Summary
O protocolo atual detalha um método para medir a atividade das enzimas funcionalmente homóloga deubiquitinating. Sondas especializados modificar covalentemente o enzima e permitir a detecção. Este método tem o potencial para identificar novos alvos terapêuticos.
Abstract
O sistema ubiquitina-proteassoma tem sido recentemente implicado em diversas patologias, incluindo as doenças neurodegenerativas e cancro. À luz disto, técnicas para estudar o mecanismo de regulação deste sistema são essenciais para elucidar os processos celulares e moleculares das doenças acima mencionadas. A utilização de sondas derivado de hemaglutinina ubiquitina descritos neste documento serve como uma ferramenta valiosa para o estudo deste sistema. Este artigo detalha um método que permite ao usuário realizar ensaios que dão uma visualização direta do deubiquitinating atividade enzimática. Deubiquitinating controlar a degradação proteossómica e compartilhar homologia funcional em seus sítios ativos, o que permite ao usuário investigar a atividade de várias enzimas em um ensaio. Lysates são obtidos através de suave rompimento celular mecânica e incubadas com o site ativo sondas dirigidas. Enzimas funcionais são marcados com as sondas enquanto enzimas inativos permanecem não ligados. Por prazoNing este ensaio, o utilizador obtém informações sobre a actividade, tanto a expressão e potencial de várias enzimas deubiquitinating de uma maneira fácil e rápida. O método actual é significativamente mais eficiente do que a utilização de anticorpos específicos para os preditos cem enzimas deubiquitinating na célula humana.
Introduction
O sistema ubiquitina-proteassoma (UPS) serve como uma das principais vias de degradação na célula de mamífero. Substratos ligados à degradação no proteassoma são covalentemente marcados com polímeros de ubiquitina (Ub) 1. Antes do substrato alvo entra no proteassoma para a degradação, a etiqueta de poli-ubiquitina deve ser removido. Uma classe de enzimas conhecidas como deubiquitinating enzimas (Dubs) é responsável pela remoção e reciclagem de moléculas de ubiquitina 2. Prevê-se a partir do genoma humano que há quase uma centena de dobragens de trabalho na célula 3. Com um grande número de dubs que controlam processos celulares Ub mediadas tal, estudando estas enzimas apresenta um desafio desde técnicas de mRNA não dão informação sobre a actividade e transferência de western só dá informações sobre os níveis de expressão.
A utilização da gripe hemaglutinina (HA) com etiquetas, Ub-derivado local dirigida sondas activas permite uma modificação covalenteficação das dobragens funcionais e, por conseguinte, dá uma visualização directa da actividade destas enzimas sobre um western blot 4. As sondas têm um grupo reactivo tiol C-terminal que serve como um substrato para o suicídio resíduo cisteína local activo 5. Com estas sondas, é possível estudar a expressão e a actividade potencial de muitos dobragens em ambos os estados patológicos e fisiológicos da célula.
Alterações na actividade DUB têm sido implicados numa variedade de condições patológicas tais como doença de Parkinson, doença de Alzheimer, anemia e vários cancros 6-10. Esta técnica fornece uma ferramenta poderosa para o estudo da doença. No presente trabalho, mostramos a aplicação desta técnica em células HeLa e M17 que foram ligado usando esferas de vidro. Além disso, destacamos como usar esse método em amostras de tecido de rato medula espinhal. A informação obtida a partir desta técnica pode ser usada como um ponto de partida para a identificaçãoalvos terapêuticos, bem como o estabelecimento de modelos para o estudo de diferentes condições de doença. A verdadeira utilidade desta técnica reside na sua capacidade de fornecer informações sobre vários Dubs em um único ensaio.
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Protocol
1. Preparação de tampão de lise
- Dissolve-se a sacarose em água desionizada (Dl) para produzir uma solução stock a 2 M. Filtro de uma solução 2 M de sacarose utilizando um aspirador accionado 0,22 um fluoreto de polivinilideno (PVDF) de filtro.
