Medicine

אינדוקציה והערכה של איסכמיה reperfusion פגיעה בלבבות עכברוש Langendorff-perfused

Published: July 27, 2015 doi: 10.3791/52908

Daniel J. Herr¹, Sverre E. Aune¹, Donald R. Menick^1,2

¹Department of Medicine/Cardiology, Gazes Cardiac Research Institute, Medical University of South Carolina, ²Ralph H. Johnson VA Medical Center, Medical University of South Carolina

Introduction

הבהרה של האירועים שבבסיס תגובת הלב לשתי איסכמיה ו reperfusion חיונית בשיפור הטיפול בהליכי אוטם שריר לב ¹ ולב כירורגית שדורשים ² צלב-הידוק אב העורקים. בעוד מודלים in vivo של פגיעת reperfusion איסכמיה לאפשר ניתוח נקודת סיום מאוד שימושי, הם לא יעילים כמו לחקר ההשפעות התפקודיות של פגיעת reperfusion איסכמיה בחריפות בזמן אמת. בנוסף, במודלי reperfusion איסכמיה vivo בדרך כלל לייצר שונות משמעותיות בגודל אוטם, ומשלוח ישיר של תרופה ללב בזמן reperfusion הוא מאתגר. הניצול של מערכת לב Langendorff מבודדת ללימוד פגיעת reperfusion איסכמיה מאפשר להערכה תפקודית בזמן אמת של טיפולים תרופתיים, אזור האחיד של רקמת אוטם שריר, ומשלוח מיידי של תרופה ישירות לשריר הלב.

תאר ב ראשוןy אוסקר Langendorff בשינה 1895 ^3, הלב Langendorff מבודד הוא מודל חזק ללימוד פגיעת reperfusion איסכמיה, ששמש במחקר reperfusion איסכמיה במשך 40 השנים האחרונות ^4,5. הנה, כמה שינויים נעשו כדי לייעל את הלב המבודד לניתוח פונקציונלי. בcannulation באתרו של אב העורקים בזמן הלב פועם מבטיח כי הלב אינו חווה נפשית מראש איסכמי, שהיה משנה את תוצאות ניסויי reperfusion איסכמיה ^6. כדי להקל על זה, tracheotomy מתבצע, המאפשר אוורור והבטחת יציבות פיזיולוגית של העכברוש במהלך ניתוח. הלב אז מצורף לעמודת מים במקטורן זכוכית ספירלה שדרכו חיץ קרבס Henseleit מועבר באמצעות זלוף מדרדר ישירות לאב העורקים. בלון מלוח מלא מוכנס לתוך החדר השמאלי ומחובר למתמר לחץ, המאפשר למדידה בזמן אמת של לחצים מהחדרחישוב ד פרמטרים פונקציונליים מרובים. בסיומו של הניסוי, הלב סמוק עם מי מלח קר כדי לעצור את ההתכווצות ופלאש קפוא בחנקן נוזלי כדי לאפשר ניתוח במורד הזרם של רמות ה- DNA, RNA והחלבון. שונה כך, לב Langendorff perfused משמש כמערכת יעילה לניטור ישיר של ההשפעה הפיזיולוגית של התערבויות תרופתיות בכל עת בחריפות במהלך פציעת reperfusion איסכמיה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הנהלים המופיעים ברשימה שאושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים באוניברסיטה הרפואית של דרום קרוליינה. הניסויים שתוארו כאן הם ניסויים חריפים, שאינה הישרדות. ככזה, אין שימוש במשחת עיניים וחבילת הפעלה סטרילי לא נדרשה. המתת חסד מושגת על ידי exsanguination במהלך הקציר של הלב.

