)에서 비교 될 때 세포 라인에 걸쳐 다양한 더빙의 활동 수준의 차이는 분명하게. 로드 된 단백질의 양을 나타낸다 아미 검은 얼룩 달리,이 프로브와 반응했다 활성 단백질의 양을 표시하기 때문에 겔의 화학 발광 시각화가 중요하다. 분자량 표준의 광 화상 (도 5b)은 다양한 더빙을 식별하기위한 가이드로서 기능한다. 프로브의 질량은 DUB을 특성화 결과의 분석 중에 단백질의 크기에 추가해야 정확한 분자량에서의.
그림 1. 세포 및 조직에 대한 용해 방법 그림 (B)에서 폴리 트론 용해 대 (A)의 유리 비드를 이용하여 세포 용해를 도시.
그림 2 :. ()에 용해 및 원심 분리 한 후 바닥에 침전 된 유리 구슬과 끊어지지 세포막 및 세포 기관을 나타내는 세포와 조직 세포 용 해물의 원심 분리 제품. 의 균질화 및 원심 분리 후 하단 (B)에서 깨지지 세포막과 세포 기관을 게재하는 조직 해물.
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그림 3 :.. 더빙의 태그에 대한 메커니즘 활성 사이트 시스테인 잔기와 HA-UB-VS의 기능 그룹 사이의 공유 결합을 보여주는 개략적 인 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 세포막의 아미 검은 얼룩 HA-UB-비닐 설폰 (VS) 태그 N 개의 -ethylmaleimide (NEM)와 함께 배양 해물에서 수행 아미 검은 염색을 보여주는 막과 웨스턴 블롯에서 실행됩니다.. (A) 헬라 - - 좌에서 우로 다음 샘플은 NEM, 헬라 NEM +; (B) 씨 기준, M17 -. NEM, M17 + NEM은 CLIC하세요이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 케이.
도 5 : 웨스턴 블롯 결과 안티 HA 프로빙에 의해 결정되는 다양한 더빙의 활동 수준을 나타내는 멤브레인.. (A) 헬라 - - 좌에서 우로 다음 샘플은 NEM, 헬라 NEM +; (B) 씨 표준; (C) M17 -. NEM, M17 + NEM은 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
유비퀴틴은 기본적인 셀룰러 활성이기 때문에, 규제 메커니즘을 이해하는 것이 질병의 병리 과정을 발굴하는 키가 될 수있다. HA의 사용은 여기에보고 UB 유래 활성 부위 감독 프로브는 UB-매개 단백질 분해 연구를위한 쉬운,하지만 매우 적용 할 수있는 방법을 제공하는 태그. 이 방법은 신속하고 저렴 개별적 더빙 각각 공부보다 길다.
유리 비드를 사용하는 -이 방법에서, 세포의 용해는 기계적 수단을 통해 달성된다. 용해의이 부드러운 방법은 신진 대사 세포 내 사진을 유지합니다. 그러나,이 균법의 주요 단점은 60-70 %로 낮은 효율이다. 이것은 세포 용 해물은 많은 실험을 충분히 농축 보장하기 위해 요구되는 것을 의미한다. 80 T75 플라스크 - 90 % 융합 성 세포 층을 농축 분해물을 생산하는 데 사용한다. 또한, 실험의 트립신 처리 공정이 중요부착 된 세포의 대부분은 용액에 현탁되어야하기 때문이다. 문화에 세포의 상당 부분이 50 ㎖ 튜브에 전송하기 전에 떠 있는지 확인하기 위해 현미경으로 플라스크를 확인합니다. 제대로 부착 세포를 Trypsinize 않으면 작은 펠릿과 낮은 농도에서 확장 적은 해물에 의해 발생합니다. 사용하지 않는 해물을 사용하기 전에 -20 ° C ~ 24 시간에 전송 및 얼음에 사용의 하루 해동, -80 ° C에서 보관해야합니다. 이 해물이 골고루 해동 할 수 있으며 빠른 해동에서 효소의 손상을 줄일 수 있습니다.
