Introduction
모두 허혈 및 재관류에 심장 응답의 기초가되는 사건의 해명은 대동맥 - 클램핑 (2)를 필요로 심근 경색 (1) 심장 수술의 치료 개선에 필수적이다. 허혈 재관류 손상의 생체 내 모델이 매우 유용 종료점을 분석 할 수 있지만, 그들이 실시간으로 급성 허혈 재관류 손상의 작용 효과를 연구하기위한로서 효과적이지 않다. 생체 허혈 재관류 모델은 일반적으로 재관류시의 경색 크기에서 상당한 변동성 및 심장 약물의 직접 전달을 생산에 또한 도전. 허혈 재관류 손상을 연구 랑겐 돌프 격리하는 마음 시스템의 활용은 약물 치료, 경색 조직의 균일 한 영역, 직접 심근에 약물의 즉각적인 전달의 실시간 기능 평가를 할 수 있습니다.
먼저 B를 설명1895 년 3 Y 오스카 랑겐 돌프는 랑겐 돌프 격리하는 마음은 지난 40 년 4,5에 대한 허혈 재관류 연구에 사용 된, 허혈 재관류 손상 연구를위한 강력한 모델이다. 여기에 일부 수정 기능 분석을 위해 고립 된 마음을 최적화하기 위해 만들어집니다. 대동맥의 현장 삽관에서 심장 박동이 심장 허혈 재관류 시험 (6)의 결과를 바꿀 것 허혈 양상을 경험하지 않는 것을 보장된다. 이를 용이하게하기 위해, 기관 절개 환기 있도록 수술시 쥐의 생리 안정성 확보를 행한다. 심장이어서 크렙스 Henseleit 버퍼 대동맥에 직접 역행 관류 통해 전달되는 유리 물 재킷 나선형 기둥에 부착된다. 염수로 채워진 풍선 좌심실에 삽입 및 심실 내에서 압력을 실시간으로 측정 할 수있는 압력 변환기에 부착되고여러 기능 매개 변수의 D 계산. 실험이 끝날 때, 심장 수축과 DNA, RNA 및 단백질 수준의 하류 분석을 가능하게 액체 질소에 냉동 플래시 체포 냉 식염수로 불어 낸다. 따라서 수정을 Langendorff 관류 심장 허혈 재관류 손상시 급성 언제든지 약리학 적 개입의 생리적 효과를 직접 모니터링을위한 효과적인 시스템 역할을한다.
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Protocol
여기에 나열된 모든 절차는 사우스 캐롤라이나 의과 대학에서 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 여기에 설명 된 실험 급성 비 생존 실험이다. 따라서,이 눈 연고의 아무 소용이 없으며 멸균 운영 스위트 룸은 필요하지 않습니다. 안락사는 마음의 수확시 방혈에 의해 달성된다.
1. 실험 준비
- 일정한 압력 또는 일정한 흐름을 Langendorff 관류 장치 (4)를 설정합니다.
- 수정 크렙스 Henseleit 버퍼의 4 L 준비 (MM의 : (112)의 NaCl, 5 KCl을, 1.2 황산을 1, K 2 HPO 4, 1.25 염화칼슘 2, 25 NaHCO3를, 11 D- 글루코스, 0.2 옥 탄산, 산도 = 7.4).
- 10 배 재고 버퍼를 확인합니다.
- 3 L의 초순수에의 NaCl, KCl을, 황산, 및 K 2 HPO 4를 녹여.
- 500ml의 초순수 위스콘신에 CaCl2를 녹이고1 N 염산 40 mL로 일.
- 천천히 1.2.1.1에서 만든 버퍼에 염화칼슘이 솔루션을 추가 할 수 있습니다. 4 L. 총 충분히 초순수를 추가 0.8 μm의 필터를 통해 여과 전에 1 시간 동안 교반을 허용합니다. 4 ℃에서 보관하십시오.