1. ניסיוני הכנה

הגדרה או לחץ קבוע או זרימה מתמדת מכשירי Langendorff זלוף ^4.
הכן 4 L של קרבס Henseleit הצפת שונה (במ"מ: 112 NaCl, KCl 5, 1.2 MgSO _4, 1 K _{2 4} HPO, 1.25 CaCl _2, 25 ₃ NaHCO, 11 D-גלוקוז, 0.2 חומצת octanoic, pH = 7.4).
1. הפוך 10x מאגרי המניה.
  1. ממיסים NaCl, KCl, MgSO _4, ו- K _{2 4} HPO במי ultrapure 3 L.
  2. לפזר CaCl ₂ ב 500 מיליליטר המים Wi ultrapureה 40 מיליליטר של 1 N HCl.
  3. לאט לאט להוסיף CaCl ₂ פתרון לחיץ שנעשה ב1.2.1.1. להוסיף מספיק מים ultrapure להסתכם 4 ל 'אפשר לעורר עבור שעה 1 לפני סינון דרך מסנן 0.8 מיקרומטר. חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
  4. לפזר NaHCO ₃ במי ultrapure 4 L. לאפשר לעורר במשך שעה 1 לפני הסינון דרך על 0.8 מיקרומטר מסנן. חנות ב 4 מעלות צלזיוס
2. לשלב 400 מיליליטר 10x חיץ קרבס Henseleit עם 400 מיליליטר 10x NaHCO חיץ _3. מוסיף מים ultrapure מספיק לסך 4 ל ממיסים סוכר ובחומצת octanoic תוך ערבוב. סנן באמצעות 0.8 מיקרומטר לסנן.
הכן מערכת ללב.
1. הוסף 2 ליטר של חיץ מסונן לבקבוק 4 L ממוקם 38 במעל ברזלים מחוברים לצינורית אב העורקים. זה יספק לחץ זלוף של 70-80 מ"מ כספית ללב, המהווה את לחץ זלוף המומלץ ^4.
2. הכנס bubbler פיזור גז למאגר בבקבוק.
3. הפעל את החיץ באמצעות המערכת, להיות בטוח כדי לחסל את כל בועות מתוך צינורות.
4. הפעל גז (95% O _2/5% CO ₂₎ לפחות 30 דקות לפני לב הוא להציב במערכת. השתמש זרימת גז בדיקה ומנתח גז דם כדי לוודא ריווי חמצן.
הכן אספקה כירורגית ובלון.
1. לקציר של לב, להכין זוג אחד של 6.75 "מספריים כירורגיות, זוג אחד של 4.5" מספריים, שני זוגות של hemostats, שני סטים של מלקחיים caramalt, שני מזרקים עם 27 מחטי G, 2 חתיכות של תפר משי 0-מד (כ 15 ס"מ אורך), צינורית אחד 1/16 אינץ 'תיל, וצינורית לקנה הנשימה אחת.
2. להרכיב צינורית לקנה הנשימה, להדביק חתיכה קצרה של צינור פלסטיק בקוטר 1/16 אינץ 'לY-מחבר.
3. להרכיב מנגנון בלון: לצרף מחט gavage לפיסת 1/16 צינורות אינץ ', ולאחר מכן לצרף צינורות לדיור מתמר לחץ. מזרק קטן המצורף לצד השני של TR הלחץ האחרansducer דיור יאפשר אינפלציה ודפלציה של הבלון.
  1. לחתוך ריבוע של קצה לעטוף ומקום פלסטיק של מחט gavage במרכז. לעטוף בניילון הנצמד סביב מחט gavage.
  2. מלא בלון עם מי מלח ולקשור את שני תפרים. לנפח בלון כדי לוודא שאין דליפות. הנפח של תמיסת מלח בתוך הבלון המנופח צריך להיות בערך 200 μl, אבל יכול להשתנות בהתאם לגודל של העכברוש.
  3. לחלופין, להשתמש בעריסת אצבע לטקס במקום של הניילון נצמד. הנח מחט gavage בתוך עריסת אצבע, למלא עם מי מלח ולקשור את.