- Dissolve-se ditiotreitol (DTT) em água desionizada para produzir uma solução stock de 500 mM e armazenar sob condições anaeróbias. Dissolve-se cloreto de magnésio (MgCl2) em água desionizada para produzir uma solução stock de 100 mM. Dissolve-se trifosfato de adenosina (ATP), hidrato de dissódio em água desionizada para produzir uma solução stock de 50 mM.
- Adicione-se uma solução de Tris a pH 7,4 através da dissolução de cloridrato de Trizma em água desionizada e ajustando o pH com hidróxido de sódio (NaOH).
- Combinar porções das soluções de reserva em água Dl para fazer um tampão de lise com uma concentração de sacarose de 250 mM, uma concentração de 1 mM de DTT, uma concentração de MgCl2 5 mM, uma concentração de ATP de 1 mM e uma concentração de 50 mM Tris . Por exemplo, misturar 535,3 ul de Tris, 500 ul de MgCl2, 1,25 mL de sacarose, 20 l de DTT, 200 ul de ATP e 7,4947 ml de água desionizada para tornar 10 ml de tampão de lise. Isto pode ser utilizado para cerca de 20 experiências.
2. Células de cultura para o experimento
- Adicione meios de alíquotas de 30 ml de DMEM + 10% de soro fetal de bovino (FBS) para um tubo de 50 ml.
- Transferência de células HeLa M17 ou congelados de armazenamento de nitrogênio líquido para um pequeno copo com água morna.
- Transferir as células para o tubo de 50 ml. Primeiro, adicione alguns meios de comunicação para o frasco de celular. Em seguida, transferir as células ressuspensas dentro de 5 segundos de descongelamento.
- Centrifugar a suspensão de células a 450 xg durante 5 minutos para se obter uma pelete de células. Adicionar 20 ml de mídia em um frasco T75.
- Remova a mídia a partir das células usando sucção. Adicionar 5 ml de meio fresco para a pelete de células e ressuspender.
- Transferir a suspensão de 5 ml de células para 20 ml de meio no frasco T75 e incubar a 37 ° C. Change os meios de comunicação a cada 3 dias.
Colheita 3. celular
- Remova a mídia através de sucção, tendo o cuidado de não tocar nas células.
- Lavam-se as células com 5 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Remover PBS utilizando sucção.
- Adicionar 3 ml de tripsina-ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) para o frasco T75 e incubar a 37 ° C durante 3 min.
- Adicionar 6 ml de meio fresco ao frasco e voltar a suspender as células.
- Transferir a suspensão para um tubo de 15 ml e centrifugar a 290 x g durante 5 minutos.
- Remover o sobrenadante e adicionar 5 ml de PBS. Bata levemente o fundo do tubo para quebrar o sedimento. Centrifugar a 290 xg durante 5 min.
- Repita o passo 3,6 três vezes.
- Remover PBS e ressuspender as células em 1 ml de PBS fresco. Transferência para o tubo Eppendorf (1,5 ml). Gire a 290 g durante 5 min.
4. Lise Celular
- Medir o volume aproximado de o sedimento utilizando uma pipeta de umd pesam-se contas de vidro em uma massa: proporção em volume de 1: 1. Adicionar duas vezes o volume da pelota em tampão de lise.
Nota: Adicionar o tampão antes de adicionar as contas de vidro. - Lisar as células no tubo de Eppendorf, no máximo de agitação durante 30 min a 4 ° C com vortex numa sala fria.
- Centrifugar brevemente a 200 xg durante 30 seg para resolver os grânulos. Recolhe-se o sobrenadante.
- Adicionar o mesmo volume de contas de vidro como antes para o sobrenadante.
- Vortex, mais uma vez, no máximo de agitação durante 30 min a 4 ° C.
- Centrifugar brevemente a 200 xg durante 30 segundos para se estabelecer as esferas de vidro. Recolhe-se o sobrenadante.
- Centrifugar a 5.030 xg durante 5 minutos para remover os núcleos, membranas e as células intactas. Recolhe-se o sobrenadante, que é o lisado celular.
A homogeneização 5. Tissue
- Faça uma massa: volume de 1: 9 solução de rato tecido do cordão espinhal de lise.
