Abstract
المعزولة حديثا ورم محددة الخلايا البطانية (TEC) يمكن استخدامها لاستكشاف الآليات الجزيئية للورم الأوعية الدموية وتكون بمثابة نموذج في المختبر لتطوير مثبطات تكوين الأوعية الدموية الجديدة للسرطان. ومع ذلك، على المدى الطويل في توسيع المختبر من خلايا بطانة الأوعية الدموية الفئران (EC) يمثل تحديا بسبب الانجراف المظهري في الثقافة (البطانية-إلى-الوسيطة الانتقالية) والتلوث غير EC. هذا صحيح خصوصا بالنسبة TEC التي outcompeted بسهولة عن طريق الخلايا الليفية-تنقيته المشترك أو الخلايا السرطانية في ثقافة هذا. هنا، يتم وصف أسلوب العزل عالية الدقة التي تستفيد من تخصيب immunomagnetic إلى جانب اختيار مستعمرة والتوسع في المختبر. هذا النهج يولد الكسور EC نقية بحيث تكون خالية تماما من تلويث الخلايا اللحمية أو الورم. ويظهر أيضا أن-تتبع النسب Cdh5 لجنة المساواة العرقية: / لتر الفئران مراسل ZsGreen لتر / ثانية، وتستخدم مع بروتوكول صفت هنا، هي أداة قيمة للتحقق من خليةالنقاء كما المستعمرات EC معزولة من هذه الفئران تظهر دائم ورائعة مضان ZsGreen في الثقافة.
Introduction
الخلايا البطانية (EC) ضرورية خلال تطوير الأورام الصلبة. من الشروع في التحول عائية في الأورام النائمة لنشر وزرع البذور من الانبثاث في مواقع بعيدة، EC تشكيل القنوات التي توفر الدم والأكسجين والمواد المغذية للحفاظ على 1 نمو الورم. كما اقترح مؤخرا، لديها EC أيضا ظائف نضح مستقلة وتشكيل المتخصصة التي تدعم نمو الخلايا الجذعية السرطانية والخلايا السرطانية اللحمية أخرى 2-5. وهكذا، منقى للغاية ويسمح ورم محددة EC (TEC) للثقافة في المختبر للدراسات وظيفية روتينية من شأنها أن تسلط الضوء على الآليات الجزيئية الجديدة التوسط الأوعية الدموية السرطانية وعبر الحديث مع الخلايا السرطانية.
EC هي درجة عالية من التخصص اعتمادا على الأنسجة من أصل 6. ونظرا لطبيعة غير متجانسة من أنواع الأورام المختلفة والمكروية ورم، قد TEC أيضا عرض المزايا الفريدة التي تعكس ورم محددة التخصص سو الأوعية الدموية. على سبيل المثال، هناك تقلب اللافت للنظر في توقيع التعبير الجيني في TEC معزولة عن أنواع أو درجات من الأورام 7،8 مختلفة. ومع ذلك، وكثرة شارك في تنقية عدم EC، وخاصة الخلايا الليفية المرتبطة الورم والخلايا السرطانية، مع TEC يمكن أن تربك يحلل التعبير على نطاق الجينوم. هذه أنواع الخلايا غير المرغوب فيها هي إشكالية خاصة في الدراسات التي تعتمد على المدى الطويل في توسيع المختبر من الثقافات TEC.
وصف هنا هو طريقة عالية الدقة التي تنتج باستمرار الثقافات EC نقية من الأورام والأنسجة الأخرى. بعد تخصيب العمود immunomagnetic الكسور EC وإزالة منقى المشترك غير EC، خطوة إضافية الاستنساخ الدائري للقبض على مستعمرات نقية EC يستخدم 9. كل مستعمرة يمكن توسيعها في الثقافة لمقاطع متعددة دون ظهور تلوث غير EC. هذا الأسلوب ينتج أيضا متعددة استنساخ EC من إجراء العزلة واحد، والذي يعتبر مثاليا لدراسة إندوعدم التجانس thelial. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يظهر أن Cdh5 لجنة المساواة العرقية: / لتر الفئران ZsGreen لتر / ثانية مراسل هي أداة قيمة لتوليد "المعنونة مصير" وتميز لا يمحى-EC التي تحافظ على ZsGreen مضان في الثقافة 10. مع تعديلات طفيفة على البروتوكول، وينبغي أن تكون هذه الطريقة قابلة للتكيف مع أنواع الأورام المختلفة أو الأنسجة الطبيعية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يتم تنفيذ بروتوكول التالية وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها إدارة مختبر طب الحيوان في جامعة كارولينا الشمالية في تشابل هيل.
1. إعداد المواد التالية والكواشف قبل بدء
- إعداد EC وسائل الإعلام من خلال استكمال 400 مل انخفاض مستوى السكر (1 جم / لتر D-الجلوكوز أو LG) Dulbecco لتعديل المتوسطة النسر (DMEM) مع 50 مل للحرارة المعطل مصل بقري جنيني، 50 مل نو-المصل IV، 5 مل مضاد حيوي، مضاد فطري، وhFGF، VEGF، hEGF، R3، IGF-1، ومكونات الهيبارين من عدة التجارية.
- إعداد 500 مل FACS العازلة (0.5٪ BSA و 2 ملي EDTA في برنامج تلفزيوني)؛ من خلال تصفية العقيمة 0.22 ميكرون تصفية الكأس.
- تعقيم أو تطهير تشريح متنها.
