Introduction
A elucidação dos eventos subjacentes à resposta cardíaca tanto para isquemia e reperfusão são essencial para melhorar o tratamento de enfarte 1 e procedimentos cirúrgicos cardíacos do miocárdio que necessitam pinçamento aórtico 2. Embora os modelos in vivo de lesão de reperfusão de isquemia permitir análise de ponto final muito úteis, eles não são tão eficazes para estudar os efeitos funcionais da isquemia lesão de reperfusão aguda em tempo real. Além disso, em modelos de isquemia reperfusão in vivo geralmente produzem uma variabilidade significativa da dimensão do enfarte e a entrega directa de drogas para o coração no momento da reperfusão é um desafio. A utilização de um sistema de coração de Langendorff isolado para estudar a lesão por isquemia reperfusão permite a avaliação funcional em tempo real dos tratamentos farmacológicos, área uniforme do tecido enfartado e entrega instantânea de fármaco directamente ao miocárdio.
Descrita pela primeira vez by Oscar Langendorff em 1895 3, o coração de Langendorff isolado é um modelo robusto para o estudo da lesão de reperfusão de isquemia, tendo sido utilizado na pesquisa de isquemia reperfusão durante os últimos 40 anos 4,5. Aqui, algumas modificações são feitas para aperfeiçoar o coração isolado para análise funcional. Em situ canulação da aorta, enquanto o coração está a bater garante que o coração não experimentar o pré-condicionamento isquémico, que iria alterar os resultados dos ensaios isquemia reperfusão 6. Para facilitar isto, uma traqueotomia é efectuada, permitindo a ventilação e garantir a estabilidade fisiológica do rato durante a cirurgia. O coração é depois ligado a uma coluna em espiral com camisa de água de vidro através da qual tampão de Krebs Henseleit é entregue através de perfusão retrógrada directamente para a aorta. Um balão cheio de soro fisiológico é inserido no ventrículo esquerdo e ligado a um transdutor de pressão, que permite a medição das pressões em tempo real a partir do um ventrículod cálculo de vários parâmetros funcionais. Na conclusão do experimento, o coração é lavada com solução salina fria para prender contração e flash congelado em nitrogênio líquido para permitir a análise a jusante dos níveis de DNA, RNA e proteínas. Assim modificado, o coração de Langendorff perfundido serve como um sistema eficaz para a monitorização directa do efeito fisiológico de intervenções farmacológicas, em qualquer momento de forma aguda durante a lesão por isquemia-reperfusão.
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Protocol
Todos os procedimentos listados aqui foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso do animal Institucional na Universidade de Medicina da Carolina do Sul. As experiências aqui descritas são, experiências agudas não-sobrevivência. Como tal, não há uso de pomada e uma suíte de cirurgia estéril não é necessária. A eutanásia por exsanguinação é conseguida durante a colheita do coração.
1. Experimental Preparação
- Configure ou uma pressão constante ou fluxo constante de perfusão Langendorff Aparelho 4.
- Prepare a 4 L de Krebs Henseleit modificado (em mM: NaCl 112, KCl 5, MgSO4 1,2, 1 K 2 HPO 4, 1,25 de CaCl2, 25 de NaHCO3, 11 de D-glicose, 0,2 de ácido octanóico, pH = 7,4).
- Faça 10x buffers de ações.
- Dissolve-se NaCl, KCl, MgSO4, e K 2 HPO 4 em 3 L de água ultrapura.
- Dissolver CaCl2 em 500 ml de água ultrapura with 40 ml de 1 N de HCl.
- Adiciona-se lentamente solução de CaCl2 ao tampão feito em 1.2.1.1. Adiciona-se água ultra-pura o suficiente para o total de 4 L. Deixar a agitar durante 1 h antes de se filtrar através de um filtro de 0,8 um. Armazenar a 4 ° C.
- Dissolver NaHCO 3 em 4 L de água ultrapura. Deixar a agitar durante 1 h antes de se filtrar através de pelo filtro de 0,8 um. Armazenar a 4 ° C
- Combinar 400 mL de 10x tampão de Krebs Henseleit com 400 ml de 10x tampão de NaHCO3. Adicionar água ultrapura suficiente para totalizar 4 L. Dissolver glicose e ácido octanóico, sob agitação. Filtrar através de filtro de 0,8 um.
- Faça 10x buffers de ações.
- Sistema de preparar-se para o coração.
