Introduction
La elucidación de los hechos que subyacen a la respuesta cardiaca tanto la isquemia y la reperfusión es esencial para mejorar el tratamiento del infarto de 1 y cardíacas procedimientos quirúrgicos miocardio que requieren pinzamiento aórtico 2. Mientras que los modelos in vivo de la lesión de reperfusión de isquemia permiten el análisis de punto final muy útiles, no son tan eficaces para el estudio de los efectos funcionales de la lesión de reperfusión de isquemia aguda en tiempo real. Además, en modelos de isquemia reperfusión in vivo generalmente producen variabilidad significativa en el tamaño del infarto, y la entrega directa de medicamento para el corazón en el momento de la reperfusión es un reto. La utilización de un sistema de corazón Langendorff aislados para el estudio de la lesión de reperfusión de isquemia permite una evaluación funcional en tiempo real de los tratamientos farmacológicos, área uniforme de tejido infartado, y la entrega instantánea del fármaco directamente al miocardio.
En primer lugar se describe by Oscar Langendorff en 1895 3, el corazón Langendorff aislado es un modelo robusto para el estudio de la lesión por isquemia-reperfusión, después de haber sido utilizado en la investigación de isquemia reperfusión durante los últimos 40 años 4,5. Aquí, se hacen algunas modificaciones para optimizar el corazón aislado para el análisis funcional. En la canulación situ de la aorta mientras el corazón está latiendo asegura que el corazón no experimenta precondicionamiento isquémico que pudieran alterar los resultados de los ensayos de reperfusión isquemia 6. Para facilitar esto, se realiza una traqueotomía, lo que permite la ventilación y garantizar la estabilidad fisiológica de la rata durante la cirugía. El corazón luego se une a una columna con camisa de agua espiral de vidrio a través del cual tampón de Krebs Henseleit se entrega a través de perfusión retrógrada directamente en la aorta. Un globo lleno de solución salina se inserta en el ventrículo izquierdo y unido a un transductor de presión, que permite la medición en tiempo real de las presiones desde dentro de la una ventrículod cálculo de varios parámetros funcionales. A la conclusión del experimento, el corazón se lava con solución salina fría para detener la contracción y flash congelado en nitrógeno líquido para permitir el análisis aguas abajo de los niveles de ADN, ARN y proteínas. Por lo tanto modificado, el corazón Langendorff perfundidos sirve como un sistema eficaz para la supervisión directa del efecto fisiológico de las intervenciones farmacológicas en cualquier momento de forma aguda durante la lesión por isquemia y reperfusión.
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Protocol
Todos los procedimientos que figuran a continuación han sido aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Medicina de Carolina del Sur. Los experimentos descritos aquí son experimentos agudos, no de supervivencia. Como tal, no hay uso de la pomada para los ojos y no se requiere un quirófano estéril. La eutanasia se logra por desangrado durante la recolección del corazón.
1. Preparación Experimental
- Configure sea una presión constante o flujo constante de perfusión Langendorff Aparato 4.
- Preparar 4 L de Krebs Henseleit modificado Buffer (en mM: 112 NaCl, 5 KCl, 1,2 MgSO 4, 1 K 2 HPO 4, 1,25 CaCl 2, 25 NaHCO 3, 11 D-glucosa, 0.2 ácido octanoico, pH = 7,4).
- Hacer 10x buffers de valores.
- Disolver NaCl, KCl, MgSO 4, y K 2 HPO 4 en 3 L de agua ultrapura.
- Disolver CaCl 2 en 500 ml de agua ultrapura wiTH 40 ml de HCl 1 N.
- Agregue lentamente solución de CaCl2 al búfer hecho en 1.2.1.1. Agregar suficiente agua ultrapura a un total de 4 L. Permitir agitar durante 1 hora antes de filtrar a través de un filtro de 0,8 micras. Almacenar a 4 ° C.
- Disolver NaHCO3 en 4 L de agua ultrapura. Dejar en agitación durante 1 hr antes de filtrar a través de al 0.8 micras filtro. Almacenar a 4 ° C
- Combinar 400 ml de 10x tampón de Krebs Henseleit con NaHCO tampón 400 ml de 10x 3. Agregar suficiente agua ultrapura a un total de 4 L. Disolver la glucosa y ácido octanoico mientras se agita. Filtrar a través de 0,8 micras filtro.
- Hacer 10x buffers de valores.
- Sistema de Preparación para el corazón.
- Añadir 2 L de tampón se filtró a una botella de 4 L colocados por encima de 38 en la llave de paso unido a la cánula aórtica. Esto entregar una presión de perfusión de 70-80 mm de Hg para el corazón, que es la presión de perfusión recomendado 4.