- تعقيم دبابيس تشريح، مقص جراحي، وdissectors.
2. EC عزل (يوم 1 ~ 5 ساعة)
- الموت ببطء الفأر مع ثاني أكسيد الكربون أو وسائل أخرى الطرافة المتوافقةح لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي (IACUC) السياسات.
ملاحظة: أورام الثدي متعددة متفاوتة في الحجم (5-15 ملم في القطر) قد وضع في ماوس واحدة المعدلة وراثيا مثل C3-TAG، ومن المؤكد أن يحصد كل منهما لTEC العزلة. في حالة استخدام الأورام التي يتم المغروسة orthotopically في الفئران، تجمع 02:58 1 سم 3 أورام لعزل EC واحدة. هنا نستخدم الأورام الثديية كدليل، ولكن يمكن تعديل البروتوكول لأنواع أخرى من الأورام. - تطهير الماوس عن طريق الرش أو مسح الجانب البطني الفأر مع كمية وافرة من 75٪ ت / ت الإيثانول.
- بتر الأورام مع زوج واحد من مقص وdissectors باستخدام تقنيات العقيم في غطاء العقيمة أو على مقاعد البدلاء نظيفة.
- مد ويعلقون أطرافه من الفئران على لوحة تشريح. جعل شق بطني خط الوسط مع مقص دون فتح الغشاء البريتوني. تشريح أفقيا بين الجلد والصفاق نحو الغدد الثديية حيث توجد الأورام.لا تفتح الصفاق.
- المكوس فقط الأنسجة السرطانية من الغدد الثديية، تاركة هوامش الثديية العادية. تقليم بعناية من الأنسجة غير السرطانية مثل الجلد والعضلات، ومكان الأورام تشريح في أنبوب مخروطي يحتوي على 30 مل من LG-DMEM على الجليد.
- جلب عينات الورم لغطاء نسيج الثقافة. غسل الأنسجة مع معقم LG-DMEM 1-2 مرات.
- الأورام نقل من أنبوب مخروطي إلى الأنسجة الثقافة طبق بتري معقمة، إضافة 2 مل من LG-DMEM في الطبق، واللحم المفروم مع زوج من مقص العقيمة إلى قطع <5 مم.
- إضافة 5 مل من كولاجيناز (الأسهم = 2 ملغ / مل في محلول الملح المتوازن هانك، الآخرة HBSS)، 1 مل من dispase (الأسهم = 2.5 U / مل في HBSS) و 75 ميكرولتر من ديوكسي ريبونيوكلياز (الأسهم = 1 ملغ / مل في برنامج تلفزيوني ) في طبق بتري. الحجم الكلي هو حاليا ~ 10 مل.
- نقل مزيج كولاجيناز / الأنسجة من طبق بتري لأنبوب الأنسجة dissociator وتعمل على dissociator الأنسجة لمدة 60 ثانية مرتين (قبل مجموعة تفكك العلاقات العامةogram على dissociator: 1270 إجمالي طلقة في المدى). احتضان مع الضوء تهتز على شاكر لمدة 75 دقيقة عند 37 ° C.
- مرشح هضمها الأنسجة من خلال مصفاة الخلية 100 ميكرون أكثر من 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. تصفية شطف مع 5 مل من العازلة FACS لغسل أي الخلايا المتبقية. تدور في 280 x ج لمدة 5 دقائق ونضح بعناية طاف دون الإخلال بيليه الخلية.
- تمييع 1 مل من الأسهم RBC العازلة تحلل (10X) في 9 مل من الماء المعقم. ليز خلايا الدم الحمراء مع 10 مل من تحلل العازلة (1X)، وعلى الفور تدور 5 دقائق في 280 ز س. ملاحظة: هذه الخطوة يمكن تخطي إذا الدم القليل مرئيا.
- resuspend في 10 مل من العازلة FACS. مزيج 10 ميكرولتر من تعليق زنزانة مع 10 ميكرولتر من التريبان الأزرق، وعدد الخلايا الحية باستخدام عدادة الكريات.
- الخلايا resuspend في ~ 10 7 خلية / 100 ميكرولتر. إضافة 10 ميكرولتر من كتلة FCR لكل 100 ميكرولتر من التعليق الخلية، واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة.
- إضافة الفئران مكافحة الماوس مترافق PE-CD31 الأجسام المضادة وفقا. إلى الجدول 1 احتضان على الجليد لمدة 10 - 15 دقيقة وأنبوب نفض الغبار في بعض الأحيان.
- إضافة 10 مل من العازلة FACS إلى أنبوب وتدور في 280 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة بعناية طاف، ويغسل بيليه الخلايا مرة أخرى مع 5 مل من العازلة FACS. أجهزة الطرد المركزي لتكوير الخلايا. نضح طاف دون بيليه خلية مثير للقلق.
- إضافة FACS العازلة والمضادة للPE بلي وفقا للجدول 2 احتضان على الجليد لمدة 10 - 15 دقيقة. نفض الغبار الأنبوب في بعض الأحيان.
- إضافة 10 مل من العازلة وتدور عينات FACS في 280 x ج لمدة 5 دقائق. يغسل مرة واحدة مع 5 مل من FACS العازلة وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى. نضح طاف دون بيليه مثير للقلق.
- تحقيق وحدة التخزين إلى 300 ميكرولتر في المخزن FACS. تدور خلال 35 ميكرون خلية مصفاة توج أنبوب 5 دقائق في 280 ز س. 2 استخدام الأنابيب وحجم أكبر إذا لزم الأمر.