- Adicionar 2 L de tampão de filtrado para um frasco de 4 L 38 colocado em cima da torneira de passagem ligado à cânula aórtica. Isto irá proporcionar uma pressão de perfusão de 70-80 mmHg para o coração, que é a pressão de perfusão recomendado 4.
- Insira gás dispersão bubbler para o buffer na garrafa.
- Execute o tampão através do sistema, tendo a certeza de eliminar quaisquer bolhas de dentro da tubulação.
- Ligue gás (95% de O2 / 5% de CO 2), pelo menos, 30 min antes do coração está a ser colocado no sistema. Use uma sonda de fluxo de gás e analisador de gases de sangue para verificar a saturação de oxigênio.
- Preparar material cirúrgico e balão.
- Para a colheita de coração, prepare um par de tesouras cirúrgicas 6,75 ", um par de 4.5" tesouras, dois pares de hemostats, dois conjuntos de fórceps caramalt, duas seringas com agulhas de 27 G, 2 peças de 0-medidor fio de seda (cerca de 15 cm de comprimento), uma cânula farpado 1/16 polegadas, e uma cânula traqueal.
- Para montar cânula traqueal, colar um pequeno pedaço de 1/16 de polegada de diâmetro tubo de plástico a um conector Y.
- Para montar aparelhos balão: anexar uma agulha gavagem a uma peça de 1/16 de polegada tubulação, em seguida, anexar a tubulação para habitação transdutor de pressão. Uma pequena seringa ligada ao outro lado da pressão transducer habitação vai permitir que a inflação ea deflação do balão.
- Corte um quadrado de envoltório e local ponta de plástico de uma agulha gavage no centro. Envolva o envoltório de plástico em torno da agulha por sonda.
- Encha o balão com soro fisiológico e amarrar com duas suturas. Inflar balão para garantir que não haja vazamentos. O volume de solução salina dentro do balão inflado deve ser de aproximadamente 200 ul, mas pode variar dependendo do tamanho do rato.
- Como alternativa, use um berço dedo de látex no lugar do plástico. Coloque agulha gavage dentro dedo berço, encha com solução salina e amarrar.
2. Colheita do coração
- Contenha um rato Sprague Dawley utilizando um decapicone ou outro dispositivo de segurança manual. Pesar rato.
- Administrar cetamina / mistura de xilazina (0,85 mg / kg de cetamina e 0,15 mg / kg de xilazina) através de injecção intraperitoneal para anestesiar ratos. Esta dose de anestésico irá fornecer suficientes para anestesia20-40 min, mas o procedimento deve ser concluído o mais rapidamente possível após a anestesia é confirmada.
- Confirme grau adequado de anestesia pelo teste toe pitada reflexo.
- Traqueotomia
- Retirar pele de meados de forepaw à base de mandíbula, utilizando hemostats para elevar pele e tesoura para fazer incisão. Manter a pele elevada para separá-lo do músculo subjacente, permitindo que um corte ao longo da pele e removê-lo.
- Usando hemostats, levante o tecido glandular e fazer uma incisão horizontal na fáscia inferior ao tecido glandular. Use hemostats para espalhar incisão aberta, tomando cuidado para não nick as veias jugulares.
- Usando pinças hemostáticas, músculo sobrejacente pitada traqueia, e usando uma tesoura fazer uma incisão transversal no músculo logo abaixo da ponta das pinças hemostáticas. Usando pinças hemostáticas, espalhar tecido para além de revelar traqueia.
- Insira com cuidado hemostats sob traquéia, limpando fáscia enquanto progredindo suavemente avançar e recuar hemostats.
- Uma vez hemostats são colocados com sucesso por trás da traquéia, beliscar 0-0 sutura de seda com hemostats e hemisect a traqueia com um pequeno par, de tesoura afiada.
- Insira cânula traqueal na traquéia hemisected, puxe sutura por trás da traquéia, e amarrar a sutura ao redor da traqueia canulada, ancorando a sutura com o Y-virilha da cânula com um nó cirurgiões.
- Usando uma agulha de 27 G, injectar 1.000 U / kg de heparina na veia jugular e permitir a circular durante 30 seg.
- Toracotomia
- Retirar pele de meados de abdômen para região mid-pata dianteira por compressão com hemostats e corte com tesoura.
- Adicione uma incisão transversal ¾ de polegada na parede muscular abdominal, imediatamente abaixo do diafragma.
- Faça uma incisão vertical até a parede a parede abdominal e torácica, cortando ao longo do esterno.
- Corte o diafragma volta bilateralmente, em seguida, espalhar caixa torácica para revelar coração, ribcage braçadeira com hemostats para garantir que ele permanece spread. Usando hemostats, remova gentilmente timo, expondo a aorta ascendente.