2. קציר הלב

לרסן את עכברוש ספראג Dawley באמצעות decapicone או התקן ריסון ספר אחר. שוקל חולדה.
לנהל קטמין / תערובת xylazine (0.85 מ"ג / קילוגרם קטמין ו0.15 מ"ג / קילוגרם xylazine) באמצעות זריקת intraperitoneal להרדים חולדה. מינון זה של הרדמה יספק הרדמה מספיק ל20-40 דקות, אבל ההליך אמור להסתיים מהר ככל האפשר לאחר ההרדמה הוא אישר.
לאשר מידה ראויה של הרדמה על ידי רפלקס קמצוץ הבוהן בדיקות.
Tracheotomy
1. הסר פרווה מאמצע כף-לבסיס של לסת, באמצעות hemostats לרומם פרווה ומספריים לעשות חתך. שמור את הפרווה גבוהה להפריד אותו מהשריר הבסיסי, המאפשר אחד כדי לחתוך לאורך הפרווה ולהסיר אותו.
2. באמצעות hemostats, להרים רקמות בלוטות ולעשות חתך אופקי בfascia נחותים רקמת הבלוטות. השתמש hemostats להפיץ חתך פתוח, נזהר שלא ניק ורידי הצוואר.
3. מספריים באמצעות hemostats, שריר שמעל קנה הנשימה קמצוץ, ובאמצעות לעשות חתך רוחבי בשריר ממש מתחת לקצה hemostats. באמצעות hemostats, התפשט לרקמות מלבד לחשוף את קנה הנשימה.
4. בזהירות להכניס hemostats תחת קנה הנשימה, ניקוי fascia תוך כדי התקדמות בעדינות על ידי קידום וחוזר בי hemostats.
5. ברגע שhemostats ממוקמים בהצלחה מאחורי קנה הנשימה, לצבוט 0-0 תפר משי עם hemostats וhemisect קנה הנשימה עם זוג קטן, מספריים חד.
6. הכנס צינורית לקנה הנשימה לתוך קנה הנשימה התפצל לפתע, למשוך תפר מאחורי קנה הנשימה, ולקשור את התפר סביב קנה הנשימה cannulated, עיגון התפר לY-המפשעה של הצינורית עם קשר מנתחים.
7. באמצעות מחט 27 G, להזריק 1000 U / קילוגרם הפרין לוריד הצוואר ומאפשר להסתובב למשך 30 שניות.
פתיחת בית החזה
1. הסר פרווה מאמצע בטן-לאזור אמצע כף-ידי צובט עם hemostats וגזירה במספריים.
2. לעשות חתך רוחבי אינץ '¾ לתוך קיר שרירי הבטן, ממש מתחת לסרעפת.
3. לעשות חתך אנכי במעלה קיר הקיר וחזה הבטן, חיתוך לאורך עצם החזה.
4. חותך את הסרעפת בחזרה בילטרלי, ואז להפיץ בית חזה כדי לחשוף את לב, בית חזה מהדק עם hemostats כדי להבטיח שנשארה התפשטות. באמצעות hemostats, להסיר בעדינות התימוס, חושף את אב העורקים עולים.
5. להקניט hemostats דרך לולאת אב העורקים, קידום וחוזר בי hemostats בעדינות מתפשט fascia לאפשר קצה hemostats דרך.
6. השתמש hemostats למשוך 0-0 תפר משי מאחורי אב העורקים עולים, לקשור תפר לפקעת חצי כיכר רופפת.
7. הפעל ברזלים כדי להתחיל זרימה של חיץ זלוף, אב העורקים hemisect ומייד להכניס צינורית לתוך לומן של אב העורקים. מהירות cinch קשר חצי כיכר ולהשלים את הקשר, הידוק ביסודיות.
8. השתמש במספריים לנתח לב מכולים הגדולים, להוציא את הלב מחזה ולצרף לעמודה זלוף.
9. לקצץ משם רקמת ריאה עודפת ולאפשר לב לאזן על עמודה במשך כ -15 דקות לפני החדרת הבלון. השתמש קצב זרימה נורמלי של חיץ דרך הלב של 10-20 מיליליטר / דקה.

