Abstract
Recién aisladas células endoteliales específicos de tumores (TEC) se pueden usar para explorar los mecanismos moleculares de la angiogénesis tumoral y servir como un modelo in vitro para el desarrollo de nuevos inhibidores de la angiogénesis para el cáncer. Sin embargo, a largo plazo en la expansión in vitro de células endoteliales murinas (CE) es un reto debido a la deriva fenotípica en la cultura (transición-endotelial-mesenquimal) y la contaminación con no comunitario. Esto es especialmente cierto para TEC que se outcompeted fácilmente por co-purificado fibroblastos o células tumorales en cultivo. Aquí, un método de aislamiento de alta fidelidad que se aprovecha de enriquecimiento inmunomagnética junto con la selección de la colonia y la expansión in vitro se describe. Este enfoque genera fracciones CE puros que son totalmente libre de contaminación de las células del estroma o tumorales. También se muestra que el linaje de trazado de Cdh5 cre: / l reportero ratones ZsGreen l / s, que se utiliza con el protocolo descrito en este documento, son una valiosa herramienta para verificar celularpureza como las colonias de la CE aislados de estos ratones muestran fluorescencia ZsGreen duradero y brillante en la cultura.
Introduction
Las células endoteliales (CE) son esenciales durante el desarrollo de tumores sólidos. A partir de la iniciación del cambio angiogénico en los tumores latentes a la difusión y la siembra de metástasis en sitios distantes, EC formar los conductos que suministran sangre, oxígeno y nutrientes para sostener el crecimiento del tumor 1. Como se ha sugerido recientemente, EC también tiene funciones de perfusión independiente y formar un nicho que soporta el crecimiento de células madre de cáncer y otras células del estroma tumoral 2-5. Por lo tanto, altamente purificado específico de tumor CE (TCE) para el cultivo in vitro permite estudios funcionales de rutina que arrojará luz sobre nuevos mecanismos moleculares que median la angiogénesis tumoral y la diafonía con células tumorales.
CE son altamente especializados dependiendo del tejido de origen 6. Debido a la naturaleza heterogénea de diferentes tipos de tumores y el microambiente tumoral, TEC también puede mostrar características únicas que reflejan una especialización o específico de tumorf la vasculatura. Por ejemplo, no es sorprendente variabilidad en las firmas de expresión génica en TEC aisladas a partir de diferentes tipos o grados de tumores 7,8. Sin embargo, la co-purificación frecuente de no comunitario, especialmente los fibroblastos asociados al tumor y las células tumorales, con TEC puede confundir a los análisis de la expresión de todo el genoma. Estos tipos de células no deseadas son especialmente problemáticas en los estudios que se basan en a largo plazo en la expansión in vitro de cultivos de TEC.
Aquí descrito es un método de alta fidelidad que produce consistentemente culturas CE puros de tumores y otros tejidos. Tras enriquecimiento columna inmunomagnética de las fracciones de la CE y la eliminación de co-purificado no comunitario, un paso anillo clonación adicional para capturar colonias CE puro se utiliza 9. Cada colonia se puede expandir en cultivo durante varios pasajes sin la aparición de contaminantes no comunitario. Este método también produce múltiples clones CE de un único procedimiento de aislamiento, que es ideal para el estudio de endoheterogeneidad telial. Además, se muestra que Cdh5 cre: / l ratones ZsGreen l / s reportero son una valiosa herramienta para la generación de la CE "destino asignada", indelebles, que mantienen ZsGreen fluorescencia en la cultura 10. Con pequeños ajustes en el protocolo, este método debe ser adaptable a diferentes tipos de tumores o tejidos normales.
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Protocol
El siguiente protocolo se lleva a cabo de acuerdo con las directrices establecidas por el Departamento de Medicina de Laboratorio Animal de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill.