Nota: Este método é aplicável a uma variedade de diferemamostras de tecido ENT. - Homogeneizar o tecido, utilizando uma configuração de nível 2 no homogeneizador durante 30 segundos para garantir que não existem partes restantes.
- Girar a 5030 xg durante 3 minutos para remover os núcleos, membranas e as células intactas.
- Recolhe-se o sobrenadante, que é o lisado.
6. Amostra Derivatiza�o
- Realizar um ácido bicinconínico (BCA) em uma análise de placa de 96 alvéolos para determinar a concentração de proteína de lisado de tecido usando um colorimétrico leitor de placa de 96 poços, tal como especificado pelo protocolo do kit de Ensaio de Proteína Pierce BCA.
- Trazer uma alíquota correspondente a 20 ug de proteína total de 50 ul usando (DI) de água desionizada.
- Adicionar 2 mL de 1,35 M de sulfona HA-Ub-vinil (VS) para a solução e incubar durante 1 hora a 37 ° C. Isto resulta 20 ug de lisado a 50 nM de sonda na mistura de reacção final. Isto é, em grande excesso molar para assegurar a marcação dos dubs funcionais.
- EUncubate da amostra em tampão de amostra de Laemmli para 5 min a 95 ° C. Para uma reacção de 52 ul de volume de utilização 26 ul de tampão de amostra 2x, 13 ul de tampão de amostra 4x ou 8,87 ul de tampão de amostra de 6x.
- Arrefecer em gelo antes de carregar o gel.
7. Western Blot
- Carregar um de 12 poços de 4-20% de gel de Tris-glicina com 40 ul de amostra preparada
- Submeter o gel a 95 V até a frente de íon atinge o fundo.
- Realizar uma transferência durante a noite do gel para uma membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF).
- Incubar a membrana no amido mancha preta e digitalizar o membane para obter uma imagem que mostra a quantidade de proteína em cada pista.
- Destain a membrana e incubar em 5% de leite em PBS durante 1 h para bloquear.
- Incubar a membrana em que o anticorpo anti-HA primária a uma concentração de 1: 10.000 em leite 5% em PBS, quer durante a noite a 4 ° C ou durante 4 horas à temperatura ambiente.
- Realize 3 lavagens fou 5 minutos cada em PBS com 0,1% de Tween-20 em detergente.
- Incubar a membrana de uma peroxidase de rábano rato a uma concentração de 1: 10.000 em leite 5% em PBS durante pelo menos 2 horas.
- Realizar 3 lavagens durante 5 min cada em PBS com 0,1% de Tween-20 em detergente.
- Realize uma lavagem por 5 min em PBS.
- Incubar a membrana de um reagente de detecção quimioluminescente durante 10 min e detecção utilizando um detector de quimioluminescência. Use a configuração de exposição automática no detector.
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Representative Results
As células M17 e HeLa em cultura foram colhidos usando o método detalhado na (de colheita celular 3.) protocolo e do tecido da medula espinal do rato foi obtido. O sedimento de células / tecido da medula espinal foi colocada num tubo com o tampão de lise descrito na secção de preparação do reagente. As pelotas de células foram lisadas usando pérolas de vidro (Figura 1A) e amostras de tecido de ratinho medula espinal foram homogeneizados usando o homogeneizador (Figura 1B). Após a lise ou homogeneização, a amostra foi em seguida centrifugado a 5030 xg para remover as esferas de vidro e / ou as membranas e organitos intactos (Figura 2). Ambos os métodos são meios mecânicos de lise para preservar a actividade enzimática. A concentração de proteína das células foi então determinada utilizando o método BCA. 20 ug de proteína total foram incubados com 2 ul de sonda de 1,35 ^ M durante 1 hora a 37 ° C (Figura 3). As amostras foram em seguida incubadas em 4x de Laemmlitampão de amostra a 95 ° C para extinguir a reacção. As amostras preparadas foram carregadas num gel de Tris-glicina 4-20% e correr a 95 V até a frente de ião atingiu o fundo. As proteínas