- Inserte gas dispersión de burbujeo en el búfer en la botella.
- Ejecutar el tampón a través del sistema, asegurándose de eliminar cualquier burbuja desde el interior de la tubería.
- Encienda gas (95% O 2/5% de CO 2) al menos 30 min antes de corazón se va a colocar en el sistema. Use una sonda de flujo de gas y el analizador de gases en sangre para verificar la saturación de oxígeno.
- Preparar material quirúrgico y globo.
- Para la recolección de corazón, preparar un par de 6.75 "tijeras quirúrgicas, un par de 4.5" tijeras, dos pares de pinzas, dos juegos de pinzas caramalt, dos jeringas con agujas de 27 G, 2 piezas de sutura de seda 0 de calibre (alrededor de 15 cm de longitud), una cánula de púas 1/16 pulgadas, y una cánula traqueal.
- Para el montaje de cánula traqueal, pegar un pequeño trozo de tubo de plástico de diámetro 1/16 pulgada a un conector.
- Para montar un aparato de balón: adjuntar una aguja de sonda a un trozo de tubo de 1/16 pulgadas, a continuación, conecte la tubería a la vivienda transductor de presión. Una pequeña jeringa unida al otro lado de la presión transducer vivienda permitirá la inflación y la deflación del balón.
- Corte un cuadrado de abrigo y lugar punta de plástico de una aguja sonda en el centro. Envuelva la envoltura de plástico alrededor de la aguja sonda.
- Rellene el globo con solución salina y atar con dos suturas. Inflar el globo para asegurar que no haya fugas. El volumen de solución salina dentro del balón inflado debe ser aproximadamente 200 l, pero puede variar dependiendo del tamaño de la rata.
- También puede utilizar un dedil de látex en lugar de la envoltura de plástico. Coloque la aguja sonda dentro dedil, rellenar con solución salina y atar.
2. Cosecha el corazón
- Restringir una rata Sprague Dawley utilizando un decapicone u otro dispositivo de sujeción manual. Pesar rata.
- Administrar ketamina / xilazina mezcla (0,85 mg / kg de ketamina y 0,15 mg / kg de xilazina) mediante inyección intraperitoneal para anestesiar la rata. Esta dosis de anestésico proporcionará suficientes para anestesia20-40 min, pero el procedimiento debe completarse lo antes posible después de que se confirmó la anestesia.
- Confirme grado adecuado de anestesia mediante pruebas toe pizca reflejo.
- Traqueotomía
- Retire piel desde mediados de pata a la base de la mandíbula, usando pinzas para elevar piel y tijeras para hacer la incisión. Mantenga la piel elevado a separarlo del músculo subyacente, que permite una para cortar a lo largo de la piel y retírela.
- Usando pinzas hemostáticas, levantar el tejido glandular y hacer una incisión horizontal en la fascia inferior al tejido glandular. Utilice pinzas para difundir incisión abierta, teniendo cuidado de no cortar las venas yugulares.
- Usando pinzas hemostáticas, músculo pizca superpuestos tráquea, y el uso de las tijeras hacen una incisión transversal en el músculo justo debajo de la punta de las pinzas hemostáticas. Usando pinzas hemostáticas, se extendió el tejido aparte de revelar tráquea.
- Inserte cuidadosamente hemostatos bajo tráquea, despejando fascia mientras progresa avanzando suavemente y retraer hemostáticos.
- Una vez hemostáticos se colocan con éxito detrás de la tráquea, pellizcar 0-0 sutura de seda con pinzas hemostáticas y hemisect la tráquea con un pequeño par de tijeras afiladas,.
- Insertar cánula traqueal en la tráquea hemiseccionaron, tire de la sutura detrás de la tráquea, y atar la sutura alrededor de la tráquea canulado, el anclaje de la sutura a la Y-ingle de la cánula con un nudo cirujanos.
- Usando una aguja 27 G, inyectar 1.000 U / kg de heparina en la vena yugular y permitir a circular para 30 seg.
- La toracotomía
- Retire piel desde mediados de abdomen a la región a mediados de pata pellizcando con pinzas hemostáticas y cortar con tijeras.
- Hacer una incisión transversal pulgadas ¾ en la pared muscular del abdomen, justo por debajo del diafragma.
- Hacer una incisión vertical hasta la pared y en el pecho de la pared abdominal, el corte a lo largo del esternón.
- Cortar el diafragma hacia atrás de forma bilateral, luego se extendió la caja torácica para revelar el corazón, costillas de sujeción con pinzas hemostáticas para asegurar que sigue siendo propagación. Utilizando pinzas, retire con cuidado el timo, la exposición de la aorta ascendente.