1. Prepare el siguiente material y reactivos Antes de empezar
- Preparar los medios de comunicación CE completándola 400 ml bajo nivel de glucosa (1 g / L D-glucosa o LG) de Dulbecco Modificado medio de Eagle (DMEM) con 50 ml de suero bovino fetal inactivado por calor, 50 ml Nu-Serum IV, 5 ml antibiótico-antimicótico, y el hFGF, VEGF, hEGF, R3-IGF-1, y los componentes de heparina desde el kit comercial.
- Preparar 500 ml de tampón FACS (0,5% de BSA y EDTA 2 mM en PBS); filtrado a través de un 0,22 micras taza del filtro estéril.
- Esterilizar o desinfectar el tablero de la disección.
- Esterilizar pasadores de disección, tijeras quirúrgicas, y disectores.
2. Aislamiento CE (Día 1, ~ 5 horas)
- La eutanasia ratón con el dióxido de carbono u otros métodos ingenio compatibleel Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) políticas h.
Nota: Múltiples tumores mamarios varían en tamaño (5 - 15 mm de diámetro) pueden desarrollar en un solo ratón modificado genéticamente como C3-TAG, asegúrese de recoger todos ellos para el aislamiento TEC. Si el uso de los tumores que se ortotópicamente injertan en los ratones, piscina de dos a tres 1 cm 3 tumores para un solo aislamiento CE. Aquí usamos tumores mamarios como una demostración, pero el protocolo se puede modificar para otros tipos de tumores. - Desinfectar ratón por pulverización o limpiando el lado ventral del ratón con una amplia cantidad de 75% v / v de etanol.
- Resecar tumores con un par de tijeras y disectores utilizando técnicas asépticas en una campana estéril o en un banco limpio.
- Extiende y el pin de las extremidades de los ratones en una tabla de disección. Haga una incisión en la línea media ventral con las tijeras sin necesidad de abrir el peritoneo. Diseccionar lateralmente entre la piel y el peritoneo hacia las glándulas mamarias donde se encuentran los tumores.No abra el peritoneo.
- Impuestos Especiales sólo el tejido tumoral de las glándulas mamarias, dejando de lado los márgenes mamarias normales. Recortar con cuidado los tejidos no tumorales, como la piel y los músculos, y coloque los tumores disecados en un tubo cónico que contiene 30 ml de LG-DMEM en hielo.
- Traiga muestras tumorales a campana de cultivo de tejidos; lavar tejidos con estéril LG-DMEM 1 - 2 veces.
- Tumores de transferencia del tubo cónico a un cultivo de tejidos placa de Petri estéril, añadir 2 ml de DMEM-LG en el plato, y picar con un par de tijeras estériles en pedazos <5 mm.
- Añadir 5 ml de colagenasa (stock = 2 mg / ml en solución salina equilibrada de Hank, en lo sucesivo HBSS), 1 ml de dispasa (stock = 2,5 U / ml en HBSS) y 75 l de desoxirribonucleasa (stock = 1 mg / ml en PBS ) en la placa de Petri. Volumen total es ahora ~ 10 ml.
- Transfiera la mezcla colagenasa / tejido de la placa de Petri a un tubo de tejido-disociador y ejecutar en un disociador de tejido durante 60 segundos dos veces (pre-establecido disociación prOGRAMA en el disociador: 1.270 rondas totales por corrida). Incubar con la luz agitando en un agitador durante 75 minutos a 37 ° C.
- Filtrar digiere el tejido a través de un filtro de células de 100 micras sobre un tubo cónico de 50 ml. Filtro Enjuague con 5 ml de tampón FACS para lavar las células restantes. Giran a 280 xg durante 5 min y aspirar cuidadosamente el sobrenadante sin alterar el sedimento celular.
- Diluir 1 ml de tampón de lisis RBC de stock (10x) en 9 ml de agua estéril. Lisar células rojas de la sangre con 10 ml de tampón de lisis (1x), e inmediatamente giran 5 min a 280 x g. Nota: Este paso se puede omitir si poco de sangre es visible.