- 4 L의 초순수에 NaHCO3를 해산. 0.8 μm의 필터로를 통해 필터링하기 전에 1 시간 동안 교반을 허용합니다. 저장 4 ° C에서
- 400 ml의 10 배 NaHCO3를 버퍼와 400 ml의 10 배 크렙스 Henseleit 버퍼를 결합합니다. 교반하면서 당과 옥 탄산을 녹이고 4 L. 총하기에 충분한 초순수를 추가합니다. 0.8 μm의 필터를 통해 필터링합니다.
- 10 배 재고 버퍼를 확인합니다.
- 심장을 위해 시스템을 준비합니다.
- 4 L 병에 필터링 된 버퍼의 2 L을 추가 대동맥 정맥에 붙어있는 꼭지 위의 38을 배치. 이 권장 관류 압 4 중심부에 70 ~ 80 mmHg로의 관류 압력을 제공 할 것입니다.
- 병에 버퍼에 가스 분산 버블을 삽입합니다.
- 튜브 내부에서 모든 거품을 제거해야되고, 시스템을 통해 버퍼를 실행합니다.
- 심장은 시스템 상에 배치 될 전에 가스 (95 %, O2 / 5 % CO 2) 적어도 30 분에 돌려. 산소 포화도를 확인하기 위해 가스 유동 프로브 및 혈액 가스 분석을 사용한다.
- 수술 용품 및 풍선을 준비합니다.
- 마음의 수확, 6.75 일쌍 "수술 가위, 4.5 일쌍"가위, 27 G 바늘, 0 게이지 실크 봉합사의 2 개 (약 15 지혈제 이쌍, caramalt 집게 두 세트, 두 개의 주사기를 준비 길이 cm), 하나 1/16 인치 철 뉼러, 한 기관 캐뉼라.
- 기관 캐뉼라를 조립하려면 Y 커넥터에 1/16 인치 직경의 플라스틱 튜브의 짧은 조각을 접착제.
- 풍선 장치를 조립 : 1/16 인치 튜브의 조각에 위관 바늘을 부착 한 후 압력 변환기의 하우징에 튜브를 연결합니다. 압력 TR의 다른쪽에 부착 된 작은 주사기ansducer 하우징은 풍선의 인플레이션과 디플레이션을 수 있습니다.
- 중앙에 위관 바늘의 플라스틱 포장과 장소 팁의 사각형을 잘라. 위관 바늘 주위의 플라스틱 포장 랩.
- 식염수로 풍선을 채우고 두 봉합으로 묶을. 누수가 없는지 확인하기 위해 풍선을 팽창. 팽창 된 풍선 내의 식염수의 부피는 약 200 μL해야하지만 쥐의 크기에 따라 달라질 수있다.
- 또한, 플라스틱 랩 대신 라텍스 손가락 침대를 사용합니다. 손가락 침대에서 위관 바늘을 놓고 식염수로 채우고 묶을.
2. 수확 심장
- decapicone 구속 또는 기타 수동 소자를 이용한 스프 라그 돌리 래트를 제지. 쥐의 무게를.
- 쥐를 마취하는 복강 내 주사를 통해 케타민 / 자일 라진 혼합물 (0.85 ㎎ / ㎏ 케타민 0.15 ㎎ / ㎏ 자일 라진)를 관리합니다. 마취제의 용량은 충분한 마취를 제공 할 것입니다20-40 분하지만 절차는 신속히 마취가 확인 가능한 후에 완료한다.
- 테스트 발가락 핀치 반사에 의한 마취의 적절한 수준을 확인합니다.
- 기관 절개술
- 절개를 만들기 위해 펠트와 가위를 상승 지혈제를 사용, 턱의 기본 중순 앞발에서 펠트를 제거합니다. 펠트 따라 절단하고 제거하는 일을 허용, 기본 근육에서 분리하는 상승 펠트를 유지합니다.
- 지혈제를 사용하여, 선의 조직을 들어 올려 선의 조직 근막에 수평 절개 열등합니다. 닉하지 경정맥을 돌보는 오픈 절개를 확산 지혈제를 사용합니다.
- , 지혈제를 사용하여 핀치 근육 기관을 덮는 및 사용 가위는 지혈제의 끝 아래 근육에 횡 절개를합니다. 지혈제를 사용하여 기관을 나타 내기 위해 따로 조직을 확산.
