Abstract
हौसले से पृथक ट्यूमर विशिष्ट endothelial कोशिकाओं (टीईसी) ट्यूमर angiogenesis के आणविक तंत्र का पता लगाने और कैंसर के लिए नई एंजियोजिनेसिस अवरोधकों को विकसित करने के लिए इन विट्रो मॉडल के रूप में काम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, murine endothelial कोशिकाओं (ईसी) की इन विट्रो विस्तार में लंबी अवधि के न होने के कारण चुनाव आयोग के साथ प्ररूपी संस्कृति में बहाव (एन्दोथेलिअल करने वाली mesenchymal संक्रमण) और संदूषण के लिए चुनौतीपूर्ण है। यह आसानी से संस्कृति में सह-शुद्ध fibroblasts या ट्यूमर कोशिकाओं द्वारा outcompeted रहे हैं, जो टीईसी के लिए विशेष रूप से सच है। इधर, कॉलोनी चयन के साथ और इन विट्रो विस्तार में युग्मित immunomagnetic संवर्धन का लाभ लेता है कि एक उच्च निष्ठा अलगाव विधि वर्णित है। यह दृष्टिकोण स्ट्रोमल या ट्यूमर कोशिकाओं को दूषित की पूरी तरह से स्वतंत्र हैं कि शुद्ध चुनाव आयोग अंशों उत्पन्न करता है। यह भी कि वंश का पता लगाया Cdh5 रचनात्मक दिखाया गया है: प्रोटोकॉल के साथ प्रयोग किया ZsGreen एल / एस / एल संवाददाता चूहों, यहाँ बताया, सेल सत्यापित करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण हैंइन चूहों से अलग चुनाव आयोग कालोनियों के रूप में पवित्रता संस्कृति में टिकाऊ और प्रतिभाशाली ZsGreen प्रतिदीप्ति दिखा।
Introduction
Endothelial कोशिकाओं (ईसी) ठोस ट्यूमर के विकास के दौरान आवश्यक हैं। प्रचार-प्रसार और दूर साइटों पर मेटास्टेसिस के बोने के लिए निष्क्रिय ट्यूमर में वाहिकाजनक स्विच की दीक्षा से, चुनाव आयोग ट्यूमर के विकास को एक बनाए रखने के लिए रक्त, ऑक्सीजन प्रदान करते हैं कि नाली, और पोषक तत्वों के रूप में। हाल ही में सुझाव दिया है, चुनाव आयोग भी छिड़काव स्वतंत्र कार्य किया है और कैंसर स्टेम कोशिकाओं और अन्य ट्यूमर stromal कोशिकाओं 2-5 के विकास का समर्थन करता है कि एक आला के रूप में। इस प्रकार, अत्यधिक ट्यूमर विशिष्ट इन विट्रो संस्कृति के लिए चुनाव आयोग (टीईसी) ट्यूमर angiogenesis और ट्यूमर कोशिकाओं के साथ पार बात मध्यस्थता उपन्यास आणविक तंत्र पर प्रकाश डाला जाएगा कि दिनचर्या कार्यात्मक अध्ययन के लिए अनुमति देता है शुद्ध।
चुनाव आयोग मूल 6 के ऊतक के आधार पर उच्च स्तरीय विशेषज्ञ हैं। कारण अलग ट्यूमर प्रकार की विषम प्रकृति और ट्यूमर microenvironment करने के लिए, टीईसी भी एक ट्यूमर विशिष्ट विशेषज्ञता ओ प्रतिबिंबित अद्वितीय विशेषताएं है कि प्रदर्शित कर सकता हैवाहिका च। उदाहरण के लिए, विभिन्न प्रकार या ट्यूमर 7.8 के ग्रेड से अलग टीईसी में जीन की अभिव्यक्ति हस्ताक्षरों में हड़ताली परिवर्तनशीलता है। हालांकि, टीईसी के साथ गैर-चुनाव आयोग, विशेष रूप से ट्यूमर जुड़े fibroblasts और ट्यूमर कोशिकाओं, के लगातार सह-शुद्धि जीनोम चौड़ा अभिव्यक्ति का विश्लेषण करती है उलझाना कर सकते हैं। इन अवांछित सेल प्रकार टीईसी संस्कृतियों के इन विट्रो विस्तार में लंबी अवधि पर निर्भर है कि पढ़ाई में विशेष रूप से समस्याग्रस्त हैं।
यहाँ वर्णित लगातार ट्यूमर और अन्य ऊतकों से शुद्ध चुनाव आयोग संस्कृतियों का उत्पादन एक उच्च निष्ठा विधि है। चुनाव आयोग भिन्न और सह शुद्ध गैर-चुनाव आयोग को हटाने की immunomagnetic स्तंभ संवर्धन के बाद, एक अतिरिक्त क्लोनिंग अंगूठी चरण 9 प्रयोग किया जाता है शुद्ध चुनाव आयोग कालोनियों पर कब्जा करने के लिए। प्रत्येक कॉलोनी गैर चुनाव आयोग को दूषित के उद्भव के बिना कई मार्ग के लिए संस्कृति में विस्तार किया जा सकता है। इस विधि को भी एंडो के अध्ययन के लिए आदर्श है जो एक भी अलगाव की प्रक्रिया से कई चुनाव आयोग क्लोन पैदावारthelial विविधता। ZsGreen एल / एस / एल संवाददाता चूहों संस्कृति 10 में ZsGreen प्रतिदीप्ति बनाए रखने के जो "भाग्य-मैप" और पक्केपन से चिह्नित चुनाव आयोग पैदा करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण हैं: इसके अलावा, यह Cdh5 रचनात्मक कि दिखाया गया है। प्रोटोकॉल को मामूली समायोजन के साथ, इस विधि अलग ट्यूमर प्रकार या सामान्य ऊतकों के लिए अनुकूल होना चाहिए।
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Protocol