foram transferidas durante a noite para uma membrana de PVDF. A carga de proteína foi verificada usando a mancha negra amido (Figura 4). Esta etapa de controlo assegura que as diferenças de actividade são devidas a processos celulares reais e carga de proteína não desigual. Quantidades iguais de proteína foram utilizados na primeira experiência (Figura 4A). No segundo experimento, as quantidades de proteína desiguais foram carregados devido às diferenças esperadas nos perfis das diferentes linhas de células (Figura 4B) de atividade. Isto foi feito para assegurar a detecção de um perfil de actividade para os lisados de células M17 incubadas com N-etilmaleimida (NEM), que é um inibidor da cisteína e deve conduzir a uma redução do sinal no western blot. As membranas foram incubadas em anticorpo anti-HA primário, um rato horseradish peroxidase e, em seguida, detectados utilizando imagiologia quimioluminescente (Figura 5). Codificação bem sucedida das dobragens utilizando as sondas resulta num perfil em cada pista da membrana (Figura 5A, C). A intensidade das bandas com diferentes pesos moleculares corresponde ao nível de actividade da enzima DUB. As diferenças nos níveis de vários Dubs através das linhas de células de atividade tornam-se evidentes quando as proteínas semelhantes, como UCHL1 são comparados nas células HeLa e M17 (Figura 5). A visualização do gel quimioluminescente é crítica porque ao contrário do amido mancha negra, que mostra a quantidade de proteína carregado, esta mostra a quantidade de proteína activa que reagiu com as sondas. A imagem luz dos padrões de peso molecular (Figura 5B) serve como guia para identificar os vários Dubs. A massa da sonda tem de ser adicionado com o tamanho da proteína durante a análise dos resultados para caracterizar o DUB s com os pesos moleculares corretas.
Figura 1:. Métodos de lise para células e tecidos de imagem que mostra a lise das células utilizando contas de vidro em (A) versus Polytron lise em (B).
Figura 2: A centrifugação os produtos de células e de tecidos lisado celular que mostram as pérolas de vidro e sedimentados membranas inteiras e organelas no fundo após a lise e centrifugação em (A).. Tissue lisado mostrando as membranas de organelos intactos e na parte inferior após a homogeneização e centrifugação em (B).
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Figura 3:.. Mecanismo de marcação de dubla um esquema que mostra a ligação covalente entre o resíduo cisteína site de ativos eo grupo funcional do HA-Ub-VS Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Amido manchas negras das membranas Membranas mostrando a coloração preta amido feito em lisados incubados com N-etilmaleimida (NEM), marcado com HA-Ub-vinilsulfona (VS) e executado em um western blot.. As amostras são os seguintes da esquerda para a direita - (A) HeLa - NEM, HeLa + NEM; (B) Senhor Standards, M17 -. NEM, M17 + NEM Por favor cliquemk aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: As membranas Western blots resultados mostram que os níveis das várias dobragens de actividade conforme determinado pela sondagem para anti-HA.. As amostras são os seguintes da esquerda para a direita - (A) HeLa - NEM, HeLa + NEM; (B) Senhor normas; (C) M17 -. NEM, M17 + NEM Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Desde ubiquitinação é uma actividade celular fundamental, a compreensão dos mecanismos de regulação poderia ser a chave para desenterrar os processos de doença e patologia. O uso de HA etiquetado local dirigida sondas ativas Ub-derivadas aqui relatados fornece um método fácil, mas altamente aplicável para estudar a degradação de proteínas mediada por Ub. Este método é mais rápido e menos dispendioso do que o estudo de cada uma das dobragens individualmente.