- 조심스럽게 부드럽게 전진과 지혈을 후퇴에 의해 진행하면서 근막을 제거, 기관에서 지혈제를 삽입합니다.
- 지혈이 성공적으로 기관 뒤에 배치되면, 지혈제와 0-0 실크 봉합사를 꼬집어 가위의 작은 날카로운 쌍의 기관을 hemisect.
- , hemisected 기관으로 기관 캐뉼라를 삽입기도 뒤에 봉합을 당겨와 외과 의사의 매듭 캐 뉼러의 Y 사타구니에 봉합사를 고정, 유관 기관 주위 봉합 넥타이.
- 27 G 바늘을 사용하여 경정맥에 1000 U / kg 헤파린 주입하고 30 초 동안 순환 시키도록 허용한다.
- 개흉술
- 지혈제로 곤란과 가위로 절단하여 중간 앞발 지역 중순 복부에서 펠트를 제거합니다.
- 바로 다이어프램 아래, 복부 근육의 벽에 ¾ 인치 가로 절개를합니다.
- 흉골을 따라 절단, 복부 벽과 가슴 벽까지 수직 절개를합니다.
- 다시 양자 다이어프램을 절단 한 후 마음이 확산 남아 보장하는 지혈제와 클램프 흉곽을 나타 내기 위해 흉곽을 확산. 지혈제를 사용하여 부드럽게 상행 대동맥을 노출, 흉선을 제거합니다.
- 지혈제의 팁을 통해 수 있도록 끈을 확산 부드럽게 진행하고 지혈을 후퇴하고, 대동맥 루프를 통해 지혈을 애무 해줘.
- , 상행 대동맥 뒤에 0-0 실크 봉합사를 당겨 느슨한 반 사각 매듭으로 봉합을 묶어 지혈을 사용합니다.
- 관류 버퍼, hemisect 대동맥의 흐름을 시작하고 즉시 대동맥 루멘에 캐 뉼러를 삽입 꼭지를 돌립니다. 신속하게 반 사각 매듭을 식은 죽 먹기 철저하게 강화, 매듭을 완료합니다.
- 멀리 큰 혈관에서 심장을 해부 가슴에서 심장을 제거하고 관류 열을 연결하는 가위를 사용합니다.
- 초과 폐 조직을 잘라 내고 마음이 풍선을 삽입하기 전에 약 15 분 동안 열 평형 수 있습니다. 10-20 ml / 분의 중심부를 통해 버퍼의 정상 유량을 사용한다.
3. 랑겐 돌프 관류 및 허혈 재관류 손상
- LV 사전 배치ssure 풍선
- 원뿔 모양으로 압연하는 동안 풍선을 수축 및 풍선이 수축 유지 보장하기 위해 꼭지를 켜십시오.
- 소비세는 승모판 막에 대한 액세스를 노출 가위의 작은 쌍의 중앙 홀을 떠났다.
- 좌심방과 좌심실에 승모판을 통해 풍선을 삽입합니다.
- 압력 모니터링 소프트웨어를 시작합니다 (LabChart 프로).
- 스톱 콕을 열고 부드럽게 micromanometer로부터 판독 확장기 혈압이 제로를 초과 할 때까지 풍선 식염수의 양을 증가시켜 풍선을 팽창.
- 천천히 수축, 길이 긴장 응답을 확인 75 mmHg로의 이완기 압력으로 천천히 풍선을 팽창하기 위해, 한 번 반복합니다.
- 풍선에 식염수의 양을 조절함으로써 10 mmHg로에 이완기 압력을 설정합니다. 인플레이션이 수준에서 풍선을 밀봉 마개를 돌려 LV 풍선과 압력 변환기 사이의 폐쇄 압력 시스템을 유지한다.
- 플라스틱 가열 챔버 커버 챔버로 낮은 마음.
- 광고허혈 재관류 손상의 직무
- 가열 된 챔버의 바닥을 연결하고 챔버 토로 버퍼에 기입 할 수 있습니다.