3. Langendorff זלוף ואיסכמיה reperfusion פציעה

מיקום של טרום LVבלון ssure
1. להוציא את האוויר הבלון תוך גלגול לצורת קונוס ולהפוך את ברזלים כדי להבטיח בלון נשאר מרוקן.
2. בלו עזב אטריום עם מספריים קטנים לחשוף גישה לשסתום צניפי.
3. הכנס בלון דרך אטריום שמאל ושסתום צניפי לתוך חדר השמאלי.
4. התחל תוכנת ניטור לחץ (LabChart Pro).
5. לנפח בלון על ידי פתיחת שסתום ובעדינות הגדלת כמות של תמיסת מלח בבלון עד שלחץ הדיאסטולי קריאה מmicromanometer עולה אפס.
6. כדי לבדוק את התגובה באורך-מתח, לנפח בלון לאט ללחץ הדיאסטולי של 75 מ"מ כספית, להוציא את האוויר לאט, חוזר פעם אחת.
7. הגדר לחץ הדיאסטולי 10 מ"מ כספית על ידי ויסות הכמות של תמיסת מלח בבלון. הפעל ברזלים לאטום בלון ברמה זו של אינפלציה, ולשמור על מערכת לחץ סגורה בין בלון LV ומתמר לחץ.
8. לב נמוך יותר לתא תא וכיסוי מחומם עם פלסטיק.
מודעהministration של איסכמיה reperfusion פציעה
1. חבר את החלק התחתון של החדר המחומם ולאפשר קאמריים למלא עם חיץ effused.
2. כאשר חיץ ששקוע לב, להפוך את ברזלים כדי לעצור את הזרימה של חיץ ללב, גרימת איסכמיה הגלובלית. זמן איסכמיה יכול להשתנות בהתאם למטרות של הניסוי.
3. לאחר 30 דקות של איסכמיה, להפוך ברזלים כדי לשחזר את הזרימה של חיץ ללב, ייזום reperfusion.
4. לאפשר reperfusion של לב עבור שעה 1 לפני סיום הניסוי. השתמש פעמים reperfusion משתנים, בהתאם למטרות של הניסוי.
סיום הניסוי וקציר של רקמות
1. שימוש בנמל בצד של ברזלים, לנהל 10 מיליליטר של תמיסת מלח שנאגרו פוספט ב 4 מעלות צלזיוס ללב בשיעור של 10 מיליליטר / דקה לעצור הלב.
2. הסר לב מטור זלוף, לקצץ משם נותר רקמות פרוזדורים.
3. הנח לב לתוך מטריצת חיתוך רקמות נירוסטה, מכסה באבאrafilm, והמקום ב -80 ° C במשך 8 דקות, או עד שהלב יש עקביות כמו מרשמלו.
4. הסר בלוק מהמקפיא ולהכניס סכיני גילוח לחיתוך מטריצה לחתוך לב ל -2 פרוסות מ"מ. ניתן גם לרכוש בלוקים רקמות עם גדלי פרוסה אחרים מ -2 מ"מ.
5. הסר פרוסות אחד בכל פעם ושחרר לתוך חנקן נוזלי להבהב להקפיא למחקרים ביוכימיים. שמור על פרוסת חדרית השלישית מהקודקוד לצביעת אוטם.
6. הסרה של רקמה מחנקן נוזל חנות ב -80 ° C עד לשימוש בניסויים ביוכימיים.
אוטם מכתים
1. דגירה הפרוסה חדרית השלישית ב 10 מיליליטר של 1% w / כלוריד triphenyltetrazolium נ (TTC) על 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
  הערה: דגירה בTTC יכולה להתבצע במשך 15 או 30 דקות ללא שינוי ביעילות ^15.
2. העבר את פרוסת רקמה מTTC 10% פורמלין שנאגרו ולאפשר לדגירה בטמפרטורת חדר למשך הלילה. לקבלת תוצאות אופטימליות, לשמועיש לנקוט TS מתוך פורמלין וצלם בתוך 24 שעות ^4.
3. תוכנה פרוסה ושימוש מוכתם צילום כגון ImageJ להעריך גודל אוטם על פי הפרוטוקול של היצרן. לצלם בהקדם האפשרי לאחר קיבוע, כצבע יימוג לאורך זמן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מנגנון בלון החדר השמאלי מאפשר ניטור של הלחץ שפותח על ידי חדר הקבלנות שמאלה (איור 1) בזמן אמת. כפי שתואר לעיל ^7, עקבות לחץ זה יכול לשמש כדי לחשב רב של הפרמטרים של תפקוד חדר. חישובים אלה יכולים להתבצע בשלב הבסיסי, כמו גם את שלב reperfusion, בממוצע לכל עקבות מרובות בתוך כל קבוצה, ובהשוואה על מנת לקבוע אם ההתערבות התרופתית הביאה נפשית מראש לב, כפי שעשינו בעבר ^9. פרמטר אחד כזה הוא הלחץ שפותח, מחושב כהפרש בין לחץ סיסטולי ודיאסטולי לחץ הסוף. הלחץ שפותח בלב חולדה מרוסס נורמלי יכול לנוע 70-130 מ"מ כספית (איור 1 א). לאחר עלבון איסכמי, הלחץ פיתח מצטמצם ומרומם סוף דיאסטולי לחץ (איור 1). כאשר החולדותמנוהל סוכן נפשית מראש ידוע כגון אני הכיתה וIIb HDAC מעכב סח"ה (vorinostat) ¹⁸ לפני מוציא את הלב, הירידה בלחץ מפותח וההעלאה של לחץ הדיאסטולי הסוף קשור לפגיעת reperfusion איסכמיה הם נחלשו (איור 1 ג). מדדים אחרים של תפקוד חדר השמאלי, כגון השיעור של דור לחץ _(מקס / DT DP), ניתן ישירות השיגו השיעור של רגיעה לחץ (-dP / _מקס DT), ומוצר לחץ שיעור (RPP) או מחושבים מ פלט תוכנה (איור 2). שלב איסכמי יכול גם להיות במעקב בזמן אמת, עם ההפסקה לכאורה של דור לחץ בתוך דקות של ההופעה של איסכמיה. התכווצות איסכמי יכולה גם להיות במעקב על ידי מדידת הזמן עד להופעה של התכווצות וזמן שיא התכווצות.