- Tease hemostats através de loop aórtica, avançar e recuar hemostats e gentilmente espalhando fascia para permitir ponta de hemostats completamente.
- Use hemostats para puxar 0-0 sutura de seda por trás da aorta ascendente, amarre sutura em um meio-quadrado nó frouxo.
- Virar a torneira para iniciar o fluxo de tampão de perfusão, hemisect aorta e imediatamente inserir uma cânula para lúmen da aorta. Rapidamente apertar um nó meia-quadrado e completar o nó, apertando bem.
- Use a tesoura para dissecar coração longe dos grandes vasos, remova coração do peito e fixe a coluna de perfusão.
- Corte o excesso de tecido pulmonar e permitir que o coração se equilibrar em coluna por cerca de 15 min antes da inserção de balão. Usar uma taxa de fluxo normal do tampão por meio de coração de 10-20 ml / min.
3. Langendorff de perfusão e isquemia-reperfusão Lesão
- Colocação de pré LVssure balão
- Desinflar o balão ao rolar em forma de cone e vire torneira para garantir balão continua a ser esvaziado.
- Excise átrio esquerdo com um pequeno par de tesouras para expor o acesso à válvula mitral.
- Insira balão através do átrio esquerdo e da válvula mitral em ventrículo esquerdo.
- Inicie o software de monitoramento de pressão (LabChart Pro).
- Encher o balão através da abertura de válvula e suavemente o aumento da quantidade de solução salina em balão até que a pressão diastólica leitura de micromanómetro excede zero.
- Para verificar a resposta comprimento-tensão, inflar o balão lentamente a uma pressão diastólica de 75 mmHg, desinflar lentamente, repetir uma vez.
- Regule a pressão diastólica de 10 mm Hg através da modulação da quantidade de solução salina no balão. Vire torneira para selar balão a este nível de inflação, e manter sistema de pressão fechado entre balão LV e transdutor de pressão.
- Lower coração em câmara câmara ea tampa aquecida com plástico.
- De Anúnciosministração de isquemia-reperfusão Lesão
- Ligue o fundo da câmara de aquecimento e câmara de permitir a encher-se com tampão de Effused.
- Quando o buffer tenha submergido coração, virar a torneira para parar o fluxo de tampão para o coração, induzindo isquemia global. Tempo de isquemia pode variar de acordo com os objetivos do experimento.
- Após 30 min de isquemia, virar a torneira para restaurar o fluxo de tampão para o coração, o início da reperfusão.
- Permitir reperfusão do coração durante 1 hora antes de terminar o experimento. Use tempos de reperfusão variáveis, dependendo dos objetivos do experimento.
- Rescisão de Experiência e de colheita de Tissue
- Usando a porta lateral de torneira, administrar 10 ml de solução salina tamponada com fosfato a 4 ° C para o coração a uma taxa de 10 ml / min para parar o coração.
- Remover coração da coluna perfusão, aparar restante tecido atrial.
- Coloque coração em uma matriz de tecido corte de aço inoxidável, cubra com Parafilm, e colocar a -80 ° C durante 8 minutos, ou até que o coração tem uma consistência como marshmallows.
- Remova o bloco do freezer e coloque razorblades em cortar matriz de cortar o coração em fatias de 2 mm. Blocos de tecido também pode ser comprado com outros que 2 mm tamanhos fatia.
- Remover fatias um de cada vez e soltar em nitrogênio líquido a piscar congelar por estudos bioquímicos. Reter a fatia ventricular terceira a partir do ápice para a coloração do enfarte.
- Remover o tecido a partir de azoto líquido e armazenar a -80 ° C até à utilização em experiências bioquímicas.
- Enfarte Coloração
- Incubar a terceira fatia ventricular em 10 mL de 1% w / v de cloreto de trifeniltetrazólio (TTC) a 37 ° C durante 15 min.
Nota: A incubação no TTC pode ser realizada durante 15 ou 30 min, sem qualquer alteração na eficácia 15. - Transferir fatia de tecido de TTC a 10% de formalina tamponada e deixa-se incubar à temperatura ambiente durante a noite. Para melhores resultados, ouvirts deve ser retirado de formalina e fotografada dentro de 24 horas 4.
- Fotografia manchado fatia e uso de software como o ImageJ para estimar o tamanho do infarto de acordo com o protocolo do fabricante. Tirar fotografias, logo que possível após a sua fixação, como o corante vai desaparecer com o tempo.