- 버퍼가 마음을 침수되면 글로벌 허혈을 유도, 마음에 버퍼의 흐름을 중지 꼭지를 켜십시오. 허혈 시간은 실험의 목적에 따라 달라질 수있다.
- 국소 빈혈의 30 분 후, 재관류를 시작, 마음에 버퍼의 흐름을 복원 꼭지를 켜십시오.
- 실험을 종료하기 전에 1 시간 동안 마음의 재관류를 허용합니다. 실험의 목적에 따라 변수 재관류 시간을 사용합니다.
- 실험의 종료 및 조직의 수확
- 꼭지의 사이드 포트를 사용하여, 10 ㎖의 속도로 마음에 4 ° C에서 인산염 완충 생리 식염수 10 ml의 관리 / 분의 마음을 체포합니다.
- , 관류 열에서 마음을 제거 심방 조직을 나머지 멀리 트림.
- 아빠 커버, 스테인레스 스틸 조직 슬라이스 행렬에 마음을 놓고8 분, 또는 마음까지 -80 ° C에서 rafilm 및 장소는 마시멜로 같은 일관성을 가지고있다.
- 냉장고에서 블록을 제거하고 2mm의 조각으로 마음을 슬라이스 매트릭스 슬라이스로 면도날을 삽입합니다. 조직 블록은 2mm 이외의 슬라이스 크기로 구입할 수 있습니다.
- 한 번에 조각 하나를 제거하고 생화학 적 연구에 동결 플래시 액체 질소에 놓습니다. 경색 염색의 정점에서 세 번째 심실 슬라이스를 유지.
- 생화학 실험에 사용할 때까지 -80 ° C에서 액체 질소 저장에서 조직을 제거합니다.
- 경색 염색
- 15 분 동안 37 ℃ / V의 트리 페닐 테트라 졸륨 클로라이드 (TTC) 1 % w 10ml에 제 심실 슬라이스 인큐베이션.
주 : TTC 인큐베이션은 효율성 15에서 변화없이 15 또는 30 분 동안 수행 될 수있다. - 10 % 포르말린에 TTC로부터 조직 절편을 전송하고, 밤새 실온에서 배양 할 수있다. 최적의 결과를 듣고,TS는 포르말린에서 꺼내어 24 시간 내에 4 군데해야합니다.
- 같은 ImageJ에 같은 사진 스테인드 조각 사용 소프트웨어는 제조 업체의 프로토콜에 따라 경색 크기를 추정한다. 염료가 시간이 지남에 따라 퇴색되므로, 고정 후 가능한 한 빨리 사진을 가져 가라.
- 15 분 동안 37 ℃ / V의 트리 페닐 테트라 졸륨 클로라이드 (TTC) 1 % w 10ml에 제 심실 슬라이스 인큐베이션.
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Representative Results
좌심실 풍선 장치는 좌심실 수축 (도 1)에 의해 개발 된 압력의 실시간 모니터링을 허용한다. 앞서도 7과 같이,이 압접 흔적은 심실 기능 많은 매개 변수를 계산하는데 사용될 수있다. 이러한 계산은, 기준 위상뿐만 아니라 재관류 위상 이루어진 각 그룹 내에서 여러 트레이스 대하여 평균, 우리는 이전에 9했던 것처럼 약리학 적 개입, 심장 전처리에 기인 한 것인지를 결정하기 위해 비교 될 수있다. 하나의 이러한 파라미터는 수축기 혈압과 이완기 종료 압력 사이의 차이로서 계산 내압이다. 정상 관류 쥐 마음에 개발 압력이 70 ~ 130 mmHg로 (그림 1A)에 이르기까지 다양 할 수 있습니다. 허혈 후에 개발 된 압력이 감소되고, 확장기 혈압의 단부로 상승 (도 1b). 때 래트는이러한 클래스 I 및 18 심장 절제에 앞서 개발 된 압력의 감소 및 허혈 재관류 손상과 관련된 단부 확장기 혈압의 상승이 감쇠 IIB HDAC 억제제 SAHA (vorinostat) (도 1C)와 같은 공지 된 컨디셔닝 제를 투여. 이러한 압력 발생 (DP / DT 최대)의 비율로서 좌심실 기능의 다른 방법은, 압력 완화 (-dp / dt를 최대)의 속도 및 속도 압력 생성물 (RPP)를 직접 획득하거나 계산 될 수있다 소프트웨어 출력 (그림 2). 허혈성 위상 또한 허혈의 발병 분 이내에 압력 발생의 명백한 중지하여, 실시간으로 모니터링 할 수있다. 허혈성 수축 또한 수축 및 수축 피크 시간 발병 시간을 측정함으로써 모니터링 될 수있다.
