Introduction
Élucidation des événements sous-jacents de la réponse cardiaque à la fois à l'ischémie et la reperfusion sont essentiels pour améliorer le traitement des infarctus 1 et cardiaques procédures chirurgicales qui nécessitent du myocarde clampage aortique 2. Alors que les modèles in vivo d'une lésion de reperfusion d'ischémie permettent une analyse de point de terminaison très utiles, ils ne sont pas aussi efficaces pour étudier les effets fonctionnels de la lésion de reperfusion d'ischémie aiguë en temps réel. En outre, dans les modèles d'ischémie reperfusion vivo produisent généralement la variabilité significative de la taille de l'infarctus, et la livraison directe de médicaments au cœur au moment de la reperfusion est difficile. L'utilisation d'un système de cœur isolé de Langendorff pour l'étude des lésions d'ischémie de reperfusion permet une évaluation fonctionnelle en temps réel des traitements pharmacologiques, zone uniforme de tissu infarci et livraison instantanée du médicament directement dans le myocarde.
D'abord décrit by Langendorff Oscar en 1895 3, au coeur de Langendorff isolé est un modèle robuste pour étudier les lésions de reperfusion d'ischémie, après avoir été utilisé dans la recherche de reperfusion d'ischémie pendant les 40 dernières années 4,5. Ici, quelques modifications sont apportées pour optimiser le coeur isolé pour l'analyse fonctionnelle. Dans cathétérisme situ de l'aorte alors que le cœur bat assure que le cœur ne connaît pas le préconditionnement ischémique, qui pourrait altérer les résultats des essais ischémie reperfusion 6. Pour faciliter cela, une trachéotomie est réalisée, ce qui permet la ventilation et assurer la stabilité physiologique du rat au cours de la chirurgie. Le cœur est ensuite fixé à une colonne à chemise d'eau en spirale à travers laquelle le verre tampon Krebs Henseleit est envoyé par perfusion rétrograde directement dans l'aorte. Un ballon rempli de solution saline est introduite dans le ventricule gauche et fixé à un transducteur de pression, ce qui permet la mesure du temps réel de la pression de l'intérieur de l'un ventriculed calcul des paramètres fonctionnels multiples. À la fin de l'expérience, le cœur est rincée avec une solution saline froide pour arrêter la contraction et le flash congelés dans l'azote liquide pour permettre une analyse en aval du taux d'ADN, ARN et de protéines. Ainsi modifié, le cœur de Langendorff perfusé sert d'un système efficace pour la surveillance directe de l'effet physiologique des interventions pharmacologiques à tout moment aiguë au cours de la lésion d'ischémie reperfusion.
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Protocol
Toutes les procédures énumérés ici ont été approuvés par le Comité de protection des animaux et l'utilisation institutionnelle à l'Université médicale de Caroline du Sud. Les expériences décrites ici sont, des expériences non-survie aigus. En tant que tel, il n'y a aucune utilisation de pommade ophtalmique et un bloc opératoire stérile est pas nécessaire. L'euthanasie est obtenu par saignée pendant la récolte du cœur.
1. Préparation expérimentale
- Mettre en place soit une pression constante ou un débit constant perfusion de Langendorff Appareil 4.
- Préparer 4 litres de tampon de Krebs-Henseleit modifiée (en mM: NaCl 112, KCl 5, 1,2 MgSO 4, 1 K 2 HPO 4, CaCl2 1,25, NaHCO 3 25, 11 D-glucose, l'acide octanoïque 0,2, pH = 7,4).
- Assurez 10x actions tampons.
- Dissoudre NaCl, KCl, MgSO 4 et K 2 HPO 4 dans 3 L d'eau ultrapure.
- Dissoudre CaCl2 dans 500 ml d'eau ultra pure wie 40 ml de HCl 1 N.
- Ajouter lentement solution de CaCl 2 à la mémoire tampon réalisés dans 1.2.1.1. Ajouter de l'eau ultra pure assez pour totalisera 4 L. permettent de remuer pendant 1 heure avant de filtrer à travers un filtre de 0,8 um. Conserver à 4 ° C.