- Resuspender en 10 ml de tampón FACS. Mezclar 10 l de suspensión celular con 10 l de azul de tripano, y contar las células vivas utilizando un hemocitómetro.
- Resuspender las células en ~ 10 7 células / 100 l. Añadir 10 l de bloque de FcR por 100 l de suspensión celular, y se incuba en hielo durante 10 min.
- Añadir el anticuerpo CD31 de rata anti-ratón conjugado con PE según. a la Tabla 1 incubar en hielo durante 10 - 15 min y el tubo de película de vez en cuando.
- Añadir 10 ml de tampón FACS para el tubo y centrifugado a 280 xg durante 5 min. Retirar con cuidado el sobrenadante, y se lava el sedimento de células de nuevo con 5 ml de tampón FACS. Centrifugar para sedimentar las células. Aspirar el sobrenadante sin sedimento celular perturbador.
- Añadir tampón y anti-PE FACS microperlas de acuerdo con la Tabla 2 Incubar en hielo durante 10 -. 15 min. Tubo de Flick de vez en cuando.
- Añadir 10 ml de muestras de tampón FACS y centrifugado a 280 xg durante 5 min; lavar una vez con 5 ml de tampón FACS y se centrifuga de nuevo. Aspirar el sobrenadante sin perturbar pellet.
- Traiga volumen a 300 l de tampón FACS. Gira a 35 micras de células colador tapado tubo 5 min a 280 x g. Utilice 2 tubos y un volumen mayor si es necesario.
- Establecer Multistand magnético y columnas magnéticas en el capó, adjunte una columna para el separador y equilibrar la columna con 2 ml de tampón FACS.
- Aspirate el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 0,5 - 1 ml de tampón FACS.
- Pasar la suspensión celular a través de la columna magnética equilibrada.
- Lavar la columna tres veces con 2 ml de tampón FACS, y recoger flujo a través (FT) en un tubo de 15 ml (fracción FT).
- Tomar la columna fuera del separador y se eluye con 2 ml de tampón de FACS en otro tubo de 15 ml (fracción de eluato). Utilice émbolo para asegurar que todas las células están fuera de la columna. Repita la elución dos veces más con 2 ml de tampón FACS cada vez.
- Haga girar el eluido a 280 xg durante 5 min.
- Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 10 ml de los medios de comunicación de la CE.
- Igualmente dividir la fracción de eluato (~ 6 ml) en platos recubiertos de gelatina 10 cm. Durante tres 1 cm 3 tumores, placa de células eluye en al menos cuatro placas. Células Alternativamente, la placa eluyó a diferentes concentraciones en varias placas (por ejemplo., Sembrar 0,5 ml, 1 ml, 1,5 ml y 3 ml de eluido en cuatro placas) para asegurar que unt menos una placa está escasamente siembra con células eluidas. Compruebe que la confluencia de las células unidas se encuentra en ~ 1% al día siguiente (es decir, aproximadamente 1,0 - 2,0 x 10 5 células unidas).
Nota: Las células necesitan ser chapado escasa de modo que las colonias de la CE pueden formar sin estar contaminados por otros tipos de células. - Fracción FT placa en una placa de 10 cm para permitir células recuperan O / N. Compruebe que la placa es de 80 - 100% de confluentes al día siguiente. Congele por las células (-80 ° C) en 250 medios de congelación de células mu l en un criotubo y almacenarlas en nitrógeno líquido al día siguiente. Nota: fracción FT se puede utilizar para el aislamiento de células tumorales en una etapa posterior y / o como un control negativo para el análisis de la expresión génica CE de los clones aislados de la CE.
- Cambie los medios de comunicación cada 2 - 3 días. Las colonias empiezan a formar después de 7 - 10 días. Colonias pequeñas de la CE pueden ser identificados ya en el día 3. Marque las colonias con un marcador de punta fina en el fondo del plato.