- انشاء multistand المغناطيسي والأعمدة المغناطيسي في غطاء محرك السيارة، ونعلق عمود إلى فاصل وتتوازن مع العمود 2 مل من العازلة FACS.
- Aspiratالبريد طاف و resuspend بيليه خلية في 0،5-1 مل من العازلة FACS.
- تمرير تعليق الخلية من خلال العمود المغناطيسي معايرتها.
- غسل العمود ثلاث مرات مع 2 مل العازلة FACS، وجمع التدفق من خلال (FT) في أنبوب 15 مل (FT جزء).
- تأخذ العمود قبالة فاصل وأزل مع 2 مل العازلة FACS إلى 15 مل أنبوب (جزء الشطافة) آخر. استخدام المكبس لضمان أن جميع الخلايا من العمود. تكرار شطف مرتين أخريين مع 2 مل من FACS العازلة في كل مرة.
- تدور شطافة في 280 x ج لمدة 5 دقائق.
- إزالة طاف و resuspend بيليه في 10 مل من EC سائل الإعلام.
- تقسيم بالتساوي جزء الشطافة (~ 6 مل) في 10 سم أطباق الجيلاتين المغلفة. لمدة ثلاثة 1 سم 3 الأورام، لوحة مزال الخلايا في أربعة على الأقل لوحات. الخلايا بدلا من ذلك، لوحة مزال بتركيزات مختلفة في لوحات متعددة (على سبيل المثال، البذور 0.5 مل، 1 لتر، 1.5 لتر، و 3 مل من شطافة إلى أربع لوحات) لضمان أنوالمصنف لوحة ر الأقل واحد قليلة مع خلايا مزال. تأكد من أن confluency من الخلايا المرفقة في ~ 1٪ في اليوم التالي (أي حوالي 1،0-2،0 X 10 5 خلايا المرفقة).
ملاحظة: تحتاج هذه الخلايا لتكون مطلية متفرق بحيث المستعمرات EC يمكن أن تشكل دون الملوثة أنواع الخلايا الأخرى. - لوحة FT جزء واحد في صحن 10 سم للسماح للخلايا التعافي O / N. تأكد من أن لوحة هي 80-100٪ متموجة في اليوم التالي. تجميد أسفل الخلايا (-80 ° C) في 250 وسائل الاعلام تجميد الخلايا ميكرولتر في cryotube وتخزينها في النيتروجين السائل في اليوم التالي. ملاحظة: FT جزء يمكن استخدامها لعزل الخلايا السرطانية في مرحلة لاحقة و / أو كعنصر تحكم السلبية لتحليل EC التعبير الجيني من الحيوانات المستنسخة EC معزولة.
- تغيير وسائل الاعلام كل 2-3 أيام. المستعمرات تبدأ بتشكيل بعد 7-10 أيام. يمكن التعرف على المستعمرات EC صغيرة في وقت مبكر من يوم 3. كافة المستعمرات مع علامة غرامة طرف على الجزء السفلي من الطبق.
- كشط ج غير محددةملتعلمي اللغة اإلنكليزية المحيطة المستعمرات التي تم تحديدها مع العقيمة 200 ميكرولتر pippet طرف.
3. مستعمرة اختيار خواتم عن طريق الاستنساخ
- تغيير وسائل الاعلام كل 2-3 أيام. EC نقاء يمكن فحصها من قبل LDL (الجاذبة-AC-LDL) بالإضافة إلى حوالي 5-7 أيام. إضافة 50 ميكرولتر من LDL في 10 مل EC المتوسطة واحتضان لمدة 3-4 ساعة قبل فحص الخلايا تحت المجهر مضان.
ملاحظة: يمكن ملاحظة LDL متعددة + استنساخ EC في ~ يوم 7. - بدء حصاد المستعمرات EC عندما تصل أقطارها من 3-5 ملم في الحجم. (اختر المستعمرات الكبيرة التي تكتظ LDL + خلايا صغيرة حصول على أفضل النتائج.)
- قبل حصاد EC مع حلقات الاستنساخ، قبل معطف بضع 6 لوحات جيدا مع 0.5٪ الجيلاتين. نضح الجيلاتين، إضافة 2 مل من EC وسائل الإعلام إلى كل بئر، والحفاظ على لوحات في حاضنة لحين الحاجة إليها.
- كشط غير EC-على حواف المستعمرات للتأكد من سيسقطون أي أنواع الخلايا الأخرى داخل الحلبة الاستنساخ.
- باستخدامالمجهر على النقيض من المرحلة (4X أو 10X الهدف)، الخطوط العريضة مع علامة غرامة طرف على الجزء السفلي من الطبق ثقافة المناطق التي تحتوي على المستعمرات EC.
- غسل لوحة مع 10 مل من برنامج تلفزيوني وترك طبقة رقيقة جدا من برنامج تلفزيوني في لوحة عندما الشفط. (هام: كمية صغيرة (~ 0.5 مل) من برنامج تلفزيوني سوف تبقي الخلايا على قيد الحياة أثناء إجراء الاستنساخ الدائري، كما لاصقة الأنسجة يحتاج إلى الماء لالسندات).
- اختيار خاتم استنساخ الحجم المناسب. استخدام زوج من ملقط تشريح لالتقاط حلقة، مع وجود طرف الماصة 10 ميكرولتر تطبيق بالتساوي كمية صغيرة من مادة لاصقة الأنسجة على عصابة الاستنساخ.