निम्नलिखित प्रोटोकॉल चैपल हिल में उत्तरी कैरोलिना विश्वविद्यालय में प्रयोगशाला पशु चिकित्सा विभाग द्वारा स्थापित दिशा-निर्देशों के अनुसार किया जाता है।
1. शुरू करने से पहले निम्नलिखित सामग्री और अभिकर्मकों की तैयारी
- 400 मिलीलीटर कम ग्लूकोज का सप्लीमेंट द्वारा चुनाव आयोग मीडिया तैयार (1 जी / एल डी ग्लूकोज या एलजी) Dulbecco संशोधित 50 मिलीलीटर गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम, 5 मिलीलीटर एंटीबायोटिक कवकनाशी 50 मिलीलीटर परमाणु सीरम चतुर्थ, साथ ईगल मध्यम (DMEM), और वाणिज्यिक किट से hFGF, वीईजीएफ़, hEGF, R3-IGF-1, और हेपरिन घटकों।
- 500 मिलीलीटर FACS बफर (0.5% BSA और पीबीएस में 2 मिमी EDTA) तैयार करें; एक बाँझ 0.22 माइक्रोन फिल्टर कप के माध्यम से फिल्टर।
- जीवाणुरहित या बोर्ड विदारक कीटाणुरहित।
- विच्छेदन पिन, शल्य कैंची, और dissectors जीवाणुरहित।
2. चुनाव आयोग अलगाव दिवस (1 ~ 5 घंटा)
- कार्बन डाइऑक्साइड या अन्य तरीकों से शिकायत बुद्धि के साथ माउस euthanizeज संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) नीतियों।
नोट: आकार में बदलती एकाधिक स्तन ट्यूमर (5 - व्यास में 15 मिमी), ऐसे सी 3-टैग के रूप में एक भी आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस में विकसित टीईसी अलगाव के लिए उन सभी को फसल के लिए सुनिश्चित किया जा सकता है। एक भी चुनाव आयोग के अलगाव के लिए तीन 1 सेमी 3 ट्यूमर के लिए orthotopically चूहों में engrafted कर रहे हैं कि ट्यूमर, पूल दो का उपयोग करते हैं। यहाँ हम एक प्रदर्शन के रूप में स्तन ट्यूमर का उपयोग करें, लेकिन प्रोटोकॉल ट्यूमर के अन्य प्रकार के लिए संशोधित किया जा सकता है। - छिड़काव या 75% v / वी इथेनॉल की पर्याप्त राशि के साथ माउस उदर की ओर पोंछते द्वारा माउस कीटाणुरहित।
- एक बाँझ हुड में या एक साफ बेंच पर सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग कर कैंची और dissectors में से एक जोड़ी के साथ ट्यूमर बांटना।
- बढ़ाकर और एक विदारक बोर्ड पर चूहों के अंग पिन। पेरिटोनियम खोलने के बिना कैंची से एक midline उदर चीरा। त्वचा और ट्यूमर स्थित हैं जहां स्तन ग्रंथियों की ओर पेरिटोनियम के बीच laterally काटना।पेरिटोनियम खुला नहीं है।
- आबकारी केवल ट्यूमर स्तन ग्रंथियों से ऊतक, सामान्य स्तन हाशिये से बाहर जा रही है। ध्यान से ऐसी त्वचा और मांसपेशियों के रूप में गैर ट्यूमर ऊतकों बंद ट्रिम, और बर्फ पर एलजी DMEM के 30 मिलीग्राम से युक्त एक शंक्वाकार ट्यूब में विच्छेदित ट्यूमर जगह है।
- टिशू कल्चर हुड के ट्यूमर के नमूनों ले आओ; 2 बार - बाँझ एलजी-DMEM 1 के साथ ऊतकों को धो लें।
- एक बाँझ ऊतक संस्कृति पेट्री डिश के लिए शंक्वाकार ट्यूब से स्थानांतरण ट्यूमर, पकवान में एलजी DMEM के 2 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, और टुकड़ों में बाँझ कैंची की एक जोड़ी <5 मिमी के साथ कीमा।
- पीबीएस में, Dispase के 1 मिलीलीटर (शेयर = हांक बैलेंस्ड नमक के घोल में 2 मिलीग्राम / एमएल, HBSS इसके बाद) कोलैजिनेज़ के 5 मिलीलीटर जोड़ें (शेयर = HBSS में 2.5 यू / एमएल) और deoxyribonuclease के 75 μl (शेयर = 1 मिलीग्राम / एमएल ) पेट्री डिश में। कुल मात्रा अब ~ 10 मिलीलीटर है।
- (पूर्व निर्धारित हदबंदी जनसंपर्क एक ऊतक dissociator ट्यूब के लिए पेट्री डिश से कोलैजिनेज़ / ऊतक मिश्रण स्थानांतरण और दो बार 60 सेकंड के लिए एक ऊतक dissociator पर चलनेdissociator पर ogram: रन प्रति 1,270 कुल राउंड)। प्रकाश 37 डिग्री सेल्सियस पर 75 मिनट के लिए एक प्रकार के बरतन पर झटकों के साथ सेते हैं।
- फ़िल्टर एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब पर एक 100 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से ऊतक पच। FACS बफर के 5 एमएल के साथ कुल्ला फिल्टर किसी भी शेष कोशिकाओं को धोने के लिए। 5 मिनट के लिए 280 XG पर स्पिन और ध्यान से सेल गोली परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला महाप्राण।
- बाँझ पानी की 9 मिलीलीटर में शेयर आरबीसी lysis बफर (10x) के 1 मिलीलीटर पतला। तुरंत 10 lysis बफर (1x) के मिलीलीटर, और साथ Lyse लाल रक्त कोशिकाओं को 280 x जी पर 5 मिनट के स्पिन। नोट: थोड़ा खून दिखाई दे रहा है तो यह चरण छोड़ दिया जा सकता है।