Neste método, a lise das células é alcançada através de meios mecânicos - utilizando as esferas de vidro. Este método suave de lise preserva uma imagem intracelular metabólica. No entanto, uma grande desvantagem deste método de lise é a sua baixa eficiência de cerca de 60-70%. Isto significa que uma grande quantidade de células são necessárias para garantir lisados são concentrados suficiente para experiências. Frascos T75 com 80 - 90% camadas celulares confluentes deve ser usada para produzir um lisado concentrada. Além disso, o passo de tripsinização da experiência é críticaporque a maioria das células ligadas deve ser suspenso na solução. Verificar o balão sob um microscópio para se certificar de que uma parte significativa das células em cultura são flutuante antes de transferir para o tubo de 50 ml. A não trypsinize adequadamente células aderentes resultará numa pelete menor e, por extensão, a menos lisado a uma concentração inferior. Os lisados que não estão a ser utilizados devem ser armazenadas a -80 ° C, transferiu-se até -20 ° C, 24 h antes da utilização e descongeladas em gelo no dia de utilização. Isto permite que o lisado para descongelar uniformemente e reduz o dano aos enzimas a partir de descongelamento rápido.
Para aplicar este método para tecidos ou um Dounce ou homogeneizador Polytron pode ser usado em lugar das pérolas de vidro 11. O lisado obtido pode ser etiquetada com sondas imediatamente ou armazenado para uso a -80 ° C. Se o Dounce ou Polytron é usado para obter o lisado em seguida, os grânulos de vidro não deve ser usado. Isto leva a uma redução na concentração total de proteína de lisado. UMAlternatively, usando métodos de cultura de células primárias das amostras de tecidos sólidos pode ser cultivado em primeiro lugar e, em seguida, lisadas com as esferas de vidro.
Um grande limitação deste método é que, embora ele permite ao utilizador visualizar a actividade das enzimas, não dá informações exactas sobre os padrões de expressão das dobragens individuais. Este método utiliza homologia funcional em não as enzimas de homologia estrutural. Portanto, as experiências com os anticorpos individuais que terá de ser feita para explicar se a redução da actividade é o resultado de defeitos no local activo ou uma perda efectiva da enzima. Além disso, o método de lise utilizado neste protocolo não quebrar os núcleos das células. Dubs no núcleo poderiam fornecer informações mais crítico sobre os processos de doença.
No entanto, este método é única em sua capacidade de fornecer informações que não podem ser obtidos a partir de qualquer outra fonte. Ambos ARN metods e a utilização de anticorpos individuais que não fornecem informação funcional sobre enzimas. No futuro, existe o potencial para a aplicação do presente método para imuno-histoquímica (IHQ) coloração. Coloração IHC não só irá dar informações sobre a atividade das enzimas, mas que também irá fornecer insights sobre a localização no tecido onde as várias Dubs estão ativos. Além disso, este método pode ser acoplado com uma técnica de fraccionamento subcelular, tal como detalhado por um Colla et al., Em 2012, para estudar a actividade das dobragens em organelos ligados membrana 12. Embora esta seja uma técnica relativamente nova na biologia molecular, existe um enorme potencial para expandir as aplicações. Usando local dirigida sondas moleculares ativos pode ser a chave para elucidar a etiologia de muitas doenças.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer ao laboratório Lee, da Universidade de Minnesota para fornecer o rato espinhal amostras de tecido espinhal que foram usados. Este trabalho foi financiado pelo Departamento de Defesa do ovário Cancer Research Program (OCRP) OC093424 a MB, pelo Fundo de Investigação e Comunidade Cancer Randy Shaver para MB e pelo Minnesota Ovarian Cancer Alliance (MOCA) para MB. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PowerGen 125 (homogenizer) | Fischer Scientific | 14-261-02P | |
| Vacuum-driven filters 0.22 µm | BPV2210 | ||
| Glass beads, acid washed ≤106 µm (~140 U.S. sieve) | Sigma-aldrich | G4649-10G | |
| Sucrose | Fischer Scientific | S6-212 | |
| DL-dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11965-092 | |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 10010-023 | |
| Tissue culture flask 75 cm2 w/ filter cup 250 ml 120/cs | Cellstar | T-3001-2 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| HI FBS | Life Technologies | 16140-071 | |
| Monoclonal anti-HA antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | H9658 | |
| Ubiquitin vinyl sulfone (HA-tag) | Enzo Life Sciences | BML-UW0155-0025 | |
| Laemmli's SDS-Sample Buffer (4x, reducing) | Boston BioProducts | BP-110R | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 |
References
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