다운스 또는 폴리 트론 균질화 하나에 유리 비드 (11) 대신에 사용될 수있는 조직에이 방법을 적용한다. 얻어진 분해물은 즉시 프로브 태그 또는 -80 ° C에서의 사용을 위해 저장 될 수있다. 다운스 또는 폴리 트론이어서 용 해물을 얻기 위해 사용되는 경우, 유리 비드를 사용해서는 안된다. 이 파쇄물의 총 단백질 농도의 감소를 이끈다.lternatively 일차 세포 배양 방법을 사용하여 고체 조직 샘플은 첫번째 배양 후, 유리 비드와 함께 용해 될 수있다.
이 방법의 중요한 한계는 사용자가 효소의 활성을 시각화 할 수 있더라도, 그 개별 더빙의 발현 패턴에 대한 정확한 정보를 제공하지 않는다는 것이다. 이 방법은 효소에 상 동성이없는 구조적 기능적 유사성을 이용한다. 따라서, 개개의 항체는 추가 실험 활성 감소는 활성 부위 또는 효소의 실제 손실 결함의 결과인지 여부를 설명하기 위해 수행되어야 할 것이다. 또한,이 프로토콜에서 사용되는 용해 방법은 세포의 핵이 파손되지 않는다. 핵의 더빙 질병 과정에 대한 자세한 중요한 정보를 제공 할 수있다.
그러나이 방법은 임의의 다른 소스로부터 얻을 수없는 정보를 제공하는 능력에 고유하다. 두 RNA 운전 방식DS 개별 항체의 사용은 효소 기능에 대한 정보를 제공하지 않는다. 앞으로의 가능성은 면역 조직 화학 (IHC) 염색이 방법의 응용 프로그램이 존재합니다. IHC 염색은 효소의 활동에 대한 정보를 제공하지는 않지만 다양한 더빙이 활성 여기서 또한 조직 위치에 대한 통찰력을 제공 할 것이다. 또한,이 방법은 코라 동부 등에 의해 상술 한 바와 같이 세포 내 분획 방식으로 결합 될 수있다. 2012 년에 막 결합 소기관 12 더빙의 활성을 연구하기 위해. 이 분자 생물학에서 비교적 새로운 기술이지만, 응용 프로그램을 확장 할 수있는 거대한 잠재력이있다. 활성 부위 감독 분자 프로브를 사용하면 많은 질병의 원인을 해명하는 열쇠를 쥐고 있습니다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
우리는 사용 된 마우스 척수 조직 샘플을 제공하기 위해 미네소타 대학의 리 실험실에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 MB의 랜디 면도기 암 연구 및 지역 사회 기금과 미네소타 난소 암 연맹 (MOCA)이 MB의에 의해, 국방 난소 암 연구 프로그램 (OCRP) MB의 OC093424의 부서에 의해 지원되었다. 자금 제공자는 연구 설계, 자료 수집 및 분석, 게시하는 결정 또는 원고의 준비를 전혀 역할을 없었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PowerGen 125 (homogenizer) | Fischer Scientific | 14-261-02P | |
| Vacuum-driven filters 0.22 µm | BPV2210 | ||
| Glass beads, acid washed ≤106 µm (~140 U.S. sieve) | Sigma-aldrich | G4649-10G | |
| Sucrose | Fischer Scientific | S6-212 | |
| DL-dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11965-092 | |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 10010-023 | |
| Tissue culture flask 75 cm2 w/ filter cup 250 ml 120/cs | Cellstar | T-3001-2 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| HI FBS | Life Technologies | 16140-071 | |
| Monoclonal anti-HA antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | H9658 | |
| Ubiquitin vinyl sulfone (HA-tag) | Enzo Life Sciences | BML-UW0155-0025 | |
| Laemmli's SDS-Sample Buffer (4x, reducing) | Boston BioProducts | BP-110R | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 |
References
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