- FACS बफर के 10 मिलीलीटर में Resuspend। Trypan नीले रंग के 10 μl के साथ सेल निलंबन के 10 μl मिश्रण है, और एक hemocytometer का उपयोग जीवित कोशिकाओं गिनती।
- ~ 10 7 कोशिकाओं / 100 μl में कोशिकाओं Resuspend। सेल निलंबन के 100 μl प्रति एफसीआर ब्लॉक के 10 μl जोड़ें, और 10 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं।
- अनुसार चूहे-विरोधी माउस पीई संयुग्मित CD31 एंटीबॉडी जोड़ें। कभी-कभी 15 मिनट और झटका ट्यूब - टेबल 1 से 10 के लिए बर्फ पर सेते हैं।
- 5 मिनट के लिए 280 XG पर ट्यूब और स्पिन करने के लिए FACS बफर के 10 मिलीलीटर जोड़ें। ध्यान से सतह पर तैरनेवाला हटाने, और FACS बफर के 5 मिलीलीटर के साथ फिर से सेल गोली धो लें। अपकेंद्रित्र गोली कोशिकाओं के लिए। परेशान सेल गोली बिना महाप्राण सतह पर तैरनेवाला।
- । 2 टेबल के अनुसार FACS बफर और विरोधी पीई microbeads जोड़ें 10 के लिए बर्फ पर सेते हैं - 15 मिनट। कभी-कभी झाड़ ट्यूब।
- 5 मिनट के लिए 280 XG पर FACS बफर और स्पिन नमूने के 10 मिलीलीटर जोड़ें; फिर FACS बफर और सेंट्रीफ्यूज के 5 मिलीलीटर के साथ एक बार धो लें। परेशान गोली बिना महाप्राण सतह पर तैरनेवाला।
- FACS बफर में 300 μl मात्रा लाओ। जी एक्स 280 में 35 माइक्रोन सेल झरनी छाया हुआ ट्यूब 5 मिनट के माध्यम से स्पिन। यदि आवश्यक हो तो 2 ट्यूब और एक बड़ी मात्रा में प्रयोग करें।
- हुड में चुंबकीय multistand और चुंबकीय कॉलम सेट अप विभाजक के लिए एक स्तंभ देते हैं और FACS बफर के 2 मिलीलीटर के साथ स्तंभ संतुलित करना।
- AspiratFACS बफर के 1 मिलीलीटर - ई सतह पर तैरनेवाला और 0.5 में सेल गोली resuspend।
- Equilibrated चुंबकीय कॉलम के माध्यम से सेल निलंबन से गुजरती हैं।
- FACS बफर के 2 मिलीलीटर के साथ स्तंभ में तीन बार धोएं, और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब (एफटी अंश) में प्रवाह के माध्यम से (एफटी) इकट्ठा।
- विभाजक बंद स्तंभ ले लो और एक और 15 मिलीलीटर ट्यूब (eluate अंश) में FACS बफर के 2 मिलीलीटर के साथ elute। सभी कोशिकाओं कॉलम बंद कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए सवार का प्रयोग करें। हर बार बफर FACS के 2 मिलीलीटर के साथ क्षालन दो बार दोहराएँ।
- 5 मिनट के लिए 280 XG पर eluate स्पिन।
- तैरनेवाला निकालें और चुनाव आयोग मीडिया के 10 मिलीलीटर में गोली resuspend।
- समान रूप से eluate अंश विभाजित (~ 6 मिलीग्राम) 10 सेमी जिलेटिन लेपित बर्तन में। तीन 1 सेमी 3 ट्यूमर के लिए, थाली में कम से कम चार प्लेटों में कोशिकाओं eluted। कई प्लेटों में अलग सांद्रता में वैकल्पिक रूप से, प्लेट eluted कोशिकाओं (उदाहरण के लिए।, 0.5 मिलीग्राम, 1 मिलीलीटर, 1.5 मिलीग्राम, और चार प्लेटों में eluate के 3 मिलीग्राम बीज) एक सुनिश्चित करना है किटी कम से कम एक प्लेट कम eluted कोशिकाओं के साथ वरीयता दी गई है। (- 2.0 x 10 5 जुड़ी कोशिकाओं यानी लगभग 1.0) जुड़ी कोशिकाओं के confluency ~ 1% से कम अगले दिन है कि जाँच करें।
नोट: चुनाव आयोग कालोनियों अन्य प्रकार की कोशिकाओं द्वारा दूषित किया जा रहा बिना फार्म कर सकते हैं इतना है कि कोशिकाओं विरल चढ़ाया जा करने की जरूरत है। - एक 10 सेमी पकवान में प्लेट एफटी अंश कोशिकाओं हे / एन ठीक हो जाने के लिए। अगले दिन मिला हुआ 100% - प्लेट 80 है कि जाँच करें। (-80 डिग्री सेल्सियस) 250 μl सेल ठंड एक cryotube में मीडिया और तरल नाइट्रोजन में उन्हें स्टोर में अगले दिन कोशिकाओं नीचे रुक। नोट: एफटी अंश एक बाद में मंच पर और / या अलग चुनाव आयोग क्लोन की ईसी जीन अभिव्यक्ति के विश्लेषण के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में ट्यूमर सेल अलगाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
- 3 दिन - हर 2 मीडिया बदलें। - 10 दिनों कालोनियों 7 के बाद फार्म शुरू। छोटे चुनाव आयोग कालोनियों के रूप में जल्दी डिश के तल पर एक ठीक-टिप मार्कर के साथ कालोनियों दिन 3. मार्क के रूप में पहचाना जा सकता है।
- गैर विशिष्ट ग परिमार्जनएक बाँझ 200 μl pippet टिप के साथ पहचान की कालोनियों के आसपास के ELLs।