ملاحظة: استخدام كمية ضئيلة فقط (~ 0.2 ميكرولتر لحلقة صغيرة) من مادة لاصقة الأنسجة على حلقات الاستنساخ، وجعل ينتشر على يقين من لاصق الأنسجة بشكل متساو في جميع أنحاء السطح السفلي لضمان ختم جيدة. لاصق الأنسجة المفرط تنتج الحرارة ويشكل الأفلام التي قد تقتل الخلايا. - ضع حلقة الاستنساخ على المستعمرة EC. اضغط بلطف إلى أسفل الحلبة الاستنساخ لالغراء رينانوغرام على طبق. تأكد من أن المستعمرات لا جفت قبل الإلتصاق الحلبة.
- الماصة على الفور 25 ميكرولتر من الأنزيمي حل انفصال الخلايا في حلقة الاستنساخ واحتضان ~ 1 دقيقة أو حتى يتم إرفاق خلايا فضفاضة.
- الخلايا الماصة في حلقة الاستنساخ قطرة من الحكمة في بئر واحدة من لوحة 6 جيدا تحتوي على وسائل الإعلام EC قبل تحسنت. (هام: لا يهز لوحة لتفريق الخلايا وEC يفضل أن تنمو في مجموعات ضيقة.) اغسل حلقة الاستنساخ مع 50-100 سائل الإعلام EC ميكرولتر لجمع أكبر عدد ممكن من الخلايا وقت ممكن، ونقل جميع يغسل في نفس 6 جيدا .
- وإذا كان بعض المستعمرات في صحن 10 سم صغيرة جدا لموسم الحصاد، إضافة 10 مل وسائل الإعلام الجديدة، والسماح للمستعمرات تنمو لبضعة أيام، وكرر الإجراء حلقة الاستنساخ مرة أخرى.
- تنمو المستعمرات التي تحصد في 6 لوحات جيدا حتى 80-100٪ متموجة، ونقل الخلايا إلى 3 آبار لوحة 6 جيدا، قبل توسيعها في صحن 10 سم زراعة الأنسجة. كشط الخلايا الملوثة. تكررجولة أخرى من إجراءات حلقة الاستنساخ (الخطوات 3،5 حتي 3،10) إذا لزم الأمر. حفاظ على الخلايا متموجة نسبيا (~ 60-70٪) عند التوسع. EC قد تتوقف عن النمو إذا مطلي متفرق جدا.
- تميز EC قبل FACS، وتلطيخ، PCR، وما إلى ذلك لاحظ أن ديل-AC-LDL هو فلوري وربما يتعارض مع PE أو الأجسام المضادة فلوري أخرى للFACS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
EC تمثل سوى جزء بسيط من مجموع السكان الخلية في معظم أنسجة البالغين 11. ولذلك فمن المهم لهضم تماما الأنسجة التي تحصد في تعليق وحيد الخلية يضمن الافراج القصوى من EC من المصفوفة خارج الخلية (ECM) والأنسجة الضامة. في تجربتنا، بوساطة CD31 اختيار immunomagnetic يوفر فقط المخصب ولكن ليس محض الكسور EC. لذلك، خطوة حاسمة أخرى هي إزالة المادية للغير EC-تنقية المشترك، واختيار / توسيع المستعمرات EC باستخدام الاستنساخ حلقات (الشكل 1). على سبيل المثال، عندما CD31 التخصيب EC كانت مطلية دون مزيد من اختيار مستعمرة، غير EC-انتشرت بسرعة وتتداخل مع EC، إنتاج الثقافات EC النجسة كما يتضح من ديل-AC-LDL + والجاذبة-AC-LDL - السكان (الشكل 2A) . ومع ذلك، عندما كانت مطلية eluates عمود في منخفض الكثافة، نمت المستعمرات EC مع عدد قليل نسبيا المحيطة غير EC-التي تم إزالتها عن طريق الشورياغتصاب مع طرف الماصة (الشكل 2B). نمو ونقاء المستعمرات الموسع يمكن رصدها أكثر بإضافة ديل-AC-LDL. ويمكن ملاحظة المستعمرات EC صغيرة في ~ اليوم السابع بعد تخصيب العمود بوساطة CD31 (الشكل 2B، والألواح العليا). بعد اختيار وتوسيع المستعمرات EC، ديل-AC-LDL - يتم استبعاد الخلايا، والسكان الخلية نقية للغاية لديل-AC-LDL + EC كما يتبين من امتصاص ديل-AC-LDL (الشكل 2B، لوحات أسفل).