- Tease hemostatos a través del bucle de la aorta, de avance y retroceso hemostáticos y suavemente difusión fascia para permitir punta de pinzas a través.
- Utilice pinzas para tirar de 0-0 sutura de seda detrás de la aorta ascendente, la corbata de sutura en un medio cuadrado nudo flojo.
- Gire la llave de paso para iniciar el flujo de tampón de perfusión, la aorta hemisect e inmediatamente inserte cánula en luz aórtica. Rápidamente cincha un nudo de media plaza y completar el nudo, apretar a fondo.
- Use las tijeras para diseccionar corazón lejos de los grandes vasos, quite el corazón del pecho y adjuntar a la columna de la perfusión.
- Recorte el exceso de tejido pulmonar y permitir que el corazón se equilibre en la columna durante aproximadamente 15 min antes de la inserción del globo. Utilice un caudal normal de búfer a través del corazón de 10 a 20 ml / min.
3. Langendorff de perfusión e isquemia reperfusión
- La colocación de LV preglobo fisura
- Desinflar globo mientras rueda en forma de cono y gire la llave de paso para asegurar globo permanece desinflado.
- Impuestos Especiales dejó atrio con un pequeño par de tijeras para exponer el acceso a la válvula mitral.
- Inserte globo a través de la aurícula izquierda y la válvula mitral hacia el ventrículo izquierdo.
- Inicie el software de control de presión (LabChart Pro).
- Inflar el globo con la apertura de la llave de paso y suavemente creciente cantidad de solución salina en el globo hasta que la presión diastólica lectura de micromanómetro supera cero.
- Para comprobar la respuesta longitud-tensión, inflar el globo lentamente a una presión diastólica de 75 mmHg, desinflarse lentamente, repetir una vez.
- Establecer la presión diastólica a 10 mmHg mediante la modulación de la cantidad de solución salina en el globo. Gire la llave de paso para sellar el globo en este nivel de la inflación y mantener el sistema de presión cerrado entre el globo LV y transductor de presión.
- Baja corazón en la cámara de cámara y cubierta climatizada con plástico.
- Una dministerio de isquemia reperfusión
- Enchufe el fondo de la cámara climatizada y permitir que la cámara se llene con tampón derramada.
- Cuando tampón ha sumergido corazón, gire la llave de paso para detener el flujo de tampón en el corazón, la inducción de la isquemia global. El tiempo de isquemia puede variar dependiendo de los objetivos del experimento.
- Después de 30 min de isquemia, gire la llave de paso para restaurar el flujo de tampón en el corazón, iniciando la reperfusión.
- Permitir la reperfusión del corazón durante 1 hora antes de terminar el experimento. Utilice tiempos de reperfusión variables, dependiendo de los objetivos del experimento.
- La terminación del experimento y la recolección de Tejidos
- Uso de puerto lateral de la llave de paso, administrar 10 ml de salina tamponada con fosfato a 4 ° C en el corazón a una velocidad de 10 ml / min para parar el corazón.
- Quite el corazón de la columna de la perfusión, recortar restante tejido auricular.
- Coloque corazón en una matriz de corte de tejido de acero inoxidable, cubrir con Parafilm y lugar a -80 ° C durante 8 minutos, o hasta que el corazón tiene una consistencia como la melcocha.
- Retire el bloque del congelador e insertar hojas de afeitar en la matriz de cortar para cortar corazón en rodajas 2 mm. Bloques de tejidos también pueden ser comprados con tamaños rebanada distintos de 2 mm.
- Retire las rebanadas una a la vez y soltar en nitrógeno líquido para congelar parpadear para estudios bioquímicos. Conserve la tercera rebanada ventricular desde el vértice para la tinción del infarto.
- Retire el tejido de nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C hasta su uso en experimentos bioquímicos.
- Infarto de tinción
- Incubar la tercera rebanada ventricular en 10 ml de 1% w / v de cloruro de trifeniltetrazolio (TTC) a 37 ° C durante 15 min.
Nota: La incubación en TTC se puede realizar para 15 o 30 min sin cambio en la eficacia 15. - Transferencia rebanada de tejido de TTC a 10% de formalina tamponada y se deja incubar a temperatura ambiente durante la noche. Para obtener resultados óptimos, escucharts deben ser sacados de formol y la imagen dentro de 24 horas 4.
- Fotografía manchado software rebanada y el uso como ImageJ para estimar el tamaño del infarto según el protocolo del fabricante. Tome fotografías tan pronto como sea posible después de la fijación, ya que el tinte se desvanecerá con el tiempo.