트리 페닐 테트라 졸륨 클로라이드 (TTC)는 통상적으로 대사를 구별하는 데 사용이 뽑은 및 비활성 조직 및 경색 염색 여기에 사용됩니다. 일단 활성화 된 조직을 빨간색으로, TTC는 대사 효소에 의해 감소되고 조직에 흡수. 비활성 조직 TTC 감소하지 않으며, 같은 8 흰색 얼룩 것입니다. 마음이 경색 조직을 나타내는 흰색 염색 허혈 재관류 손상 쇼 상당한 영역 (그림 3)을 실시하면서 랑겐 돌프는 모든 흰색 영역 (도시하지 않음)을 표시하지 않습니다 허혈 손상을받지 않은 쥐의 마음을 관류.
그림 1 :. 심실 수축시 좌심실 풍선에 의해 기록 좌심실 풍선 압력 대표 압력 흔적. 허혈 ()을받지 않는 마음은 시간이 지남에 따라 수축 능력의 작은 손실이 발생할 수 있습니다. 허혈을 실시 하트 (B) IMMED를 표시긴장성 수축이어서 압력 발생 늦었의 손실. 재관류시,이 마음은 높은 EDP를 경험하고 압력을 개발 감소. 하트 SAHA와 컨디셔닝 및 허혈 (C)을 실시 허혈 재관류 손상의 감쇠를 나타낸다. N = 그룹 당 1.
도 2 : 심실 기능의 계산 파라미터 비율 압력 발생 (A), 압력 완화 (B), 내압 (C), 및 레이트 압력 생성물 (D)의 비율이 계산 될 수 심실 기능의 일부 매개 변수는의. 압력 모니터링 소프트웨어.
그림 3 : 경색 영역 TTC 염색.
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Discussion
절연 관류 래트 심장 성공적 허혈 재관류 손상 9 심장 전처리에 약리학 적 개입의 효과를 연구하기 위해 사용될 수있다. 그러나, 재현 가능한 결과를 보장하기 위해 표준화되어야 절차와 몇몇 중요한 단계가있다. 시스템 내에서 37.4 ℃의 온도를 유지하는 것은 심지어 가벼운 저체온증과 고열이 심장 컨디셔닝 10, 11의 원인이되므로 중요하다. 케타민에 장기간 노출이 심장 컨디셔닝 (12)을 방해 할 수 있으므로 마음의 절제에 마취제의 주입에서 경과 전체 시간은 최소로 유지해야합니다. 시츄 대동맥 적시 삽관 심장 절제 전에 심장 또는 동물의 방혈 내의 저산소증의 발달을 예방에 필수적이다. 전반적으로, 마음의 제거에 처음 절개까지의 시간은 더 이상 6-8 분 이상 없어야합니다. 왼쪽 심실 바lloon은 각 실험 전에 누출을 점검하고, 필요한 경우 교체해야합니다. 시스템이 심하게 각 실행 후 증류수로 전체 장치를 세척 및 배관의 내부의 누출 또는 오염을 방지하기 위해 필요한만큼 마모 배관 교체를 포함한, 유지되어야한다.