- Dissoudre NaHCO 3 à 4 L d'eau ultra-pure. Laisser agiter pendant 1 heure avant de filtrer à travers à 0,8 um filtre. Conserver à 4 ° C
- Mélanger 400 ml 10x tampon de Krebs Henseleit avec 400 ml 10x tampon NaHCO 3. Ajouter suffisamment d'eau ultra-pure à totalisera 4 L. Dissoudre le glucose et l'acide octanoïque, tout en agitant. Filtrer à travers 0,8 um filtre.
- Assurez 10x actions tampons.
- Préparez-vous pour le système cardiaque.
- Ajouter 2 L de tampon filtré à un 4 L bouteille placé 38 en dessus du robinet fixé à la canule aortique. Cela donnera une pression de perfusion de 70-80 mmHg au cœur, qui est la pression de perfusion recommandé 4.
- Insérez dispersion barboteur de gaz dans la mémoire tampon dans la bouteille.
- Exécutez le tampon à travers le système, en étant sûr d'éliminer les bulles à l'intérieur du tube.
- Activer le gaz (95% O 2/5% CO 2) d'au moins 30 min avant de cœur doit être placé sur le système. Utilisation d'une sonde d'écoulement de gaz et l'analyseur de gaz de sang pour vérifier la saturation en oxygène.
- Préparer fournitures chirurgicales et ballon.
- Pour la récolte de cœur, de préparer une paire de 6,75 "ciseaux chirurgicaux, une paire de 4.5" ciseaux, deux paires de pinces hémostatiques, deux ensembles de pince caramalt, deux seringues avec 27 g d'aiguilles, 2 morceaux de 0-jauge suture de soie (environ 15 cm de longueur), une canule à barbillons 1/16 de pouce, et une canule trachéale.
- Pour assembler canule trachéale, coller un court morceau de tuyau en plastique de diamètre 1/16 pouces à un connecteur en Y.
- Pour assembler un appareil de ballon: fixer une aiguille de gavage à un morceau de tuyau 1/16 de pouce, puis fixer la tuyauterie à un logement de capteur de pression. Une petite seringue fixée à l'autre côté de la pression de transducer logements permettra à l'inflation et la déflation du ballon.
- Couper un carré de la pointe de pellicule plastique et le lieu d'une aiguille de gavage dans le centre. Enveloppez la pellicule de plastique autour de l'aiguille de gavage.
- Remplissez ballon avec une solution saline et attacher avec deux points de suture. Gonflez ballon pour assurer qu'il n'y a pas de fuites. Le volume de solution saline à l'intérieur du ballonnet gonflé doit être approximativement de 200 pi, mais peut varier en fonction de la taille du rat.
- Sinon, utilisez un lit latex de doigt à la place de la pellicule de plastique. Placez aiguille de gavage dans les doigtier, remplir avec une solution saline et attacher.
2. Récolte cœur
- Retenez un rat Sprague Dawley utilisant un decapicone ou un autre dispositif de retenue manuel. Peser rat.
- Administrer la kétamine / xylazine mélange (0,85 mg / kg de kétamine et 0,15 mg / kg de xylazine) par injection intrapéritonéale à anesthésier rat. Cette dose d'anesthésique fournira anesthésie suffisantes pour20-40 min, mais la procédure devrait être achevée aussi rapidement que possible après l'anesthésie est confirmée.
- Confirmez bon degré de l'anesthésie par des tests pincement de l'orteil réflexe.
- Trachéotomie
- Retirer peau à partir de mi-patte à la base de la mâchoire, en utilisant des produits hémostatiques pour élever peau et ciseaux pour faire incision. Gardez la peau élevée à séparer du muscle sous-jacent, permettant de couper le long de la fourrure et le retirer.