لاختبار ما إذا كانت طريقة العزلة يمكن أن تنتج نتائج متسقة، استنساخ متعددة مشتقة من أي أورام الثدي مقطوعة من C3-TAG (FVB / N C3 1 -TAg) الفئران أو الغدد الثديية طبيعية من النوع البري الفئران FVB العمر المتطابقة تم عزل وتوسيعها 12. وبعد ذلك تتميز نقاء كل TEC وطبيعية EC (NEC) السكان بعناية لضمان نقاء. التدفق الخلوي وأظهرت تحليلات لثلاث عينات مستقلة واحدة، اللباس الموحدCD31 + ميد السكان التي كانت تختلف عن الضوابط مفتش نمط إسوي (الشكل 3A). كان التعبير مرنا من علامات EC، بما في ذلك CD31، Cdh5 (VE كادهيرين)، CD133، وVegfr2 في جميع الحيوانات المستنسخة EC أربعة اختبار أعلى ~ 200 إلى 7000 مرة من أن من الخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEFS) التي كانت تستخدم كقاعدة للسيطرة سلبية (الشكل 3B). كما هو متوقع، أعربت جميع الحيوانات المستنسخة EC مستويات لا يمكن الكشف عنها تقريبا من الجينات علامة الوسيطة Col1a1 وTagln بالمقارنة مع MEFS. أظهر تلوين مناعي أن جميع الخلايا في TEC استنساخ تمثيلي كانت CD31 + موحد (الشكل 3C). وعلاوة على ذلك، كانت هذه الحيوانات المستنسخة EC قادرة على تشكيل هياكل الأوعية الدموية مثل عفوية في المختبر، مشيرا إلى أنها تحتفظ ظائف البطانية بعد زراعة (الشكل 3D).
تم التحقق من صحة طريقة العزل باستخدام مزيد من Cdh5 لجنة المساواة العرقية: ZsGreen
الشكل 1. مخطط التدفق، ونظرة عامة على إجراء العزل EC.
الشكل 2. ديل-AC-LDL يميز EC من تلويث غير EC في الثقافات الحية. النقيض من ذلك (A) المرحلة والصور الفلورسنت تظهر EC وغير EC-دون استنساخ الدائري اختيار المستعمرات EC-معزولة المشترك. (B) على النقيض المرحلة والصور الفلورسنت من المستعمرات الأوروبية في مراحل مختلفة من العزلة. الخطوط المنقطة بمناسبة boundariوفاق من دل-AC-LDL + EC والمناطق المحيطة بها الخلايا الملوثة. السهام البيضاء تدل غير EC-خارج مستعمرة EC التي يجب إزالتها مع طرف ماصة. الحانات النطاق تمثل 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. الاستنساخ خواتم وإزالة المادية للغير-EC بانتاج المدى الطويل الثقافات EC الصرفة والوظيفية. نقطة (A) FACS التمثيلية قطع CD31 تلطيخ من الحيوانات المستنسخة EC مختلفة. يتم عرض ثلاث عينات تمثيلية. المستطيل الأسود مفتوح في كل قطعة ويعرض السكان CD31 +. تم استخدام نمط إسوي مفتش كوسيلة لمراقبة سلبية. (B) قياس التعبير الجيني البطانية في مجموعة مختارة من NEC وTEC الحيوانات المستنسخة. مستويات مرنا من endothelيتم التعبير عن الجينات الاتحاد العالمي للتعليم CD31، CD133، Cdh5، وVegfr2 بالنسبة لتلك الخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEFS)، ويتم التعبير عن مستويات مرنا من الجينات الوسيطة Col1a1 وTagln النسبي لتلك NEC-1. (C) تلطيخ مناعي ممثل لاستنساخ TEC الموسعة. ويرد CD31 باللون الأخضر وهي ملطخة نوى الأزرق مع 4'6'-diamidino-2-phenylindole (دابي). (D) صور الممثل تشكيل أنبوب عن طريق استنساخ EC مختلفة مطلي على Matrigel. الحانات النطاق تمثل 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. EC معزولة عن Cdh5 لجنة المساواة العرقية: ZsGreen
| عدد الخلايا | العازلة FACS (ميكرولتر) | CD31-PE الأجسام المضادة (ميكرولتر) |
| 1 × 10 7 | 100 | |
| 2 × 10 7 | 200 | 6 |
| 3 × 10 7 | 300 | 7 |
| 4 × 10 7 | 400 | 8 |
| 5 × 10 7 | 500 | 9 |
| 6 × 10 7 | 600 | 10 |
الجدول 1. PE مترافق مكافحة CD31 الأجسام المضادة وحدات التخزين المطلوبة لأرقام مختلفة من الخلايا.
| عدد الخلايا | FACS العازلة (ميكرولتر) | مكافحة-PE بلي المغناطيسي (ميكرولتر) | 1 × 10 7 | 80 | 20 |
| 2 × 10 7 | 160 | 40 |
| 3 × 10 7 | 240 | 60 |
| 4 × 10 7 | 320 | 80 |
| 5 × 10 7 | 400 | 100 |
| 6 × 10 7 | 480 | 120 |
الجدول 2. أحجام التداول مكافحة PE Microbead مطلوبة للأرقام مختلفة من الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بسبب الصعوبات في الحصول على نقية الثقافات TEC الابتدائي، العديد من الدراسات في المختبر TEC البديل مع خطوط EC المتاحة تجاريا أو EC الأولية مثل الوريد السري البشري EC (HUVEC) 13. ومع ذلك، هؤلاء السكان EC من الأنسجة الطبيعية قد إلا أن تكون بمثابة وكيل لTEC والتي تختلف بشكل ملحوظ من نظرائهم العادية. على سبيل المثال، TEC هي ظاهريا وغير طبيعي وظيفيا في الجسم الحي وبعض هذه التشوهات قد يكون انتقاله في المختبر 14-18. TEC لدينا نمو الشاذة، المهاجرة، وقدرات التمايز ويمكن أن تلتحم مع CD31 + ورم الخلايا لتشكيل هياكل الأوعية الدموية مثل 16،19،20. وقد أظهرت الدراسات التي تستخدم إما مثقف TEC أو التقاط ليزر الأوعية الورم تشريح الصغيرة التي تحيد TEC من EC الطبيعية في التعبير الجيني، خلوي، وملامح جينية 12،18،21-23. على الرغم من تعميق فهمنا للورم الأوعية الدموية أكثر من الماضيتتوفر عدة عقود، عدد قليل جدا من الدراسات الفنية والميكانيكية باستخدام TEC الأساسي مثقف.