3. कालोनी चयन का उपयोग क्लोनिंग के छल्ले
- 3 दिन - हर 2 मीडिया बदलें। 7 दिन - चुनाव आयोग पवित्रता के बारे में 5 पर एलडीएल (DiI एसी एलडीएल) इसके द्वारा जाँच की जा सकती है। 10 मिलीलीटर चुनाव आयोग मध्यम प्रति एलडीएल के 50 μl जोड़ें और 3 के लिए सेते हैं - प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं की जाँच से पहले 4 घंटा।
नोट: एकाधिक एलडीएल + चुनाव आयोग क्लोन दिन 7 ~ पर मनाया जा सकता है। - आकार में 5 मिमी - वे 3 के व्यास तक पहुँचने जब चुनाव आयोग कालोनियों कटाई शुरू। (अच्छे परिणाम के लिए छोटे एलडीएल + कोशिकाओं के साथ पैक कर रहे हैं कि बड़ी कालोनियों का चयन करें।)
- क्लोनिंग के छल्ले, पूर्व कोट 0.5% जिलेटिन के साथ कुछ 6 अच्छी तरह से प्लेटों के साथ चुनाव आयोग कटाई से पहले। महाप्राण जिलेटिन, अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए चुनाव आयोग मीडिया के 2 मिलीलीटर जोड़ने, और जब तक जरूरत है एक मशीन में प्लेटों में रहते हैं।
- कोई अन्य प्रकार की कोशिकाओं की क्लोनिंग रिंग के भीतर फँस जाएगा सुनिश्चित करने के लिए कालोनियों के किनारों पर गैर-चुनाव आयोग परिमार्जन।
- इसका उपयोग करनाचरण विपरीत माइक्रोस्कोप (4X या 10X उद्देश्य), संस्कृति डिश के तल पर एक ठीक-टिप मार्कर के साथ रूपरेखा चुनाव आयोग कालोनियों युक्त क्षेत्रों में।
- पीबीएस के 10 मिलीलीटर के साथ थाली धोने और aspirating जब थाली में पीबीएस की एक बहुत पतली परत छोड़ दें। (महत्वपूर्ण: एक छोटी राशि (~ 0.5 मिलीलीटर) पीबीएस की क्लोनिंग अंगूठी प्रक्रिया के दौरान जीवित कोशिकाओं रखेंगे, यह भी, ऊतक चिपकने वाला बांड के लिए पानी की जरूरत है।)
- उचित आकार के एक क्लोनिंग अंगूठी का चयन करें। एक अंगूठी लेने के लिए विदारक संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें, और एक 10 μl pipet टिप के साथ समान रूप से क्लोनिंग अंगूठी पर ऊतक चिपकने की एक छोटी राशि लागू होते हैं।
नोट: क्लोनिंग के छल्ले पर ऊतक चिपकने के (एक छोटी सी अंगूठी के लिए ~ 0.2 μl) केवल न्यूनतम राशि का उपयोग करें और सुनिश्चित करें कि ऊतक चिपकने वाला अच्छा सील सुनिश्चित करने के लिए नीचे की सतह के आसपास समान रूप से फैला हुआ है बनाते हैं। अत्यधिक ऊतक चिपकने वाला गर्मी पैदा करता है और कोशिकाओं को मार सकता है कि फिल्मों का निर्माण करती है। - चुनाव आयोग कॉलोनी से अधिक क्लोनिंग अंगूठी रखें। धीरे री गोंद के लिए क्लोनिंग अंगूठी नीचे प्रेसथाली पर एनजी। कालोनियों अंगूठी gluing से पहले बाहर सूख नहीं कर रहे हैं कि सुनिश्चित करें।
- इसके तत्काल बाद क्लोनिंग के रिंग में एंजाइमी सेल टुकड़ी समाधान के 25 μl pipet और ~ 1 मिनट सेते हैं या कोशिकाओं शिथिल जुड़े होते हैं जब तक।
- पूर्व गर्म चुनाव आयोग मीडिया वाले 6 अच्छी तरह से थाली के एक कुएं में क्लोनिंग अंगूठी बूंद-वार में pipet कोशिकाओं। (महत्वपूर्ण: कोशिकाओं को फैलाने के लिए थाली हिला मत करो, चुनाव आयोग तंग समूहों में विकसित करने के लिए पसंद करते हैं।) के साथ 50 क्लोनिंग अंगूठी धो - संभव के रूप में कई कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए 100 μl चुनाव आयोग मीडिया, और एक ही 6 अच्छी तरह से में सभी washes हस्तांतरण ।
- 10 सेमी पकवान में कुछ कालोनियों फसल के लिए बहुत छोटे हैं, तो कालोनियों अधिक कुछ दिनों के लिए बढ़ने, 10 मिलीलीटर ताजा मीडिया को जोड़ने, और फिर क्लोनिंग अंगूठी प्रक्रिया को दोहराने।
- एक 10 सेमी टिशू कल्चर पकवान में उन्हें विस्तार करने से पहले, एक 6 अच्छी तरह से थाली के 3 कुओं के लिए कोशिकाओं 100% मिला हुआ है, और हस्तांतरण - 80 तक 6 अच्छी तरह प्लेटें में काटा कालोनियों के लिए आगे बढ़ें। दूषित पदार्थों कोशिकाओं परिमार्जन। दोहरानायदि आवश्यक हो तो - क्लोनिंग अंगूठी प्रक्रिया के दूसरे दौर (3.10 3.5 कदम)। विस्तार हो रहा है, जब - (70% ~ 60) अपेक्षाकृत मिला हुआ कोशिकाओं रखें। चुनाव आयोग भी विरल चढ़ाया यदि बढ़ती रोक सकता है।
- आदि FACS, धुंधला, पीसीआर, द्वारा चुनाव आयोग को चिह्नित दिल एसी एलडीएल फ्लोरोसेंट है और FACS के लिए पीई या अन्य फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं कि ध्यान दें।