- Utilisation de pinces hémostatiques, soulevez le tissu glandulaire et de faire une incision horizontale au fascia inférieur au tissu glandulaire. Utilisez des pinces hémostatiques pour répandre incision ouverte, en prenant soin de ne pas entailler les veines jugulaires.
- Utilisation de pinces hémostatiques, pincée muscle recouvrant la trachée et l'aide de ciseaux font une incision transversale dans le muscle juste en dessous de la pointe des pinces hémostatiques. Utilisation de pinces hémostatiques, répartis tissu pour révéler la trachée.
- Insérez soigneusement hémostatiques dans la trachée, de compensation fascia tout en progressant par doucement avancer et reculer hémostatiques.
- Une fois hémostatiques sont placés avec succès derrière la trachée, pincez 0-0 suture de soie avec des pinces hémostatiques et hemisect la trachée avec une petite paire, de ciseaux.
- Insérez canule trachéale dans la trachée hemisected, tirez suture derrière la trachée, et attacher la suture autour de la trachée canule, l'ancrage de la suture à la Y-aine de la canule avec un noeud de chirurgiens.
- En utilisant une aiguille 27 G, injecter 1 000 U / kg d'héparine dans la veine jugulaire et laisser circuler pour 30 sec.
- Thoracotomie
- Retirer fourrure provenant milieu de l'abdomen à la région mi-patte en pinçant avec pinces hémostatiques et couper avec des ciseaux.
- Faire un ¾ de pouce transversale incision dans la paroi musculaire abdominale, juste en dessous du diaphragme.
- Faire une incision verticale sur le mur de la paroi abdominale et la poitrine, coupe le long du sternum.
- Coupez le diaphragme retour bilatéralement, puis étaler la cage thoracique pour révéler coeur, pince cage thoracique avec des pinces hémostatiques pour assurer qu'il demeure propagation. Utilisation de pinces hémostatiques, retirez délicatement le thymus, exposer l'aorte ascendante.
- Taquiner hémostatiques dans la boucle de l'aorte, avancer et reculer hémostatiques et doucement propagation fascia pour permettre pointe de pinces hémostatiques travers.
- Utilisez des pinces hémostatiques pour tirer 0-0 soie suture derrière l'aorte ascendante, ligaturer dans un demi-carré noeud lâche.
- Tournez le robinet pour commencer flux de tampon de perfusion, hemisect aorte et l'insérer immédiatement la canule dans la lumière de l'aorte. Rapidement sangler un nœud de demi-carré et compléter le noeud, serrer à fond.
- Utilisez des ciseaux à disséquer coeur loin des gros vaisseaux, retirez le cœur de la poitrine et l'attacher à la colonne de perfusion.
- Coupez le tissu pulmonaire excès et permettre cœur à équilibrer sur la colonne pendant environ 15 minutes avant l'insertion de ballon. Utiliser un débit normal de tampon à travers le cœur de 10-20 ml / min.
3. perfusion de Langendorff et l'ischémie-reperfusion
- Placement de LV préssure ballon
- Dégonfler ballon tout en roulant en forme de cône et tourner le robinet pour assurer ballon reste dégonflé.
- Accise oreillette gauche avec une petite paire de ciseaux pour exposer l'accès à la valve mitrale.
- Insérez ballon à travers l'oreillette gauche et la valve mitrale dans le ventricule gauche.
- Lancer le logiciel de surveillance de la pression (LabChart Pro).
- Gonflez ballon en ouvrant le robinet et doucement une quantité croissante de solution saline en ballon jusqu'à la pression diastolique de micromanomètre dépasse zéro.
- Pour vérifier la réponse longueur-tension, gonfler ballon lentement à une pression diastolique de 75 mmHg, dégonfler lentement, répéter une fois.
- Régler la pression diastolique de 10 mmHg en modulant la quantité de solution saline dans le ballon. Tournez le robinet pour sceller ballon à ce niveau de l'inflation, et de maintenir le système de pression fermée entre LV ballon et capteur de pression.
- Basse coeur dans la chambre de la chambre et le couvercle chauffé avec du plastique.