تم عزل EC من الأوردة السري الإنسان في 1970s في وقت مبكر 24. وقد وفرت العزلة اللاحقة وزراعة الاوعية الدموية الدقيقة EC عن غيرها من الأنسجة البشرية والماوس أداة قوية للتحقيق في وظائف بطانة الأوعية الدموية في كل من الصحة والمرض 25-28. معظم البروتوكولات العزلة EC تتضمن ثلاث خطوات رئيسية هي: الحصول على تعليق وحيد الخلية بعد التفكك الميكانيكية أو الهضم الأنزيمي، واصفة EC مع الأجسام المضادة البطانية الخاصة التي مترافق إما إلى fluorophore أو المغناطيسية بلي، وإثراء السكان EC باستخدام الخلايا الفرز أو أعمدة المغناطيسية. ومع ذلك، عزل الماوس EC، وخاصة من الأورام، وقد ثبت صعوبة بسبب انخفاض العائد من EC قابلة للحياة والتلوث المتكرر من أنواع الخلايا الأخرى بما في ذلك الخلايا السرطانية والخلايا الليفية. بالإضافة إلى ذلك، في المختبر المظهرية الانجراف من EC إلى ليخلايا senchymal مثل (البطانية-إلى-الوسيطة الانتقالية، EndMT) تشكل تحديا إضافيا للزراعة على المدى الطويل EC من الأنسجة الطبيعية، والأورام، والسلائف برمجتها.
التحدي الرئيسي خلال TEC العزلة هو التلوث الخلايا السرطانية، والتي يمكن بسهولة تكومبيتي المستعمرات EC أبطأ نموا التي تظهر عادة بعد ~ 7-10 أيام في الثقافة. وبالإضافة إلى ذلك، علامة اختيار تستخدم عادة لعزل EC هي CD31 وهو ما يعبر عنه تماما في البطانة ولكن أيضا علامات الخلايا المكونة للدم، وفي بعض القطعان خلية حالات الورم 20،30. وعلاوة على ذلك، في حين إثراء لEC، واختيار عمود immunomagnetic بوساطة CD31 لا يمكن إزالة كل خلية تلويث واحدة التي يمكن أن تتخذ في نهاية المطاف على الثقافات EC بعد بضع فقرات. بإضافة خطوة الاستنساخ الدائري، هو واحد قادرا على تحديد وتوسيع النقي السكان EC المستمدة متطابق بسلالة التي تكون خالية من هذه أنواع الخلايا الملوثة. والتحدي الثاني هو الرئيسي على المدى الطويلtenance من الذهب الخالص EC دون تعزيز EndMT. يحدث EndMT خلال التنمية، ويمكن تلخيصها خلال ضعف الأوعية الدموية، وأمر شائع في تربيتها EC (وخصوصا في وجود TGFβ) 31-33. للحد من EndMT، وإزالة الخلايا الملوثة التي قد تكون بمثابة مصدر TGFβ، والحفاظ على الثقافات بكثافات عالية، والحفاظ على تركيزات عالية من bFGF في وسائل الإعلام في جميع الأوقات. كما بينا في الآونة الأخيرة، bFGF أمر ضروري للحفاظ على مواصفات EC كما إن ذلك أمر يستثير التعبير يحركها TGFβ أكتين العضلات الملساء (علامة EndMT) 34.
باستخدام هذه المنهجية، عزل EC من الفئران مراسل "المعنونة مصير" وقد تبين أيضا. هذه الفئران هي مفيدة بشكل خاص في الدراسات التي تحتاج إلى التصوير حيوي داخلي 35. على الرغم من أن بعض العلامات على الخلايا المكونة للدم قد تحدث في لجنة المساواة العرقية Cdh5: ZsGreen لتر / ثانية / الفئران ل المستخدمة هنا، يوفر هذا النموذج وسيلة سريعة وسهلة نسبيا لتوليد انفلونزاorescent EC في الجسم الحي. ومن EC نموذج النسب وضع العلامات البديل هو ماوس تاموكسيفين محرض عبرت (Cdh5 لجنة المساواة العرقية / ERT2) مع سلالة الماوس مراسل floxed (ZsGreen لتر / ثانية / لتر) التي سيكون لها EC بأمانة وبشكل لا رجعة فيه ملحوظ 36،37 . EC الفلورسنت من الفئران لجنة المساواة العرقية محرض يمكن أيضا تنقيته باستخدام FACS أو باستخدام منهجية وصفنا هنا.