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Representative Results
चुनाव आयोग ज्यादातर वयस्क ऊतकों 11 में कुल सेल की आबादी का केवल मामूली एक अंश का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह पूरी तरह से बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) और संयोजी ऊतक से चुनाव आयोग की अधिक से अधिक रिहाई सुनिश्चित करता है कि एक एकल कक्ष निलंबन में काटा ऊतक को पचाने के लिए इसलिए महत्वपूर्ण है। हमारे अनुभव में, CD31 की मध्यस्थता immunomagnetic चयन केवल समृद्ध नहीं बल्कि शुद्ध चुनाव आयोग अंशों प्रदान करता है; इसलिए, एक और महत्वपूर्ण कदम क्लोनिंग के छल्ले (चित्रा 1) का उपयोग कर चुनाव आयोग कालोनियों के सह शुद्ध गैर-चुनाव आयोग और चयन / विस्तार के भौतिक हटाने है। उदाहरण के लिए, चुनाव आयोग CD31 समृद्ध जब आगे कॉलोनी चयन, गैर चुनाव आयोग तेजी से प्रचूर मात्रा में और दिल एसी एलडीएल + और DiI एसी एलडीएल से पता चला अशुद्ध चुनाव आयोग संस्कृतियों के उत्पादन, चुनाव आयोग के साथ intermingled बिना चढ़ाया गया - आबादी (2A चित्रा) । स्तंभ eluates कम घनत्व पर चढ़ाया गया हालांकि, जब चुनाव आयोग कालोनियों सुप्रीम कोर्ट द्वारा हटा दिया गया है, जो अपेक्षाकृत कुछ आसपास के गैर-चुनाव आयोग, के साथ बढ़ीएक pipet टिप (चित्रा 2 बी) के साथ बलात्कार करने। का विस्तार कालोनियों के विकास और पवित्रता के आगे दिल एसी एलडीएल के अलावा द्वारा नजर रखी जा सकती है। छोटे चुनाव आयोग कालोनियों CD31 की मध्यस्थता स्तंभ संवर्धन (चित्रा 2 बी, शीर्ष पैनल) के बाद दिन में सात ~ पर मनाया जा सकता है। चयन और चुनाव आयोग कालोनियों, दिल एसी एलडीएल के विस्तार के बाद - कोशिकाओं का सफाया कर रहे हैं, और दिल एसी एलडीएल तेज (चित्रा 2 बी, नीचे पैनल) द्वारा संकेत के रूप में सेल की आबादी दिल एसी एलडीएल + चुनाव आयोग के लिए अत्यधिक शुद्ध है।
अलगाव विधि अनुरूप परिणाम, सी 3-टैग से उच्छेदन स्तन ट्यूमर या तो से निकाली गई कई क्लोन का उत्पादन कर सकते हैं, तो परीक्षण करने के लिए (/ FVB एन सी 3 1 -TAg) चूहों या उम्र से मिलान प्रकार के जंगली FVB चूहों से सामान्य स्तन ग्रंथियों पृथक और विस्तार किया गया 12। प्रत्येक टीईसी और सामान्य चुनाव आयोग (एनईसी) जनसंख्या की पवित्रता तो ध्यान शुद्धता सुनिश्चित करने के लिए होती थी। फ्लो तीन स्वतंत्र नमूनों के विश्लेषण Unifor, एक भी पता चलाआईजीजी निर्धारण नियंत्रण (चित्रा 3) से अलग हो गया था कि मेड CD31 + आबादी। सभी परीक्षण चार चुनाव आयोग क्लोन में CD31, Cdh5 (VE-Cadherin), CD133, और VEGFR2 सहित चुनाव आयोग मार्कर, की mRNA अभिव्यक्ति एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था, जो माउस भ्रूणीय (MEFs) fibroblasts की तुलना में ~ 200 को 7,000 गुना अधिक था (चित्रा 3 बी)। जैसी कि उम्मीद थी MEFs की तुलना में जब, सभी चुनाव आयोग क्लोन mesenchymal मार्कर जीन Col1a1 और Tagln के लगभग undetectable स्तर व्यक्त किया। Immunofluorescent धुंधला एक प्रतिनिधि टीईसी क्लोन के सभी कक्षों में समान रूप CD31 + (चित्रा 3 सी) थे कि पता चला है। इसके अलावा, इन चुनाव आयोग क्लोन वे (चित्रा 3 डी) संवर्धन के बाद एन्दोथेलिअल कार्यों को बनाए रखने का संकेत है, इन विट्रो में सहज पोत संरचनाओं की तरह बनाने में सक्षम थे।
अलगाव विधि आगे Cdh5 सीआरई का उपयोग कर मान्य किया गया था: ZsGreen
चित्रा 1. फ्लो चार्ट और चुनाव आयोग अलगाव की प्रक्रिया का अवलोकन।
चित्रा 2. दिल एसी एलडीएल जी संस्कृतियों में गैर-चुनाव आयोग को दूषित से चुनाव आयोग अलग करता है। (ए) चरण विपरीत और चुनाव आयोग दिखा फ्लोरोसेंट छवियों और सह-पृथक चुनाव आयोग कालोनियों की क्लोनिंग अंगूठी चयन के बिना गैर-चुनाव आयोग। (बी) के चरण विपरीत और अलगाव के विभिन्न चरणों में चुनाव आयोग कालोनियों के फ्लोरोसेंट छवियों। बिंदीदार लाइनों boundari निशानदिल एसी एलडीएल + चुनाव आयोग की es और आसपास के दूषित कोशिकाओं। व्हाइट तीर एक विंदुक टिप के साथ हटा दिया जाना चाहिए कि एक चुनाव आयोग कॉलोनी के बाहर गैर चुनाव आयोग से संकेत मिलता है। स्केल सलाखों 100 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3. क्लोनिंग