- Annonceministère de l'ischémie-reperfusion
- Branchez le fond de la chambre chauffée et permet de remplir la chambre avec un tampon épanché.
- Lorsque le tampon a submergé coeur, tourner le robinet pour arrêter l'écoulement de tampon dans le cœur, induisant une ischémie globale. temps d'ischémie peut varier en fonction des objectifs de l'expérience.
- Après 30 min d'ischémie, tourner le robinet pour restaurer le flux de tampon dans le cœur, initiant reperfusion.
- Autoriser la reperfusion du coeur pendant 1 heure avant de terminer l'expérience. Utilisez des temps de reperfusion variables, en fonction des objectifs de l'expérience.
- Résiliation de l'expérience et de récolte de tissus
- Utilisation du port de côté du robinet, administrer 10 ml de solution saline tamponnée phosphate à 4 ° C dans le cœur à un taux de 10 ml / min pour arrêter le coeur.
- Retirer le cœur de la colonne de perfusion, rogner tissu auriculaire restant.
- Placez coeur dans une matrice de découpage de tissu en acier inoxydable, couvrir avec Parafilm, et le lieu à -80 ° C pendant 8 minutes, ou jusqu'à ce que le coeur a une consistance de guimauve-like.
- Retirer le bloc du congélateur et insérer des lames de rasoir dans le tranchage matrice pour découper coeur en tranches de 2 mm. blocs de tissus peuvent également être achetés avec des tranches dimensions autres que 2 mm.
- Retirer les tranches une à la fois et déposez-les dans de l'azote liquide à clignoter geler pour les études biochimiques. Conserver la troisième tranche ventriculaire du sommet pour l'infarctus coloration.
- Retirer le tissu de l'azote liquide et conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation dans des expériences biochimiques.
- Infarctus coloration
- Incuber la troisième tranche ventriculaire dans 10 ml de 1% p / v de chlorure de triphényltétrazolium (TTC) à 37 ° C pendant 15 min.
Note: Incubation dans TTC peut être réalisée pour 15 ou 30 minutes, sans modification de 15 l'efficacité. - Transfert tranche de tissu à partir de TTC à 10% de formaline tamponnée et laisser incuber à la température ambiante pendant une nuit. Pour des résultats optimaux, entendrets doivent être prises hors de formol et imagés dans les 24 heures 4.
- Taché logiciel de tranche et de l'utilisation de Droits tel que ImageJ pour estimer la taille de l'infarctus selon le protocole du fabricant. Prenez des photos dès que possible après la fixation, comme le colorant va disparaître au fil du temps.
- Incuber la troisième tranche ventriculaire dans 10 ml de 1% p / v de chlorure de triphényltétrazolium (TTC) à 37 ° C pendant 15 min.
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Representative Results
L'appareil ventriculaire gauche ballon permet un suivi en temps réel de la pression développée par le pouvoir ventricule gauche (Figure 1). Comme décrit précédemment 7, cette trace de pression peut être utilisée pour calculer un grand nombre de paramètres de la fonction ventriculaire. Ces calculs peuvent être effectués dans la phase initiale, ainsi que la phase de reperfusion, moyennées sur plusieurs traces à l'intérieur de chaque groupe, et on les compare afin de déterminer si l'intervention pharmacologique entraîné préconditionnement cardiaque, comme nous l'avons déjà fait neuf. Un tel paramètre est la pression développée, calculé comme la différence entre la pression systolique et la pression diastolique finale. La pression développée dans des cœurs de rats perfuses normales peut aller de 70 à 130 mm Hg (figure 1A). Après une insulte ischémique, la pression développée est réduite et les Élève de pression diastolique finaux (figure 1B). Lorsque les rats sontadministré un agent de préconditionnement connu comme la classe I et IIb HDAC inhibiteur SAHA (vorinostat) 18 avant l'excision du coeur, la réduction de la pression développée et l'élévation de fin pression diastolique associée à des lésions d'ischémie-reperfusion sont atténuées (figure 1C). Autres mesures de la fonction ventriculaire gauche, tels que le taux de génération de pression (dP / dt max), le taux de détente de pression (-dP / dt max), et le produit de la pression des taux (RPP) peuvent être obtenues directement ou calculées à partir de la sortie logicielle (figure 2). La phase ischémique peut également être surveillé en temps réel, avec la cessation apparente de génération de pression à quelques minutes du début de l'ischémie. Contraction ischémique peut également être surveillée en mesurant le temps d'apparition de contraction et le temps au pic de contraction.