EC هي غير متجانسة عبر الأوعية الدموية المختلفة الأسرة و"داخل السفينة" عدم التجانس قد تكون موجودة أيضا بين EC داخل نفس السفينة 38،39. بالإضافة إلى ذلك، لوحظ التسلسل الهرمي للEC مع إمكانية التكاثري مختلفة في السكان EC معزولة عن الأوردة، وجزء صغير من نسيلي EC يمكن passaged تتجاوز 40 السكان الأضعاف 40. ولذلك، القيود المفروضة على الطريقة الموضحة هنا ما يلي: 1) اختيار المحتملة لهذه EC التكاثري للغاية المقيمين في جدار الوعاء الدموي. و2) إثراء المواصفات واحدة فقطIFIC سلالة الأوعية الدموية المستمدة من الشرايين والأوردة والشعيرات الدموية أو التي قد تنتج الحيوانات المستنسخة التي لا تمثل تماما مجموع السكان EC في الجسم الحي. ومع ذلك، كما القطعان نسيلي متعددة يمكن الحصول عليها من إجراء العزل واحد، وهذه الطريقة يمكن أن تكون مفيدة للتحليلات الوظيفية والوراثية للEC التجانس موجود داخل الأورام والأنسجة الأخرى 12. معا، وصفت هنا هو طريقة عزل EC التي تنتج مستعمرات EC نقية خالية من تلويث غير EC. يجب أن تكون الخلايا المعزولة مفيدة لفي الدراسات المختبرية وظيفية، الجينوم على نطاق التعبير التنميط، والتوصيف الجزيئي للمسارات الجديدة التي تتحكم ورم الأوعية الدموية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic-Antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium (1 g/L D-glucose) (LG-DMEM) | Gibco | 11885-084 | |
| EGM-2 Bullet Kit | Lonza | CC4176 | Not all components used |
| Fetal bovine serum (Hyclone) | Thermo Scientific | SH30071.03 | Heat inactivated at 56 °C for 30 min |
| Nu-Serum IV | Corning | CB-51004 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBBS) | Gibco | 14175-095 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | |
| FACS buffer | 0.5 % BSA and 2 mM EDTA in PBS, filtered through a 0.22 μm filter | ||
| 75% v/v ethanol for disinfection | |||
| Anti-PE microbeads | Miltenyi Biotech | 130-048-801 | |
| Bovine serum albumin (BSA) fraction V, 7.5% | Gibco | 15260-37 | |
| Cell freezing media (Bambanker) | Wako Chemicals | 302-14681 | |
| Collagenase type II | Worthington Biochemical | LS004176 | Make stock concentration 2 mg/ml in HBSS |
| Deoxyribonuclease I (DNase) | Worthington Biochemical | LS002004 | Make stock concentration 1 mg/ml in PBS |
| Dil-Ac-LDL | Biomedical Technologies | BT-902 | |
| EDTA, 0.5M, pH 8.0 | Cellgro | 46-034-CL | |
| Enzymatic cell detachment solution (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | |
| Gelatin, 2% in water, tissue culture grade | Sigma-Aldrich | G1393-100ML | Dilute in PBS to make 0.5% gelatin solution |
| Mouse FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotech | 130-092-575 | |
| Neutral protease (Dispase) | Worthington Biochemical | LS02104 | Make stock concentration 2.5 U/ml in HBSS |
| PE-rat anti-mouse CD31 antibody | BD Pharmingen | 553373 | |
| RBC lysis buffer (BD Pharm Lyse) | BD Pharmingen | 555899 | |
| Sterile water | |||
| Trypan blue, 0.4 % | Life Technologies | 15250-061 | |
| 10 mm tissue culture dishes | Corning | ||
| 15 ml conical tubes (sterile) | Corning | ||
| 50 ml conical tubes (sterile) | Corning | ||
| 6-well tissue culture plates | Corning | ||
| Tissue-dissociator tubes (gentleMACS) C tubes) | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | |
| Cell Separator (MidiMACS) | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| Cell strainer 100 μm | Corning | 352360 | |
| Cloning rings (assorted sizes) | Bel-Art Products | 378470000 | |
| Cryotubes | Thermo Scientific | ||
| Dissecting board | Sterilize or disinfect with 75% v/v ethanol before use | ||
| Dissecting forceps and scissors | Sterilize before use | ||
| Dissecting pins 2" | Sterilize before use | ||
| FACS tubes with 35 μm filter cap | Corning | 352235 | |
| Filter cup (Stericup, 0.22 μm) | Millipore | SCGPU05RE | |
| Fine-tip marker | |||
| Hemocytometer | |||
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| Magnetic Multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Tissue adhesive (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Or a centrifuge with similar capacity for 15 ml and 50 ml conical tube centrifugation |
| Tissue culture hood | |||
| Tissue dissociator (gentleMACS) | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | Preset program "m_impTumor_01" used for tissue dissociation |
| Liquid nitrogen freezer | |||
| Microplate or rotary shaker | |||
| Phase contrast light microscope |
References
- Folkman, J. Anti-angiogenesis: new concept for therapy of solid tumors. Ann. Surg. 175 (3), 409-416 (1972).
- Butler, J. M., Kobayashi, H., Rafii, S. Instructive role of the vascular niche in promoting tumour growth and tissue repair by angiocrine factors. Nat. Rev. Cancer. 10 (2), 138-146 (2010).
- Franses, J. W., Baker, A. B., Chitalia, V. C., Edelman, E. R. Stromal endothelial cells directly influence cancer progression. Sci. Transl. Med. 3 (66), 66ra5 (2011).
- Calabrese, C., et al. A perivascular niche for brain tumor stem cells. Cancer Cell. 11 (1), 69-82 (2007).
- Beck, B., et al. A vascular niche and a VEGF-Nrp1 loop regulate the initiation and stemness of skin tumours. Nature. 478 (7369), 399-403 (2011).
- Aird, W. C.
- Dudley, A. C.
- Aird, W. C.