- Raspe c inespecíficaells rodean las colonias identificadas con una punta pippet 200 l estéril.
3. Colonia Selección Anillos Usando Clonación
- Cambie los medios de comunicación cada 2 - 3 días. Pureza CE se puede comprobar por las LDL (Dil-Ac-LDL) Además en unos 5-7 días. Añadir 50 l de LDL por 10 ml de medio CE y se incuba durante 3-4 horas antes de comprobar las células bajo el microscopio de fluorescencia.
Nota: LDL Múltiple + clones de la CE se pudieron observar en ~ 7 días. - Comience cosechar colonias CE cuando alcanzan diámetros de 3 - 5 mm de tamaño. (Elija grandes colonias que están llenas de pequeñas de LDL + células para obtener mejores resultados.)
- Antes de la cosecha de la CE con los anillos de clonación, pre-capa de unos 6 y placas con 0,5% de gelatina. Aspirar gelatina, añadir 2 ml de medio CE a cada pocillo, y mantener las placas en una incubadora hasta que se necesite.
- Raspe no comunitario en los bordes de las colonias para asegurarse de que no hay otros tipos de células serán atrapados dentro del anillo de la clonación.
- Usando unmicroscopio de contraste de fase (4X o 10X objetivo), se rodeará con un marcador de punta fina en la parte inferior de la placa de cultivo de las áreas que contienen colonias de la CE.
- Lavar la placa con 10 ml de PBS y dejar una capa muy delgada de PBS en la placa cuando la aspiración. (Importante: una pequeña cantidad (~ 0,5 ml) de PBS mantendrá células vivas durante el procedimiento de anillo clonación; también, adhesivo tisular necesita agua para unir.)
- Elija un anillo de clonación de tamaño apropiado. Use un par de pinzas de disección para recoger un anillo, y con una punta de pipeta de 10 l aplicar uniformemente una pequeña cantidad de adhesivo tisular en el anillo de la clonación.
Nota: utilice sólo la cantidad mínima (~ 0,2 l de un pequeño anillo) de adhesivo tisular en los anillos de clonación, y crea adhesivo tisular seguro se extiende de manera uniforme alrededor de la superficie del fondo para asegurar un buen sellado. Adhesivo tisular excesivo produce calor y forma películas que pueden matar a las células. - Coloque el anillo de la clonación sobre la colonia CE. Presione suavemente el anillo de clonación para pegar los ring en el plato. Asegúrese de que las colonias no se secan antes de pegar el anillo.
- Inmediatamente pipeta 25 l de solución de desprendimiento celular enzimática en el anillo de clonación e incubar ~ 1 min o hasta que las células están débilmente unidos.
- Células de pipeta en el anillo de clonación gota a gota en un pocillo de una placa de 6 pocillos que contienen los medios de comunicación de la CE pre-calentado. (Importante: No agitar la placa para dispersar las células; CE prefieren crecer en racimos apretados.) Lave el anillo de la clonación con 50 - 100 medios de comunicación de la CE mu l recoger tantas células como sea posible, y la transferencia de todos los lavados en el mismo de 6 pocillos .
- Si algunas colonias en la placa de 10 cm son demasiado pequeños para cosechar, añadir 10 ml de medio fresco, deje que las colonias crecen durante unos cuantos días, y repita el procedimiento de clonación anillo nuevo.
- Crecer colonias cosechados en placas de 6 pocillos hasta 80-100% de confluencia, y la transferencia de células de 3 pocillos de una placa de 6 pocillos, antes de expandirse en una placa de 10 cm de cultivo de tejidos. Raspe células contaminantes. Repetirotra ronda de procedimiento anillo de clonación (Pasos de 03.05 a 03.10) si es necesario. Mantenga células relativamente confluente (~ 60-70%) cuando se expande. CE puede dejar de crecer si chapado demasiado escasos.