chlorure de triphényltétrazolium (TTC) est couramment utilisé pour différencier entre un métaboliquementctive et le tissu inactif, et est utilisé ici pour infarctus coloration. Une fois absorbé dans le tissu TTC est réduite par les enzymes métaboliques, tournant le rouge de tissu actif. Tissu inactif ne réduit pas TTC, et en tant que telle tache blanche 8. Langendorff perfusé des coeurs de rats qui ne sont pas soumis à une lésion ischémique ne présentent pas de zones blanches (non représentés), tandis que les coeurs soumis à d'importantes zones d'ischémie reperfusion montrent colorées blanc, indiquant tissu infarci (Figure 3).
Figure 1: traces de pression représentatif de la pression ventriculaire gauche ballon enregistrée par le LV ballon sur la contraction ventriculaire.. Coeurs pas soumis à une ischémie (A) subissent une perte mineure de la capacité contractile au fil du temps. Coeurs soumis à une ischémie (B) montrent immediate perte de la génération de pression, suivie par la contraction tonique. Sur reperfusion, ces cœurs éprouvent EDP élevée et une diminution de la pression développés. Coeurs préconditionnés avec SAHA et soumis à une ischémie (C) montrent une atténuation des lésions d'ischémie reperfusion. N = 1 par groupe.
Figure 2: Calculé paramètres de la fonction ventriculaire taux de génération de pression (A), le taux de détente de pression (B), de la pression développée (C), et le produit de la pression des taux (D) sont des paramètres de la fonction ventriculaire qui peuvent être calculés à partir de la. logiciel de surveillance de la pression.
Figure 3: coloration TTC pour la zone de l'infarctus.
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Discussion
Le coeur de rat isolé perfusé peut être utilisé avec succès pour étudier l'effet de l'intervention pharmacologique sur préconditionnement cardiaque dans l'ischémie reperfusion 9. Cependant, il ya certaines étapes essentielles de la procédure qui doit être normalisée afin d'assurer des résultats reproductibles. Le maintien d'une température de 37,4 ° C dans le système est critique, car même une légère hypothermie et l'hyperthermie peuvent provoquer préconditionnement cardiaque 10,11. Le temps total écoulé depuis l'injection d'anesthésique à l'excision du cœur doit être maintenue à un minimum, car une exposition prolongée à la kétamine peut interférer avec préconditionnement cardiaque 12. Canulation en temps opportun de l'aorte in situ est essentiel pour prévenir le développement de l'hypoxie dans le cœur ou l'exsanguination de l'animal avant de coeur excision. Dans l'ensemble, le temps de la première incision pour l'ablation du cœur ne doit pas être plus long que 6-8 min. Les ba ventriculaire gauchelloon doit être vérifiée pour des fuites avant chaque expérience, et remplacé si nécessaire. Le système doit être méticuleusement entretenu, y compris le rinçage de la totalité de l'appareil avec de l'eau distillée après chaque course et le remplacement des tubes usés comme nécessaire pour éviter les fuites ou la contamination de l'intérieur du tube.