- Voyta, J. C., Via, D. P., Butterfield, C. E., Zetter, B. R. Identification and isolation of endothelial cells based on their increased uptake of acetylated-low density lipoprotein. J. Cell Biol. 99 (6), 2034-2040 (1984).
- Zovein, A. C., et al. Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 3 (6), 625-636 (2008).
- Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., van der Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat. Protoc. 3 (6), 1085-1091 (2008).
- Xiao, L., Harrell, J. C., Perou, C. M., Dudley, A. C. Identification of a stable molecular signature in mammary tumor endothelial cells that persists in vitro. Angiogenesis. 17 (3), 511-518 (2014).
- Beijnum, J. R., et al. Gene expression of tumor angiogenesis dissected: specific targeting of colon cancer angiogenic vasculature. Blood. 108 (7), 2339-2348 (2006).
- McDonald, D. M., Choyke, P. L. Imaging of angiogenesis: from microscope to clinic. Nat. Med. 9 (6), 713-725 (2003).
- Baluk, P., Hashizume, H., McDonald, D. M. Cellular abnormalities of blood vessels as targets in cancer. Curr. Opin. Genetics Dev. 15 (1), 102-111 (2005).
- Ghosh, K., et al. Tumor-derived endothelial cells exhibit aberrant Rho-mediated mechanosensing and abnormal angiogenesis in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (32), 11305-11310 (2008).
- Amin, D. N., Hida, K., Bielenberg, D. R., Klagsbrun, M. Tumor endothelial cells express epidermal growth factor receptor (EGFR) but not ErbB3 and are responsive to EGF and to EGFR kinase inhibitors. Cancer Res. 66 (4), 2173-2180 (2006).
- Hida, K., et al. Tumor-associated endothelial cells with cytogenetic abnormalities. Cancer Res. 64 (22), 8249-8255 (2004).
- Dudley, A. C., et al. Calcification of multipotent prostate tumor endothelium. Cancer Cell. 14 (3), 201-211 (2008).
- Dunleavey, J. M., et al. Vascular channels formed by subpopulations of PECAM1(+) melanoma cells. Nat. Comm. 5, 5200 (2014).
- St Croix, B., et al. Genes expressed in human tumor endothelium. Science. 289 (5482), 1197-1202 (2000).
- Bhati, R., et al. Molecular characterization of human breast tumor vascular cells. Am. J. Pathol. 172 (5), 1381-1390 (2008).
- Johnson, C. S., Chung, I., Trump, D. L. Epigenetic silencing of CYP24 in the tumor microenvironment. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 121 (1-2), 338-342 (2010).
- Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Folkman, J. Human vascular endothelial cells in culture. Growth and DNA synthesis. J. Cell Biol. 60 (3), 673-684 (1974).
- Burridge, K. A., Friedman, M. H. Environment and vascular bed origin influence differences in endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 299 (3), H837-H846 (2010).
- Zhang, J., Burridge, K. A., Friedman, M. H. In vivo differences between endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries revealed by microarray analysis. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295 (4), H1556-H1561 (2008).
- Paruchuri, S., et al. Human pulmonary valve progenitor cells exhibit endothelial/mesenchymal plasticity in response to vascular endothelial growth factor-A and transforming growth factor-beta2. Circ. Res. 99 (8), 861-869 (2006).
- Wylie-Sears, J., Aikawa, E., Levine, R. A., Yang, J. -H., Bischoff, J. Mitral valve endothelial cells with osteogenic differentiation potential. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31 (3), 598-607 (2011).
- Ginsberg, M., et al. Efficient direct reprogramming of mature amniotic cells into endothelial cells by ETS factors and TGFβ suppression. Cell. 151 (3), 559-575 (2012).
- Sapino, A., et al. Expression of CD31 by cells of extensive ductal in situ and invasive carcinomas of the breast. J. Path. 194 (2), 254-261 (2001).
- Maddaluno, L., et al. EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations. Nature. 498 (7455), 492-496 (2013).
- Cooley, B. C., et al. TGF-β signaling mediates endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT) during vein graft remodeling. Sci. Transl. Med. 6 (227), 227ra34-227ra34 (2014).
- Garcia, J., et al. Tie1 deficiency induces endothelial-mesenchymal transition. EMBO Rep. 13 (5), 431-439 (2012).
- Xiao, L., et al. Tumor endothelial cells with distinct patterns of TGFβ-driven endothelial-to-mesenchymal transition. Cancer Res. 75 (7), 1244-1254 (2015).
- Kusumbe, A. P., Ramasamy, S. K., Adams, R. H. Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone. Nature. 507 (7492), 323-328 (2014).
- Wang, L., et al. Identification of a clonally expanding haematopoietic compartment in bone marrow. EMBO J. 32 (2), 219-230 (2012).
- Sawamiphak, S., et al. Ephrin-B2 regulates VEGFR2 function in developmental and tumour angiogenesis. Nature. 465 (7297), 487-491 (2010).
- Chi, J. -T., et al. Endothelial cell diversity revealed by global expression profiling. Proc. Natl. Acad. Sci. 100 (19), 10623-10628 (2003).
- Nolan, D. J., et al. Molecular signatures of tissue-specific microvascular endothelial cell heterogeneity in organ maintenance and regeneration. Dev. Cell. 26 (2), 204-219 (2013).
- Ingram, D. A., et al. Vessel wall-derived endothelial cells rapidly proliferate because they contain a complete hierarchy of endothelial progenitor cells. Blood. 105 (7), 2783-2786 (2005).