के छल्ले और गैर-चुनाव आयोग के भौतिक हटाने शुद्ध और कार्यात्मक लंबे समय तक चुनाव आयोग संस्कृतियों का उत्पादन। (ए) प्रतिनिधि FACS के अलग अलग चुनाव आयोग क्लोन की CD31 धुंधला के भूखंडों डॉट। तीन प्रतिनिधि नमूने दिखाए जाते हैं। प्रत्येक भूखंड में खुला काले आयत CD31 + आबादी की रूपरेखा। एक आईजीजी निर्धारण एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है। चयनित NEC और टीईसी क्लोन में endothelial जीन अभिव्यक्ति की (बी) के मापन। endothel mRNA स्तरial जीन CD31, CD133, Cdh5, और VEGFR2 माउस भ्रूणीय (MEFs) fibroblasts के उन लोगों के रिश्तेदार व्यक्त कर रहे हैं, और mesenchymal जीन Col1a1 और Tagln mRNA स्तर एनईसी-1 के उन लोगों के रिश्तेदार व्यक्त कर रहे हैं। (सी) एक विस्तारित टीईसी क्लोन के प्रतिनिधि immunofluorescent धुंधला। CD31 हरे रंग में दिखाया गया है और नाभिक 4'6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI) के साथ नीले दाग रहे हैं। (डी) Matrigel पर चढ़ाया अलग चुनाव आयोग क्लोन द्वारा ट्यूब गठन के प्रतिनिधि छवियाँ। स्केल सलाखों 100 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4. चुनाव आयोग Cdh5 रचनात्मक से पृथक: ZsGreen
| सेल संख्या | FACS बफर (μL) | CD31 पीई एंटीबॉडी (μl) |
| 1 10 x 7 | 100 | |
| 2 10 x 7 | 200 | 6 |
| 3 10 x 7 | 300 | 7 |
| 4 10 x 7 | 400 | 8 |
| 5 10 x 7 | 500 | 9 |
| 6 10 x 7 | 600 | 10 |
तालिका 1. पीई संयुग्मित विरोधी CD31 एंटीबॉडी वॉल्यूम अलग सेल नंबर के लिए आवश्यक है।
| सेल संख्या | FACS बफर (μl) | विरोधी पीई चुंबकीय microbeads (μl) | 1 10 x 7 | 80 | 20 |
| 2 10 x 7 | 160 | 40 |
| 3 10 x 7 | 240 | 60 |
| 4 10 x 7 | 320 | 80 |
| 5 10 x 7 | 400 | 100 |
| 6 10 x 7 | 480 | 120 |
तालिका 2. विरोधी पीई Microbead वॉल्यूम अलग सेल नंबर के लिए आवश्यक है।
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Discussion
कारण शुद्ध प्राथमिक टीईसी संस्कृतियों, ऐसे मानव नाल की नस चुनाव आयोग (HUVEC) के रूप में 13 व्यावसायिक रूप से उपलब्ध चुनाव आयोग लाइनों या प्राथमिक चुनाव आयोग के साथ इन विट्रो अध्ययन में कई स्थानापन्न टीईसी प्राप्त करने में कठिनाइयों के लिए। हालांकि, सामान्य ऊतकों से इन चुनाव आयोग आबादी केवल अपने सामान्य समकक्षों से स्पष्ट रूप से अलग है, जो टीईसी के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में सेवा कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, टीईसी विवो में phenotypically और कार्यात्मक असामान्य हैं और इन असामान्यताओं के कुछ विट्रो 14-18 में भी फैल सकती हो सकता है। टीईसी न्यायपालिका विकास, प्रवासी, और भेदभाव की क्षमता है और पोत संरचनाओं की तरह 16,19,20 के लिए फार्म का CD31 + ट्यूमर कोशिकाओं के साथ संगठित होना हो सकता है। सुसंस्कृत टीईसी या लेजर कब्जा सूक्ष्म विच्छेदित ट्यूमर जहाजों या तो उपयोग अध्ययन जीन अभिव्यक्ति, cytogenetic, और epigenetic प्रोफाइल 12,18,21-23 में सामान्य चुनाव आयोग से कहा कि टीईसी विचलित प्रदर्शन किया है। अतीत से अधिक ट्यूमर angiogenesis के बारे में हमारी समझ को मजबूत बनाने के बावजूदसुसंस्कृत प्राथमिक टीईसी का उपयोग कर कुछ दशकों में, बहुत कुछ कार्यात्मक और यंत्रवत अध्ययन उपलब्ध हैं।
चुनाव आयोग 1970 के दशक के 24 में मानव नाल नसों से अलग थे। इसके बाद अलगाव और अन्य मानव और माउस ऊतकों से microvascular चुनाव आयोग के संवर्धन के लिए स्वास्थ्य और रोग 25-28 दोनों में endothelial कार्यों की जांच के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान की गई है। अधिकांश चुनाव आयोग अलगाव प्रोटोकॉल तीन प्रमुख कदम शामिल: यांत्रिक हदबंदी या enzymatic पाचन के बाद एक एकल कोशिका निलंबन प्राप्त करने, एक fluorophore या चुंबकीय या तो microbeads संयुग्मित है कि एक endothelial विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ चुनाव आयोग लेबलिंग, और सेल छँटाई का उपयोग कर चुनाव आयोग आबादी को समृद्ध बनाने या चुंबकीय कॉलम। हालांकि, विशेष रूप से ट्यूमर से माउस चुनाव आयोग, के अलगाव की वजह से व्यवहार्य चुनाव आयोग और ट्यूमर कोशिकाओं और fibroblasts सहित अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लगातार प्रदूषण की कम उपज के लिए मुश्किल साबित हो गया है। इसके अलावा, चुनाव आयोग की इन विट्रो प्ररूपी बहाव मुझे मेंsenchymal कोशिकाओं की तरह (एन्दोथेलिअल करने वाली mesenchymal संक्रमण, EndMT) सामान्य ऊतकों, ट्यूमर, और reprogrammed व्यापारियों से चुनाव आयोग की लंबी अवधि के संवर्धन के लिए एक अतिरिक्त चुनौती बन गया है।