- Incubar a terceira fatia ventricular em 10 mL de 1% w / v de cloreto de trifeniltetrazólio (TTC) a 37 ° C durante 15 min.
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Representative Results
O aparelho de balão do ventrículo esquerdo permite a monitorização em tempo real da pressão desenvolvida pela entidade ventrículo esquerdo (Figura 1). Como descrito anteriormente 7, este traçado da pressão pode ser usado para calcular muitos dos parâmetros da função ventricular. Estes cálculos podem ser realizados na fase de linha de base, bem como a fase de reperfusão, em média, em traços múltiplos dentro de cada grupo, e comparadas a fim de determinar se a intervenção farmacológica resultou no pré-condicionamento cardíaco, como fizemos previamente 9. Um tal parâmetro é a pressão desenvolvida, calculado como a diferença entre a pressão sistólica e a pressão diastólica final. A pressão desenvolvida nos corações perfundidos em ratos normais podem variar 70-130 mmHg (Figura 1A). Após um insulto isquémico, a pressão desenvolvida é reduzido e as eleva a pressão diastólica final (Figura 1B). Quando os ratos sãoadministrado um agente de pré-condicionamento conhecido como a classe I e IIb inibidor HDAC SAHA (vorinostat) 18 antes da excisão do coração, a redução da pressão desenvolvida e a elevação da pressão diastólica final associada com lesão por isquemia-reperfusão são atenuadas (Figura 1C). Outras medidas da função ventricular esquerda, tal como a taxa de geração de pressão (dP / dt max), a taxa de relaxamento da pressão (-dP / dt max), e a taxa de pressão do produto (PPR) pode ser obtido directamente ou calculada a partir da saída do software (Figura 2). A fase isquêmica também podem ser monitorados em tempo real, com a cessação aparente de geração de pressão a poucos minutos do início da isquemia. Contracção isquémica também podem ser monitorizada medindo o tempo até ao início da contracção e o tempo para o pico de contração.
Cloreto Trifeniltetrazólio (TTC) é comumente usado para diferenciar entre um metabolicamentective e tecido inactiva, e é utilizado aqui para a coloração do enfarte. Uma vez absorvido pelo tecido TTC é reduzida por enzimas metabólicas, tornando o tecido vermelho activo. Inactiva tecido não reduz TTC, e como tal irá manchar branco 8. Langendorff perfundido corações de ratos que não tenham sido submetidos a lesões isquémicas não mostram quaisquer áreas em branco (não mostrados), enquanto os corações sujeitos a isquemia reperfusão mostram áreas substanciais coradas branco, indicando tecido enfartado (Figura 3).
Figura 1: traços de pressão representativos do ventrículo esquerdo balão de pressão registrada pelo balão LV sobre a contração ventricular.. Corações não submetidos à isquemia (A) experimentam uma menor perda de capacidade contrátil ao longo do tempo. Corações submetidos à isquemia (B) mostram immedperda iate de geração de pressão, seguido de contração tônica. Após reperfusão, estes corações experimentar EDP elevada e diminuição da pressão desenvolvida. Corações pré-condicionadas com SAHA e submetidos a isquemia (C) mostram a atenuação da lesão por isquemia-reperfusão. N = 1 por grupo.
Figura 2: Calculado parâmetros de função ventricular taxa de geração de pressão (A), a taxa de relaxamento de pressão (B), pressão desenvolvida (C), e do produto frequência pressão (D) são alguns parâmetros da função ventricular que podem ser calculados a partir da. software de monitoramento de pressão.
Figura 3: coloração TTC para a área do enfarte.
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Discussion
O coração perfundido isolado de rato pode ser utilizado com êxito para estudar o efeito da intervenção farmacológica no pré-condicionamento cardíaco em lesão de reperfusão de isquemia 9. No entanto, existem alguns passos essenciais para o procedimento que deve ser normalizados, a fim de assegurar a reprodutibilidade dos resultados. A manutenção de uma temperatura de 37,4 ° C no interior do sistema é crítica, já que mesmo a hipotermia e hipertermia pode causar pré-condicionamento cardíaco 10,11. O tempo total decorrido desde a injecção de anestésico para a excisão do coração deve ser mantido a um mínimo, como a exposição prolongada a cetamina pode interferir com o pré-condicionamento cardíaco 12. Canulação atempada da aorta in situ é essencial para prevenir o desenvolvimento de hipoxia no interior do coração ou a exsanguinação do animal antes da excisão do coração. Em geral, o tempo da primeira incisão para remoção do coração não deverá exceder 6-8 min ser. Os ba do ventrículo esquerdolloon deve ser verificado se há vazamentos antes de cada experimento, e substituído, se necessário. O sistema tem de ser cuidadosamente mantido, incluindo rubor todo o aparelho com água destilada e depois de cada corrida substituindo tubagem desgastada como necessário para evitar fugas ou a contaminação do interior do tubo.