Le cœur isolé peut être modifié pour un certain nombre de nouvelles utilisations, y compris l'imagerie de fluorescence 13, la spectroscopie RMN 7, et la cartographie optique 14 parmi beaucoup d'autres. Le système peut également être modifié pour perfuser cœurs de différents animaux, y compris les souris. Cette modification est particulièrement utile car il permet pour des expériences utilisant des souris transgéniques. Pour modifier le système pour les cœurs de souris, des canules inférieure et une colonne de perfusion plus faible doit être utilisée, en plus d'autres modifications. Des descriptions détaillées de la façon d'utiliser la méthode de Langendorff pour les cœurs de souris ont été publiés ailleurs 16,17. D'autres modifications dece protocole comprend l'administration de divers médicaments à différents points dans le temps. Lorsque l'on étudie la possibilité d'un médicament pour provoquer préconditionnement pharmacologique ou post-conditionnement, il est essentiel d'administrer le médicament à différents points de temps par rapport à la blessure de reperfusion d'ischémie. Le médicament peut être administré à l'animal avant de le coeur est excisé, ou mélangé dans le tampon, soit avant que le cœur est placé sur la colonne ou ischémique au cours de la phase de sorte que le médicament est présent à une reperfusion. En variante, un orifice latéral peut être utilisé pour administrer un bolus de médicament à n'importe quel point dans le temps au cours du protocole. En outre, le protocole peut être modifié pour modifier la durée de l'ischémie, la reperfusion, ou les deux. Ceci permet à l'analyse des données fonctionnelles et biochimiques à de multiples points de temps et peut être utilisé pour suivre l'évolution dans le temps de l'effet aigu d'un médicament. Si la période de reperfusion est modifiée, il est important de noter qu 'au moins 60 minutes de reperfusion sont necessaire pour TTC coloration pour délimiter efficacement la zone de l'infarctus 15.
La principale limite du modèle de coeur isolé en termes de blessure de reperfusion d'ischémie est qu'elle ne tient pas compte de la plupart des facteurs systémiques qui sont présents dans le cadre de l'ischémie reperfusion in vivo. Cette élimination de l'influence systémique doit être pris en compte dans l'analyse des données générées en utilisant le modèle de Langendorff, mais ne fait pas obstacle à la capacité du modèle à répondre à de nouvelles questions sur la réponse des myocytes, les fibroblastes, les cellules endothéliales et à l'ischémie et la reperfusion ultérieure. Le modèle de coeur isolé permet une manipulation complète d'un grand nombre de variables qui influent sur l'ischémie reperfusion, en plus de l'analyse en temps réel des effets fonctionnels sur le coeur sur des intervalles de temps courts. Les données générées par l'utilisation du système cardiaque isolé est inestimable pour comprendre le préconditionnement pharmacologique ou post-conditionnement de lacoeur en réponse à diverses interventions pharmaceutiques.
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Acknowledgments
Cette publication a été soutenue par la recherche clinique et translationnelle (SCTR) Institut Caroline du Sud, avec un foyer universitaire à l'Université médicale de Caroline du Sud, NIH / RNTAC Grant Nombre UL1 TR000062. Un soutien supplémentaire a été fourni par VA prix du mérite BX002327-01 de DRM. DJH a été soutenue par le NIH / RNTAC Grant Nombre TL1 TR000061 et par le NIH Grant Nombre T32 GM008716. SEA a été soutenu par des subventions du NIH Nombre T32 HL07260.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P9541 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma Aldrich | 203726 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | RES20765-A7 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma Aldrich | C8106 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| Octanoic Acid | Sigma Aldrich | C2875 | |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride | Sigma Aldrich | T8877 | |
| Medical Pressure Transducer | MEMSCAP | SP844 | |
| Masterflex Peristaltic Pump | Cole Parmer | EW-07521-40 | |
| Masterflex Easy Load Pump Head | Cole Parmer | EW-07518-10 | |
| Heated circulating water bath | Lauda | M3 | |
| Tubing Flow Module | Transonic | TS410 | |
| Modular Research Console | Transonic | T402 | |
| Inline flow sensor | Transonic | ME2PXN | |
| PowerLab Data Acquisition Device | AD Instruments | PL3508 | |
| LabChart data acquisition software | AD Instruments | MLU60/8 |
References
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