- Caracterizar CE por FACS, tinción, PCR, etc. Tenga en cuenta que Dil-Ac-LDL es fluorescente y puede interferir con PE u otros anticuerpos fluorescentes para FACS.
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Representative Results
CE representan solamente una fracción pequeña de la población total de células en la mayoría de los tejidos adultos 11. Por tanto, es importante para digerir completamente el tejido recogido en una suspensión de una sola célula que asegura la liberación máxima de CE de la matriz extracelular (ECM) y los tejidos conectivos. En nuestra experiencia, la selección inmunomagnética CD31 mediada sólo proporciona fracciones enriquecidas de la CE, pero no puros; por lo tanto, un paso crucial es la eliminación física de co-purificado no comunitario y selección / expansión de las colonias de la CE utilizando anillos de clonación (Figura 1). Por ejemplo, cuando enriquecido CD31 CE se sembraron sin más selección de colonias, no CE rápidamente proliferado y mezclado con CE, cultivos productores de la CE impuros según lo revelado por Dil-Ac-LDL + y DiI-AC-LDL - poblaciones (Figura 2A) . Sin embargo, cuando los eluidos de las columnas se sembraron a baja densidad, las colonias de la CE crecieron con relativamente pocos rodea no comunitario, que se elimina por scviolando con una punta de pipeta (Figura 2B). El crecimiento y la pureza de las colonias expandidas pueden ser controlados aún más mediante la adición de Dil-Ac-LDL. Colonias pequeñas de la CE se pueden observar en ~ día siete después de enriquecimiento de la columna CD31 mediada (Figura 2B, paneles superiores). Después de la selección y la expansión de las colonias de la CE, Dil-Ac-LDL - se eliminan las células, y la población de células es altamente puro para Dil-Ac-LDL + EC según lo indicado por Dil-Ac-LDL captación (Figura 2B, paneles inferiores).
Para probar si el método de aislamiento puede producir resultados consistentes, múltiples clones derivados de cualquiera de los tumores mamarios resecados de C3-TAG se aislaron y expandieron (N / C3 1 -tag FVB) los ratones o las glándulas mamarias normales de tipo salvaje ratones FVB de la misma edad 12. A continuación, la pureza de cada TEC y población normal CE (NEC) se caracterizó cuidadosamente para asegurar la pureza. Citometría de flujo análisis de tres muestras independientes mostraron una sola, uniforCD31 + med población que era diferente de los controles de isotipo IgG (Figura 3A). La expresión de mRNA de los marcadores de la CE, incluyendo CD31, Cdh5 (VE-cadherina), CD133, y VEGFR2 en los cuatro clones de la CE probado fue ~ 200 a 7.000 veces mayor que la de fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) que se utilizó como control negativo (Figura 3B). Como era de esperar, todos los clones de la CE expresaron niveles casi indetectables de los genes marcadores mesenquimales COL1A1 y Tagln cuando se compara con MEFs. Tinción de inmunofluorescencia mostró que todas las células de un clon TEC representante eran CD31 + uniforme (Figura 3C). Por otra parte, estos clones CE fueron capaces de formar estructuras de los vasos como espontáneas in vitro, lo que indica que conservan las funciones endoteliales después del cultivo (Figura 3D).
El método de aislamiento fue validado utilizando Cdh5 cre: ZsGreen
Figura 1. Diagrama de Flujo y Descripción general del procedimiento de aislamiento CE.