O coração isolado pode ser modificada para qualquer número de novas utilizações, incluindo imagens de fluorescência 13, espectroscopia de RMN de 7, e mapeamento óptico 14, entre muitos outros. O sistema também pode ser modificada para perfundir corações de diferentes animais, incluindo ratinhos. Esta modificação é particularmente útil pois permite experiências utilizando ratinhos transgénicos. Para modificar o sistema para corações de rato, menor cânulas de perfusão e uma coluna mais pequena deve ser utilizado, para além de outras modificações. Descrições detalhadas de como utilizar o método de Langendorff para corações do rato têm sido publicados em outros lugares 16,17. Outras modificaçõeseste protocolo inclui a administração de vários medicamentos a diferentes pontos de tempo. Ao investigar a capacidade de um fármaco para provocar o pré-condicionamento farmacológico ou pós-condicionado, é essencial para administrar o fármaco a diferentes pontos de tempo em relação à lesão por isquemia-reperfusão. O fármaco pode ser administrado ao animal antes do coração é excisado, ou misturado com o tampão quer antes do coração é colocado na coluna ou durante a fase de isquemia, de modo que o fármaco está presente após a reperfusão. Alternativamente, um porta-lado pode ser utilizado para administrar um bólus de droga em qualquer ponto de tempo durante o protocolo. Adicionalmente, o protocolo pode ser modificado para alterar a duração da isquemia, reperfusão, ou ambos. Isto permite que a análise dos dados funcionais e bioquímicos em vários pontos de tempo e pode ser usado para controlar o decurso de tempo do efeito agudo de uma droga. Se o período de reperfusão é alterada, é importante observar que, pelo menos, 60 minutos de reperfusão são necessary para a coloração de TTC eficazmente para delinear a área do enfarte 15.
A principal limitação do modelo de coração isolado em termos de lesão por isquemia-reperfusão, é que não tem em conta muitos dos factores sistémicos que estão presentes no ambiente de isquemia-reperfusão in vivo. Esta eliminação da influência sistêmica devem ser contabilizados na análise de dados gerados usando o modelo de Langendorff, mas não exclui a capacidade do modelo para responder a novas perguntas sobre a resposta de miócitos, fibroblastos e células endoteliais à isquemia e reperfusão subsequente. O modelo de coração isolado permite a manipulação completa de muitas das variáveis que afectam a lesão de reperfusão de isquemia, em complemento da análise dos efeitos funcionais do coração ao longo de intervalos de tempo curtos tempo real. Os dados gerados usando o sistema de coração isolado é de valor inestimável para a compreensão da pré-condicionamento farmacológico ou pós-condicionamento docoração, em resposta a várias intervenções farmacêuticas.
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Acknowledgments
Esta publicação foi apoiada pela Pesquisa Clínica e Translacional (SCTR) Institute Carolina do Sul, com uma casa acadêmico na Universidade de Medicina da Carolina do Sul, NIH / NCATS Grant Número UL1 TR000062. Um apoio adicional foi fornecida pela VA prémio de mérito BX002327-01 de DRM. DJH foi apoiado pelo NIH / NCATS Grant Número TL1 TR000061 e pelo NIH Grant Número T32 GM008716. SEA foi apoiado pelo NIH Grant Número T32 HL07260.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P9541 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma Aldrich | 203726 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | RES20765-A7 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma Aldrich | C8106 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| Octanoic Acid | Sigma Aldrich | C2875 | |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride | Sigma Aldrich | T8877 | |
| Medical Pressure Transducer | MEMSCAP | SP844 | |
| Masterflex Peristaltic Pump | Cole Parmer | EW-07521-40 | |
| Masterflex Easy Load Pump Head | Cole Parmer | EW-07518-10 | |
| Heated circulating water bath | Lauda | M3 | |
| Tubing Flow Module | Transonic | TS410 | |
| Modular Research Console | Transonic | T402 | |
| Inline flow sensor | Transonic | ME2PXN | |
| PowerLab Data Acquisition Device | AD Instruments | PL3508 | |
| LabChart data acquisition software | AD Instruments | MLU60/8 |
References
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