- Incubar la tercera rebanada ventricular en 10 ml de 1% w / v de cloruro de trifeniltetrazolio (TTC) a 37 ° C durante 15 min.
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Representative Results
El aparato de balón del ventrículo izquierdo permite la monitorización en tiempo real de la presión desarrollada por la contratación del ventrículo izquierdo (Figura 1). Como se ha descrito previamente 7, esta traza de presión puede ser usada para calcular muchos de los parámetros de la función ventricular. Estos cálculos pueden realizarse en la fase de línea de base, así como la fase de reperfusión, promediados sobre múltiples trazas dentro de cada grupo, y se compararon con el fin de determinar si la intervención farmacológica resultó en preacondicionamiento cardíaco, como lo hemos hecho anteriormente 9. Uno de tales parámetros es la presión desarrollada, calculado como la diferencia entre la presión sistólica y la presión diastólica final. La presión desarrollada en corazones normales de rata perfundidos puede intervalo de 70 a 130 mmHg (Figura 1A). Después de un insulto isquémico, la presión desarrollada se reduce y las eleva la presión diastólica final (Figura 1B). Cuando las ratas sonadministrado un agente de preacondicionamiento conocido, tal como la clase I y IIb HDAC inhibidor de SAHA (vorinostat) 18 antes de la ablación del corazón, la reducción de la presión desarrollada y la elevación de la presión diastólica final asociado con la lesión por reperfusión de isquemia son atenuados (Figura 1C). Otras medidas de la función ventricular izquierda, tales como la tasa de generación de presión (dP / dt max), la tasa de relajación de presión (-dP / dt max), y el producto tasa de presión (RPP) pueden ser obtenidos directamente o calcularse a partir de la salida de software (Figura 2). La fase isquémica también se puede monitorizar en tiempo real, con la aparente cese de la generación de presión dentro de minutos de la aparición de isquemia. Contracción isquémica también se puede monitorizar midiendo el tiempo hasta el inicio de la contracción y el tiempo hasta el pico contracción.
Cloruro de trifeniltetrazolio (TTC) se utiliza comúnmente para diferenciar entre un metabólicamentective y el tejido inactivo, y se utiliza aquí para la tinción del infarto. Una vez absorbido en el tejido TTC se reduce por enzimas metabólicas, girando el rojo tejido activo. Tejido inactivo no reduce TTC, y como tal se mancha blanca 8. Langendorff perfundidos corazones de ratas que no han sido sometidos a la lesión isquémica no muestran áreas blancas (no mostrados), mientras que los corazones sometidos a isquemia-reperfusión muestran lesiones importantes zonas manchadas blanco, lo que indica tejido infartado (Figura 3).
Figura 1: huellas de presión representativas de la presión ventricular izquierda globo registrado por el globo LV sobre la contracción ventricular.. Corazones no sometidos a isquemia (A) experimentan una pérdida menor de la capacidad contráctil en el tiempo. Corazones sometidos a isquemia (B) muestran immedpérdida IATE de generación de presión, seguido de contracción tónica. Tras la reperfusión, estos corazones experimentan EDP elevada y disminución de la presión desarrollados. Corazones precondicionados con SAHA y sometidos a isquemia (C) muestra la atenuación de la lesión por reperfusión de la isquemia. N = 1 por grupo.
Figura 2: Calculado parámetros de función ventricular Cambio de generación de presión (A), la velocidad de relajación de presión (B), presión desarrollada (C), y el producto de presiones sobre el tipo (D) son algunos de los parámetros de función ventricular que se pueden calcular a partir de la. software de monitoreo de presión.
Figura 3: tinción TTC para el área de infarto.
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Discussion
El corazón aislado y perfundido de rata puede ser utilizado con éxito para estudiar el efecto de la intervención farmacológica en el precondicionamiento cardíaco en la isquemia reperfusión 9. Sin embargo, hay algunos pasos esenciales para el procedimiento que debe ser estandarizada con el fin de asegurar resultados reproducibles. El mantenimiento de una temperatura de 37,4 ° C dentro del sistema es crítica, ya que incluso la hipotermia leve y la hipertermia pueden causar preacondicionamiento cardíaco 10,11. El tiempo total que transcurre desde la inyección de anestésico a la escisión del corazón debe mantenerse a un mínimo, ya que la exposición prolongada a la ketamina puede interferir con preacondicionamiento cardíaco 12. Canulación oportuna de la aorta in situ es esencial para prevenir el desarrollo de la hipoxia en el corazón o el desangrado del animal antes de la escisión del corazón. En general, el tiempo desde la primera incisión para la extracción del corazón debe ser de no más de 6-8 minutos. Los ba ventricular izquierdalloon se debe comprobar que no haya fugas antes de cada experimento, y reemplazado si es necesario. El sistema debe mantenerse meticulosamente, incluyendo el lavado de todo el aparato con agua destilada después de cada carrera y la sustitución de la tubería desgastado como sea necesario para evitar la fuga o contaminación del interior de la tubería.