Figura 2. Dil-Ac-LDL Distingue CE contaminen no comunitario en culturas Live. Contraste (A) Fase y las imágenes fluorescentes que muestran CE y co-aislado no comunitario sin selección anillo clonación de colonias de la CE. (B) de contraste de fase y las imágenes fluorescentes de colonias de la CE en las diferentes etapas de aislamiento. Las líneas punteadas marcan el boundaries de Dil-Ac-LDL + EC y células contaminantes circundantes. Puntas de flechas blancas indican no comunitario fuera una colonia CE que debe ser eliminado con una punta de pipeta. Las barras de escala representan 100 micras. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Clonación Anillos y eliminación física de la No-CE Produce largo plazo culturas CE puras y funcionales. (A) FACS representativos dot parcelas de tinción CD31 de diferentes clones de la CE. Se muestran tres muestras representativas. El rectángulo negro abierto en cada parcela esboza la población CD31 +. Un isotipo IgG se utiliza como un control negativo. (B) Medición de la expresión génica endotelial en NEC y TEC clones seleccionados. Los niveles de mRNA de endotelioial genes CD31, CD133, Cdh5, y VEGFR2 se expresan en relación a los de fibroblastos de embriones de ratón (MEFs), y los niveles de mRNA de los genes COL1A1 y mesenquimales Tagln se expresan en relación a los de NEC-1. (C) la tinción de inmunofluorescencia Representante de un clon de TEC ampliado. CD31 se muestra en verde y los núcleos se tiñen de color azul con 4'6'-diamidino-2-fenilindol (DAPI). (D) Imágenes representativas de la formación de tubos de diferentes clones de la CE chapada en Matrigel. Las barras de escala representan 100 micras. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. CE Aislado del Cdh5 cre: ZsGreen
| Número de celular | Tampón FACS (l) | Anticuerpo CD31-PE (l) |
| 1 x 10 7 | 100 | |
| 2 x 10 7 | 200 | 6 |
| 3 x 10 7 | 300 | 7 |
| 4 x 10 7 | 400 | 8 |
| 5 x 10 7 | 500 | 9 |
| 6 x 10 7 | 600 | 10 |
Tabla 1. Volúmenes anti-CD31 de anticuerpos conjugados con PE Requerido para diferentes números de la célula.
| Número de celular | Tampón FACS (l) | Anti-PE microesferas magnéticas (l) | 1 x 10 7 | 80 | 20 |
| 2 x 10 7 | 160 | 40 |
| 3 x 10 7 | 240 | 60 |
| 4 x 10 7 | 320 | 80 |
| 5 x 10 7 | 400 | 100 |
| 6 x 10 7 | 480 | 120 |
Tabla 2. Volúmenes Anti-PE microperla Obligatorio para diferentes números de la célula.
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Discussion
Debido a las dificultades en la obtención de cultivos puros TEC primaria, muchos estudios in vitro TEC sustituto con las líneas de la CE disponibles comercialmente o CE primaria como la vena umbilical humana CE (HUVEC) 13. Sin embargo, estas poblaciones de la CE de los tejidos normales sólo se pueden servir como sustituto de la TEC que difieren notablemente de sus homólogos normales. Por ejemplo, TEC son fenotípicamente y funcionalmente anormal in vivo y algunas de estas anomalías puede ser transmisible in vitro 14-18. TEC tiene crecimiento, migratoria, y habilidades de diferenciación aberrante y puede fusionarse con células CD31 + tumorales para formar estructuras de los vasos como 16,19,20. Los estudios que utilizan ya sea TEC o captura láser vasos tumorales cultivadas microdiseccionadas han demostrado que se desvían de TEC CE normales en la expresión génica, citogenética y perfiles epigenéticos 12,18,21-23. A pesar de la profundización de nuestra comprensión de la angiogénesis tumoral en el últimodécadas, muy pocos estudios funcionales y mecánicos utilizando TEC primaria cultivadas están disponibles.