10 दिनों संस्कृति में - टीईसी अलगाव के दौरान बड़ी चुनौती आसानी से आम तौर पर ~ 7 के बाद दिखाई देते हैं कि धीमी गति से बढ़ रही है चुनाव आयोग कालोनियों outcompete सकता है, जो ट्यूमर कोशिकाओं द्वारा संक्रमण है। इसके अलावा, चुनाव आयोग को अलग-थलग करने के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया चयन मार्कर बहुतायत अन्तःचूचुक में व्यक्त किया जाता है, जो CD31 है लेकिन यह भी रक्त कोशिकाओं के निशान है और कुछ मामलों में ट्यूमर सेल उप-जनसंख्या 20,30 में। चुनाव आयोग के लिए समृद्ध करते हुए इसके अलावा, CD31 की मध्यस्थता immunomagnetic स्तंभ चयन अंततः कुछ अंश के बाद चुनाव आयोग संस्कृतियों पर ले जा सकते हैं कि हर एक को दूषित सेल नहीं निकाल सकते। एक क्लोनिंग अंगूठी कदम को जोड़ कर, एक का चयन करें और इन दूषित प्रकार की कोशिकाओं के लिए स्वतंत्र हैं कि शुद्ध clonally व्युत्पन्न चुनाव आयोग आबादी का विस्तार करने में सक्षम है। एक दूसरी चुनौती लंबे समय तक मुख्य हैEndMT की पदोन्नति के बिना शुद्ध चुनाव आयोग के रखरखाव। EndMT विकास के दौरान, संवहनी रोग के दौरान recapitulated किया जा सकता है होता है, और सुसंस्कृत चुनाव आयोग में 31-33 (विशेष रूप से TGFβ की उपस्थिति में) आम है। एक सूत्र TGFβ के रूप में कार्य कर सकते हैं कि दूषित कोशिकाओं को हटाने, EndMT को कम से कम करने के लिए, हर समय मीडिया में bFGF की उच्च सांद्रता उच्च घनत्व में संस्कृतियों रखने के लिए, और बनाए रखने के। हम हाल ही में पता चला है, bFGF यह चिकनी पेशी actin (एक EndMT मार्कर), 34 की TGFβ संचालित अभिव्यक्ति antagonizes के रूप में चुनाव आयोग विनिर्देश की रक्षा करने के लिए आवश्यक है।
एक "भाग्य-मैप" रिपोर्टर चूहों से इस पद्धति, चुनाव आयोग के अलगाव का प्रयोग भी दिखाया गया था। इन चूहों intravital इमेजिंग 35 की जरूरत है, जहां पढ़ाई में विशेष रूप से उपयोगी होते हैं। रक्त कोशिकाओं में से कुछ लेबलिंग Cdh5 रचनात्मक में हो सकता है, हालांकि: यहां इस्तेमाल ZsGreen एल / एस / एल चूहों, इस मॉडल फ्लू पैदा करने के लिए एक अपेक्षाकृत तेजी से और आसान तरीका प्रदान करता हैorescent चुनाव आयोग विवो में। एक वैकल्पिक चुनाव आयोग वंश-लेबलिंग मॉडल (Cdh5 रचनात्मक / ERT2) ईमानदारी से चुनाव आयोग होगा कि एक floxed संवाददाता माउस तनाव (ZsGreen एल / एस / एल) के साथ पार किया और अचल 36,37 चिह्नित एक tamoxifen-inducible माउस है । Inducible रचनात्मक चूहों से फ्लोरोसेंट चुनाव आयोग भी FACS का उपयोग या हम इस के साथ साथ वर्णन पद्धति का उपयोग कर शुद्ध किया जा सकता है।
चुनाव आयोग ने भी इसी पोत 38,39 के भीतर चुनाव आयोग के बीच में मौजूद हो सकता है अलग संवहनी बेड और "इंट्रा-पोत" विविधता भर में विषम हैं। इसके अलावा, विभिन्न proliferative क्षमता के साथ चुनाव आयोग के एक पदानुक्रम नसों से अलग चुनाव आयोग आबादी में देखा गया है, और 40 आबादी 40 दोहरीकरण परे प्रतिरूप चुनाव आयोग का एक छोटा सा अंश passaged जा सकता है। इसलिए, यहाँ वर्णित विधि की सीमाओं में शामिल हैं: पोत दीवार में रहने वाले इन अत्यधिक proliferative चुनाव आयोग का 1) संभव चयन; केवल एक कल्पना की और 2) संवर्धनपूरी तरह से विवो में कुल ईसी आबादी का प्रतिनिधित्व नहीं करते कि क्लोन का उत्पादन हो सकता है, जो धमनियों, नसों, या केशिकाओं से निकाली गई ific संवहनी उपप्रकार। फिर भी, कई प्रतिरूप उप-जनसंख्या एक अलगाव की प्रक्रिया से प्राप्त किया जा सकता है, इस विधि ट्यूमर और अन्य ऊतकों 12 के भीतर मौजूद है कि चुनाव आयोग विविधता के कार्यात्मक और आनुवंशिक विश्लेषण के लिए उपयोगी हो सकता है। यहाँ वर्णित है, साथ में ले ली गैर चुनाव आयोग को दूषित से रहित शुद्ध चुनाव आयोग कालोनियों पैदा करता है कि एक चुनाव आयोग अलगाव विधि है। अलग कक्षों में इन विट्रो कार्यात्मक अध्ययन, जीनोम चौड़ा अभिव्यक्ति की रूपरेखा, और ट्यूमर angiogenesis को नियंत्रित करते हैं कि नए रास्ते की आणविक लक्षण वर्णन के लिए उपयोगी होना चाहिए।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic-Antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium (1 g/L D-glucose) (LG-DMEM) | Gibco | 11885-084 | |