El corazón aislado puede modificarse para cualquier número de usos novedosos, incluyendo imágenes de fluorescencia 13, NMR Spectroscopy 7, y mapeo óptico 14 entre muchos otros. El sistema también puede ser modificado para perfundir corazones de diferentes animales, incluyendo ratones. Esta modificación es especialmente útil ya que permite experimentos usando ratones transgénicos. Para modificar el sistema para que los corazones de ratón, más pequeño cánulas y una columna más pequeña de perfusión debe ser utilizado, además de otras modificaciones. Las descripciones detalladas de cómo utilizar el método de Langendorff para los corazones de ratón han sido publicados en otra parte 16,17. Otras modificaciones deeste protocolo incluye la administración de diversos fármacos en diferentes puntos temporales. Al investigar la capacidad de un fármaco para provocar preacondicionamiento farmacológico o post-acondicionado, es esencial para administrar el fármaco a diferentes puntos de tiempo en relación con la lesión por isquemia y reperfusión. El fármaco se puede administrar al animal antes de que se extirpó el corazón, o mezclado en la memoria intermedia, ya sea antes de que el corazón se coloca sobre la columna o durante la fase isquémica de manera que el fármaco está presente en la reperfusión. Alternativamente, un puerto lateral puede utilizarse para administrar un bolo de medicamento en cualquier punto de tiempo durante el protocolo. Además, el protocolo puede ser modificado para cambiar la duración de la isquemia, la reperfusión, o ambos. Esto permite que el análisis de los datos funcionales y bioquímicos en múltiples puntos de tiempo y se puede utilizar para rastrear el curso de tiempo del efecto agudo de un medicamento. Si se altera el período de reperfusión, es importante tener en cuenta que por lo menos 60 minutos de reperfusión son necesario para la tinción TTC para delinear con eficacia zona del infarto 15.
La principal limitación del modelo de corazón aislado en términos de lesión por isquemia y reperfusión es que no tiene en cuenta muchos de los factores sistémicos que están presentes en el entorno de la reperfusión de isquemia in vivo. Esta eliminación de la influencia sistémica debe tenerse en cuenta en el análisis de los datos generados mediante el modelo de Langendorff, pero no excluye la capacidad del modelo para responder a nuevas preguntas sobre la respuesta de los miocitos, fibroblastos y células endoteliales a la isquemia y posterior reperfusión. El modelo de corazón aislado permite la manipulación completa de muchas de las variables que afectan a la lesión por reperfusión de isquemia, además de análisis en tiempo real de los efectos funcionales en el corazón durante intervalos de tiempo cortos. Los datos generados mediante el uso del sistema de corazón aislado es muy valiosa para comprender el precondicionamiento farmacológico o post-acondicionamiento de lacorazón en respuesta a diversas intervenciones farmacéuticas.
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Acknowledgments
Esta publicación fue apoyada por la Clínica y Traslacional de Investigación (SCTR) Instituto de Carolina del Sur, con un hogar académico de la Universidad Médica de Carolina del Sur, NIH / NCATS subvención Número de UL1 TR000062. Más apoyo fue proporcionado por premio al mérito VA BX002327-01 de DRM. DJH fue apoyado por el NIH / NCATS subvención Número de TL1 TR000061 y por el NIH subvención Número de T32 GM008716. MAR fue apoyado por el NIH subvención Número de T32 HL07260.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P9541 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma Aldrich | 203726 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | RES20765-A7 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma Aldrich | C8106 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| Octanoic Acid | Sigma Aldrich | C2875 | |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride | Sigma Aldrich | T8877 | |
| Medical Pressure Transducer | MEMSCAP | SP844 | |
| Masterflex Peristaltic Pump | Cole Parmer | EW-07521-40 | |
| Masterflex Easy Load Pump Head | Cole Parmer | EW-07518-10 | |
| Heated circulating water bath | Lauda | M3 | |
| Tubing Flow Module | Transonic | TS410 | |
| Modular Research Console | Transonic | T402 | |
| Inline flow sensor | Transonic | ME2PXN | |
| PowerLab Data Acquisition Device | AD Instruments | PL3508 | |
| LabChart data acquisition software | AD Instruments | MLU60/8 |
References
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