כלוריד Triphenyltetrazolium (TTC) משמש בדרך כלל כדי להבדיל בין מטבוליתctive ורקמה פעילה, ומשמש כאן להכתמת אוטם. נספג ברגע לתוך הרקמה TTC הוא מופחת על ידי אנזימי חילוף חומרים, הופך אדום רקמה הפעילה. רקמה לא פעילה אינה מפחיתה TTC, ובתור שכזו תהיה כתם לבן ^8. Langendorff perfused לבבות עכברוש שלא היה נתון לפגיעת איסכמית לא מראים כל אזורים לבנים (לא מוצג), ואילו הלב נתון לאזורי מופע פגיעת reperfusion איסכמיה משמעותיים המוכתמים לבן, המצביעים על רקמת אוטם שריר (איור 3).

איור 1: עקבות לחץ נציג מחדרית בלון לחץ שמאל נרשם על ידי בלון LV על התכווצות של חדר.. לבבות לא נתון לאיסכמיה () חווים אובדן קל של יכולת התכווצות לאורך זמן. לבבות נתון לאיסכמיה (ב) להראות immedאובדן מאחר של דור לחץ, ואחריו התכווצות טוניק. על reperfusion, לבבות אלה חווים EDP הגבוה וירידה בלחץ פיתחו. לבבות preconditioned עם סאהא ונתונים לאיסכמיה (C) להראות הנחתה של פציעת reperfusion איסכמיה. N = 1 לכל קבוצה.

פרמטרים מחושבים של תפקוד חדר שערי דור לחץ (), שיעור של רגיעה לחץ (B), לחץ פיתח (C), ומוצר לחץ שיעור (ד) כמה פרמטרים של תפקוד חדר שניתן לחשב: איור 2. תוכנת ניטור לחץ.

איור 3: מכתים TTC לאזור אוטם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מבודד לב החולדה perfused יכול לשמש בהצלחה כדי לחקור את ההשפעה של התערבות תרופתית בלב נפשית מראש לפגיעה reperfusion איסכמיה ^9. עם זאת, יש כמה צעדים חיוניים להליך שחייב להיות אחיד כדי להבטיח תוצאות לשחזור. שמירה על טמפרטורה של 37.4 מעלות צלזיוס במערכת היא קריטית, כמו גם היפותרמיה והיפרתרמיה קלות יכולים לגרום נפשית מראש לב ^10,11. הזמן הכולל שחולף מהזרקה של חומר הרדמה לכריתה של הלב חייב להישמר עד למינימום, כחשיפה ממושכת לקטמין עלולה להפריע נפשית מראש לב ^12. cannulation בזמן של אב העורקים באתר הוא חיוני למניעת ההתפתחות של היפוקסיה בתוך הלב או exsanguination של בעלי החיים לפני כריתת לב. בסך הכל, בפעם ראשונה מחתך להסרת הלב צריכה להיות לא יותר מ 6-8 דקות. התואר הראשון חדרית עזבlloon יש לבדוק דליפות לפני כל ניסוי, והחליף במידת צורך. המערכת חייבת להישמר בקפדנות, כולל שטיפת כל המנגנון עם מים מזוקקים אחרי כל הסיבוב והחלפת צינורות שחוקים כנדרשים כדי למנוע דליפה או זיהום של הפנים של הצינור.