| EGM-2 Bullet Kit | Lonza | CC4176 | Not all components used |
| Fetal bovine serum (Hyclone) | Thermo Scientific | SH30071.03 | Heat inactivated at 56 °C for 30 min |
| Nu-Serum IV | Corning | CB-51004 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBBS) | Gibco | 14175-095 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | |
| FACS buffer | 0.5 % BSA and 2 mM EDTA in PBS, filtered through a 0.22 μm filter | ||
| 75% v/v ethanol for disinfection | |||
| Anti-PE microbeads | Miltenyi Biotech | 130-048-801 | |
| Bovine serum albumin (BSA) fraction V, 7.5% | Gibco | 15260-37 | |
| Cell freezing media (Bambanker) | Wako Chemicals | 302-14681 | |
| Collagenase type II | Worthington Biochemical | LS004176 | Make stock concentration 2 mg/ml in HBSS |
| Deoxyribonuclease I (DNase) | Worthington Biochemical | LS002004 | Make stock concentration 1 mg/ml in PBS |
| Dil-Ac-LDL | Biomedical Technologies | BT-902 | |
| EDTA, 0.5M, pH 8.0 | Cellgro | 46-034-CL | |
| Enzymatic cell detachment solution (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | |
| Gelatin, 2% in water, tissue culture grade | Sigma-Aldrich | G1393-100ML | Dilute in PBS to make 0.5% gelatin solution |
| Mouse FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotech | 130-092-575 | |
| Neutral protease (Dispase) | Worthington Biochemical | LS02104 | Make stock concentration 2.5 U/ml in HBSS |
| PE-rat anti-mouse CD31 antibody | BD Pharmingen | 553373 | |
| RBC lysis buffer (BD Pharm Lyse) | BD Pharmingen | 555899 | |
| Sterile water | |||
| Trypan blue, 0.4 % | Life Technologies | 15250-061 | |
| 10 mm tissue culture dishes | Corning | ||
| 15 ml conical tubes (sterile) | Corning | ||
| 50 ml conical tubes (sterile) | Corning | ||
| 6-well tissue culture plates | Corning | ||
| Tissue-dissociator tubes (gentleMACS) C tubes) | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | |
| Cell Separator (MidiMACS) | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| Cell strainer 100 μm | Corning | 352360 | |
| Cloning rings (assorted sizes) | Bel-Art Products | 378470000 | |
| Cryotubes | Thermo Scientific | ||
| Dissecting board | Sterilize or disinfect with 75% v/v ethanol before use | ||
| Dissecting forceps and scissors | Sterilize before use | ||
| Dissecting pins 2" | Sterilize before use | ||
| FACS tubes with 35 μm filter cap | Corning | 352235 | |
| Filter cup (Stericup, 0.22 μm) | Millipore | SCGPU05RE | |
| Fine-tip marker | |||
| Hemocytometer | |||
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| Magnetic Multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Tissue adhesive (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Or a centrifuge with similar capacity for 15 ml and 50 ml conical tube centrifugation |
| Tissue culture hood | |||
| Tissue dissociator (gentleMACS) | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | Preset program "m_impTumor_01" used for tissue dissociation |
| Liquid nitrogen freezer | |||
| Microplate or rotary shaker | |||
| Phase contrast light microscope |
References
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