격리하는 마음은 많은 다른 사람의 사이에서 형광 이미징 (13), NMR 분광학 (7), 및 광학 매핑 (14)을 포함하여 새로운 용도의 번호를 수정할 수 있습니다. 이 시스템은 또한 쥐를 포함한 다른 동물에서 마음을 관류 수정할 수 있습니다. 이 형질 전환 마우스를 사용하여 실험을 허용으로 수정이 특히 유용합니다. 다른 수정뿐만 아니라, 사용되어야 마우스 마음, 작은 캐 뉼러와 작은 관류 컬럼에 대한 시스템을 수정합니다. 마우스 마음의 랑겐 돌프 방법을 활용하는 방법에 대한 자세한 설명은 다른 곳에서 16, 17 발표되었다. 기타 수정이 프로토콜은 서로 다른 시점에서 다양한 약물의 관리를 포함한다. 약리 전처리 또는 후 조절을 유발하는 약물의 능력을 조사 할 때, 허혈 재관류 손상에 대하여 서로 다른 시점에서 약물을 투여하는 것이 필수적이다. 약물이 심장 절제 전에 동물에게 투여하거나 약물 재관류시에 존재하도록 중심부가 열 또는 허혈성 단계 중에 배치하기 전 버퍼로 혼합 될 수있다. 대안으로, 사이드 포트 프로토콜 중 임의의 시점에서 약물의 볼 루스를 관리하는데 이용 될 수있다. 또한, 프로토콜은 허혈, 재관류, 또는 둘 모두의 지속 기간을 변경하도록 변경 될 수있다. 이것은 여러 시점에서 기능적 및 생화학 데이터의 분석이 가능하며 약물의 급성 효과의 시간 경과를 추적하는데 사용될 수있다. 재관류 기간이 변경 될 경우, 재관류의 적어도 60 분 nece 것을 주목하는 것이 중요하다TTC 염색에 대한 ssary 효과적으로 경색 영역 (15)을 묘사합니다.
허혈 재관류 손상의 관점에서 절연 심장 모델의 주요 한계는 생체 내에서 허혈 재관류 속에서 존재하는 많은 전신 요인을 고려하지 않는다는 것이다. 전신 영향이 제거는 랑겐 돌프 모델을 이용하여 생성 된 데이터의 분석을 차지해야하지만, 허혈 후의 재관류에 심근 세포, 섬유 아세포, 내피 세포의 반응에 대한 신규의 질문에 응답하는 모델의 능력을 배제하는 것은 아니다. 절연 심장 모델은 짧은 시간 간격을 통해 심장 기능적인 효과를 실시간으로 분석 이외에 허혈 재관류 손상에 영향을 미치는 여러 변수의 전체 조작을 허용한다. 심장 격리 시스템을 사용하여 생성 된 데이터는 약리 전처리 또는 사후 컨디셔닝 이해 헤아릴다양한 제약 개입에 응답하여 심장.
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Acknowledgments
이 책은 사우스 캐롤라이나 의과 대학에서 학술 집, NIH / NCATS 허가 번호 UL1 TR000062로, 사우스 캐롤라이나 임상 및 중개 연구 (SCTR) 연구소에 의해 지원되었다. 추가 지원은 DRM에 버지니아 우수상 BX002327-01에 의해 제공되었다. DJH는 NIH / NCATS 허가 번호 TL1 TR000061에 의해 NIH 허가 번호 T32 GM008716에 의해 지원되었다. 바다 NIH 허가 번호 T32 HL07260에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P9541 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma Aldrich | 203726 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | RES20765-A7 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma Aldrich | C8106 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| Octanoic Acid | Sigma Aldrich | C2875 | |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride | Sigma Aldrich | T8877 | |
| Medical Pressure Transducer | MEMSCAP | SP844 | |
| Masterflex Peristaltic Pump | Cole Parmer | EW-07521-40 | |
| Masterflex Easy Load Pump Head | Cole Parmer | EW-07518-10 | |
| Heated circulating water bath | Lauda | M3 | |
| Tubing Flow Module | Transonic | TS410 | |
| Modular Research Console | Transonic | T402 | |
| Inline flow sensor | Transonic | ME2PXN | |
| PowerLab Data Acquisition Device | AD Instruments | PL3508 | |
| LabChart data acquisition software | AD Instruments | MLU60/8 |
References
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