הלב מבודד עשוי להיות שונה עבור כל מספר של שימושים חדשים, כוללים הדמיה הקרינה ^13, NMR ⁷ ספקטרוסקופיה, ומיפוי אופטי ¹⁴ בין רבים אחרים. המערכת יכולה גם להיות שונה כדי תנקב לב מבעלי חיים שונים, כוללים עכברים. שינוי זה הוא שימושי במיוחד שכן היא מאפשרת לניסויים באמצעות עכברים מהונדסים. כדי לשנות את המערכת ללבבות עכבר, cannulae הקטן יותר וטור זלוף קטן יותר יש להשתמש, בנוסף לשינויים אחרים. תיאורים מפורטים של איך לנצל את שיטת Langendorff ללבבות עכבר כבר פורסם במקומות אחרים ^16,17. שינויים אחרים שלפרוטוקול זה כולל מתן תרופות שונות בנקודות זמן שונות. כאשר חוקרים את היכולת של תרופה לגרום נפשית מראש תרופתיים או פוסט-אוויר, זה חיוני כדי לנהל את התרופה בנקודות זמן שונה ביחס לפגיעה reperfusion איסכמיה. התרופה עשויה להינתן לבעלי החיים לפני שהלב הוא נכרת, או מעורב למאגר או לפני הלב מושם על העמודה או במהלך שלב איסכמי, כך שהתרופה נמצאת על reperfusion. לחלופין, צד-נמל יכול להיות מנוצל כדי לנהל בולוס של תרופה בכל נקודה במהלך הפרוטוקול זמן. בנוסף, הפרוטוקול יכול להיות שונה כדי לשנות את משך איסכמיה, reperfusion, או שניהם. זה מאפשר הניתוח של נתונים תפקודיים וביוכימיים בנקודות זמן מרובים, וניתן להשתמש כדי לעקוב אחר מהלך ההשפעה האקוטית של סמים הזמן. אם תקופת reperfusion משתנה, חשוב לשים לב כי לפחות 60 דקות של reperfusion הן necessary מכתים TTC להתוות בצורה יעילה אזור אוטם ^15.

המגבלה העיקרית של מודל לב המבודד במונחים של פגיעת reperfusion איסכמיה היא שזה אינו לוקח בחשבון שרבים מהגורמים המערכתיים שנמצאים בהגדרה של reperfusion איסכמיה in vivo. חיסול זה של השפעה מערכתית חייב להיות מטופלת בניתוח של נתונים שנוצרו באמצעות מודל Langendorff, אבל אינו מונע את היכולת של המודל כדי לענות על שאלות רומן על התגובה של myocytes, fibroblasts, ותאי האנדותל לאיסכמיה וreperfusion שלאחר מכן. מודל הלב המבודד מאפשר מניפולציה של רבים מהמשתנים המשפיעים על פגיעת reperfusion איסכמיה בנוסף לניתוח בזמן אמת של ההשפעות הפונקציונליות בלב על מרווחי זמן קצרים מלאה. הנתונים שנוצרו על ידי שימוש במערכת הלב מבודד הוא לא יסולא בפז בהבנה נפשית מראש התרופתית או פוסט-אוויר שללב בתגובה להתערבויות תרופות שונות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

פרסום זה נתמך על ידי המחקר קליני וTranslational (SCTR) מכון הדרום קרוליינה, עם בית אקדמי באוניברסיטה לרפואה של דרום קרוליינה, NIH / NCATS גרנט מספר UL1 TR000062. תמיכה נוספת סופקה על ידי פרס הצטיינות VA BX002327-01 לDRM. DJH נתמכה על ידי NIH / NCATS גרנט מספר TL1 TR000061 ועל ידי NIH גרנט מספר T32 GM008716. הים היה נתמך על ידי NIH גרנט מספר T32 HL07260.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S3014
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	P9541
Magnesium Sulfate	Sigma Aldrich	203726
Potassium Phosphate Dibasic	Sigma Aldrich	RES20765-A7
Calcium Chloride Dihydrate	Sigma Aldrich	C8106
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761
D-Glucose	Sigma Aldrich	G8270
Octanoic Acid	Sigma Aldrich	C2875
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride	Sigma Aldrich	T8877
Medical Pressure Transducer	MEMSCAP	SP844
Masterflex Peristaltic Pump	Cole Parmer	EW-07521-40
Masterflex Easy Load Pump Head	Cole Parmer	EW-07518-10
Heated circulating water bath	Lauda	M3
Tubing Flow Module	Transonic	TS410
Modular Research Console	Transonic	T402
Inline flow sensor	Transonic	ME2PXN
PowerLab Data Acquisition Device	AD Instruments	PL3508
LabChart data acquisition software	AD Instruments	MLU60/8