CE se aislaron de venas umbilicales humanos a principios del decenio de 1970 24. Aislamiento posterior y el cultivo de microvascular CE de otros tejidos humanos y de ratón ha proporcionado una poderosa herramienta para la investigación de las funciones endoteliales tanto en la salud y la enfermedad 25-28. La mayoría de los protocolos de aislamiento de la CE implican tres pasos principales: la obtención de una suspensión de una sola célula después de la disociación mecánica o digestión enzimática, el etiquetado de EC con un anticuerpo-endotelial específico que se conjuga con o bien un fluoróforo o magnéticos microperlas, y enriquecer la población de las CE utilizando clasificación de células o columnas magnéticas. Sin embargo, el aislamiento de ratón CE, especialmente de tumores, ha demostrado ser difícil debido al bajo rendimiento de CE viable y la contaminación frecuente de otros tipos de células incluyendo las células tumorales y los fibroblastos. Además, in vitro deriva fenotípica de la CE en mícélulas senchymal como (endotelial-mesenquimal transición, EndMT) plantea un desafío adicional para el cultivo a largo plazo de la CE de los tejidos normales, los tumores y precursores reprogramadas.
El principal desafío durante el aislamiento TEC es la contaminación por las células tumorales, que pueden outcompete fácilmente las colonias de crecimiento más lento de la CE que generalmente aparecen después de ~ 7 - 10 días en cultivo. Además, un marcador de selección comúnmente utilizado para el aislamiento de CE es CD31, que se expresa abundantemente en el endotelio, pero también marca las células hematopoyéticas y en algunos casos de tumores subpoblaciones de células 20,30. Por otra parte, mientras que el enriquecimiento de CE, selección de columnas inmunomagnética CD31 mediada no puede eliminar todas las células contaminantes sola que con el tiempo pueden hacerse cargo de las culturas de la CE después de algunos pasajes. Mediante la adición de un paso de anillo de clonación, uno es capaz de seleccionar y expandir las poblaciones de la CE derivadas clonalmente-puros que están libres de estos tipos de células contaminantes. Un segundo desafío es el largo plazo principalmantenimiento de la CE puro sin promoción de EndMT. EndMT se produce durante el desarrollo, puede ser recapitulado durante la disfunción vascular, y es común en EC cultivadas (especialmente en la presencia de TGF) 31-33. Para minimizar EndMT, eliminar las células contaminantes que pueden actuar como una fuente de TGF, mantener los cultivos a altas densidades, y mantener altas concentraciones de bFGF en los medios de comunicación en todo momento. Como hemos demostrado recientemente, bFGF es esencial para preservar la especificación CE, ya que antagoniza expresión TGF-conducido de actina de músculo liso (un marcador EndMT) 34.
Utilizando esta metodología, el aislamiento de la CE, por un reportero ratones "destino asignada" También se demostró. Estos ratones son particularmente útiles en los estudios donde se requiere formación de imágenes 35 intravital. Aunque algunos etiquetado de las células hematopoyéticas puede ocurrir en el cre Cdh5: ZsGreen L / s / l ratones utilizados aquí, este modelo proporciona un método relativamente rápido y fácil para la generación de la gripeorescent CE in vivo. Un modelo alternativo linaje etiquetado CE es un ratón de tamoxifeno inducible (Cdh5 cre / ERT2) cruzada con una cepa de ratón reportero floxed (ZsGreen l / s / l) que tendrá CE fielmente e irreversiblemente marcó 36,37 . CE fluorescente de los ratones cre inducibles también puede ser purificado utilizando FACS o el uso de la metodología se describe en el presente documento.
CE son heterogéneos a través de diferentes lechos vasculares y "dentro de la embarcación" heterogeneidad también puede existir entre la CE dentro del mismo recipiente 38,39. Además, una jerarquía de EC con diferente potencial proliferativo se ha observado en las poblaciones EC aisladas de las venas, y una pequeña fracción de CE clonal puede ser passaged más allá de 40 duplicaciones de población 40. Por lo tanto, las limitaciones del método descrito aquí incluyen: 1) la posible selección de éstos altamente proliferativa CE que reside en la pared del vaso; y 2) el enriquecimiento de una sola specific subtipo vascular derivado de arterias, venas o capilares, lo que puede producir clones que no representan por completo la población total de la CE en vivo. Sin embargo, como múltiples subpoblaciones clonales se pueden obtener de un procedimiento de aislamiento, este método puede ser útil para análisis funcionales y genéticas de la heterogeneidad CE que existe dentro de los tumores y otros tejidos 12. En conjunto, se describe aquí es un método de aislamiento CE que produce colonias puras CE carentes de contaminar no comunitario. Las células aisladas deben ser útiles para estudios in vitro funcionales, de perfiles de expresión de todo el genoma, y la caracterización molecular de las nuevas vías que controlan la angiogénesis tumoral.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic-Antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium (1 g/L D-glucose) (LG-DMEM) | Gibco | 11885-084 | |
| EGM-2 Bullet Kit | Lonza | CC4176 | Not all components used |
| Fetal bovine serum (Hyclone) | Thermo Scientific | SH30071.03 | Heat inactivated at 56 °C for 30 min |
| Nu-Serum IV | Corning | CB-51004 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBBS) | Gibco | 14175-095 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | |
| FACS buffer | 0.5 % BSA and 2 mM EDTA in PBS, filtered through a 0.22 μm filter | ||
| 75% v/v ethanol for disinfection | |||
| Anti-PE microbeads | Miltenyi Biotech | 130-048-801 | |
| Bovine serum albumin (BSA) fraction V, 7.5% | Gibco | 15260-37 | |
| Cell freezing media (Bambanker) | Wako Chemicals | 302-14681 | |
| Collagenase type II | Worthington Biochemical | LS004176 | Make stock concentration 2 mg/ml in HBSS |
| Deoxyribonuclease I (DNase) | Worthington Biochemical | LS002004 | Make stock concentration 1 mg/ml in PBS |
| Dil-Ac-LDL | Biomedical Technologies | BT-902 | |
| EDTA, 0.5M, pH 8.0 | Cellgro | 46-034-CL | |
| Enzymatic cell detachment solution (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | |
| Gelatin, 2% in water, tissue culture grade | Sigma-Aldrich | G1393-100ML | Dilute in PBS to make 0.5% gelatin solution |
| Mouse FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotech | 130-092-575 | |
| Neutral protease (Dispase) | Worthington Biochemical | LS02104 | Make stock concentration 2.5 U/ml in HBSS |
| PE-rat anti-mouse CD31 antibody | BD Pharmingen | 553373 | |
| RBC lysis buffer (BD Pharm Lyse) | BD Pharmingen | 555899 | |
| Sterile water | |||
| Trypan blue, 0.4 % | Life Technologies | 15250-061 | |
| 10 mm tissue culture dishes | Corning | ||
| 15 ml conical tubes (sterile) | Corning | ||
| 50 ml conical tubes (sterile) | Corning | ||
| 6-well tissue culture plates | Corning | ||
| Tissue-dissociator tubes (gentleMACS) C tubes) | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | |
| Cell Separator (MidiMACS) | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| Cell strainer 100 μm | Corning | 352360 | |
| Cloning rings (assorted sizes) | Bel-Art Products | 378470000 | |
| Cryotubes | Thermo Scientific | ||
| Dissecting board | Sterilize or disinfect with 75% v/v ethanol before use | ||
| Dissecting forceps and scissors | Sterilize before use | ||
| Dissecting pins 2" | Sterilize before use | ||
| FACS tubes with 35 μm filter cap | Corning | 352235 | |
| Filter cup (Stericup, 0.22 μm) | Millipore | SCGPU05RE | |
| Fine-tip marker | |||
| Hemocytometer | |||
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| Magnetic Multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Tissue adhesive (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Or a centrifuge with similar capacity for 15 ml and 50 ml conical tube centrifugation |
| Tissue culture hood | |||
| Tissue dissociator (gentleMACS) | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | Preset program "m_impTumor_01" used for tissue dissociation |
| Liquid nitrogen freezer | |||
| Microplate or rotary shaker | |||
| Phase contrast light microscope |
References
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