Abstract
新しく単離した腫瘍特異的内皮細胞（TEC）は、腫瘍の血管新生の分子機構を探索し、癌の新規血管新生阻害剤を開発するためのインビトロモデルとしての役割を果たすために使用することができます。しかし、マウスの内皮細胞（EC） の in vitroでの展開での長期起因非ECに表現型の文化のドリフト（内皮-間葉移行）や汚染に困難です。これは容易に培養液中の共精製された線維芽細胞または腫瘍細胞によってoutcompetedされているTECに特に当てはまります。ここでは、コロニーの選択にインビトロで結合された拡張免疫磁気濃縮を利用する高忠実度の分離方法について説明します。このアプローチは、間質細胞または腫瘍細胞の汚染の全く自由である純粋なECの画分を生成します。また、その系譜トレースCdh5のCREを示している：本明細書で説明するプロトコルで使用ZsGreen リットル/秒/リットルレポーターマウスは、セルを検証する貴重なツールですこれらのマウスから単離したECコロニーとして純度は、文化の中で、耐久性と鮮やかなZsGreenの蛍光を示します。
Introduction
内皮細胞（EC）は、固形腫瘍の開発中に必要不可欠です。休眠腫瘍における血管新生スイッチの開始から離れた部位に転移の普及と播種に、ECは、血液を提供導管を形成する酸素および栄養素は、腫瘍増殖1を維持します 。最近示唆したように、ECはまた、灌流独立した機能を有しており、がん幹細胞および他の腫瘍間質細胞2-5の増殖を支持するニッチを形成します。このように、高度に精製された腫瘍特異的EC（TEC） のin vitro培養のための腫瘍血管新生および腫瘍細胞とのクロストークを仲介する新たな分子メカニズムの解明に役立つであろうルーチン機能研究を可能にします。
ECの起源6の組織に応じて高度に専門化しています。異なる腫瘍タイプの不均一な性質及び腫瘍微小環境に、TECはまた、腫瘍特異的分業Oを反映して独自の機能が表示されることがあります血管系F。例えば、異なる種類または腫瘍7,8のグレードから分離されたTECにおける遺伝子発現シグネチャの著しい変動があります。しかし、TECと、特に腫瘍関連線維芽細胞および腫瘍細胞、非ECの同時精製頻繁には、ゲノムワイドな発現解析を混乱することができます。これらの望ましくない細胞型は、TEC培養物のインビトロでの拡大を長期的に依存している研究では特に問題です。
ここで説明するには、一貫して腫瘍および他の組織からの純粋なEC培養を生成し、高忠実度の方法です。 EC画分と共精製された非ECの除去の免疫列濃縮した後、追加のクローニングリングステップは9を使用している純粋なECコロニーをキャプチャします。各コロニーは、非ECを汚染することなく、複数出現継代培養で増殖することができます。また、この方法は、遠藤の研究のための理想的である単一の単離手順、から複数のECクローンをもたらしthelial異質。 ZsGreen リットル/秒/リットルレポーターマウス文化10でZsGreen蛍光を維持する「運命マッピングされた」と消えないマークされたECを生成するための貴重なツールです。また、Cdh5 CREがいることを示しています。プロトコルへの微調整では、この方法は、異なる腫瘍タイプまたは正常組織に適応する必要があります。
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Protocol
以下のプロトコルは、ノースカロライナ大学チャペルヒル校で実験動物医学科によって確立されたガイドラインに従って実施されます。
1.開始する前に、以下の材料および試薬を準備します
- 50ミリリットルの熱不活性化ウシ胎児血清、50ミリリットルのNu-血清IV、抗生物質 - 抗真菌5ミリリットルと400ミリリットルを低グルコースを補充することにより、ECのメディアを準備します（1グラム/ LのD-グルコースまたはLG）ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）そして、のhFGF、VEGF、のhEGF、R3-IGF-1、および市販のキットからのヘパリン成分は。
- 500 mLのFACS緩衝液（0.5％BSA、PBS中の2mM EDTA）を調製。滅菌0.22μmのフィルターカップを通して濾過します。
- 滅菌またはボードを解剖消毒。
- 解剖ピン、手術用はさみ、および解剖器具を滅菌します。
2. EC単離（1日目〜5時間）
- 二酸化炭素または他の方法に準拠し機知にマウスを安楽死させます時間制度動物実験委員会（IACUC）方針。
注：サイズが異なる複数の乳腺腫瘍（5 - 直径15mm）は、このようなC3-TAGのような単一の遺伝的に改変マウスで開発することがあり、TECの分離のためにそれらのすべてを収穫してください。単一のEC単離のために同所性マウスに移植している腫瘍、プール2 1 3センチ3の腫瘍を使用した場合。ここでは、デモンストレーションとしての乳腺腫瘍を使用したが、プロトコールは、腫瘍の他のタイプに変更することができます。 - 噴霧または、75％（v / v）のエタノールの十分な量で、マウス腹側を拭いて、マウスを消毒します。
- 無菌フード内やクリーンベンチで無菌技術を用いて、ハサミや解剖の1組で腫瘍を切除します。
- 伸ばし解剖ボード上のマウスの四肢を固定します。腹膜を開かずにハサミで正中切開腹を行います。皮膚腫瘍が配置されている乳腺に向かって腹膜の間に横方向に解剖。腹膜を開けないでください。
- 消費税のみ腫瘍乳腺組織から、正常な乳房余白を残します。慎重に、皮膚や筋肉などの非腫瘍組織を切り落とすと、氷上でLG-DMEM 30 mlを含むコニカルチューブに解剖した腫瘍を配置します。
- 組織培養フードに腫瘍サンプルを持参。 2回 - 無菌LG-DMEM 1で組織を洗います。
- 無菌の組織培養シャーレへのコニカルチューブから転送腫瘍は、皿にLG-2mlのDMEMを追加し、片に滅菌ハサミ<5 mmのミンチ。
- PBS中、ディスパーゼの1ミリリットルを（ストック=ハンクス液中の2mg / mlの、HBSSを以後）コラゲナーゼの5ミリリットルを追加します（ストック= HBSS中2.5 U / ml）およびデオキシ75μlの（株= 1 mg / mlの）ペトリ皿に。トータルボリュームは今〜10ミリリットルです。
- （予め設定された解離PR組織解離管にペトリ皿からコラゲナーゼ/組織ミックスを移し、二回60秒のための組織解離で実行解離にogram：1回あたり1,270合計ラウンド）。光は37℃で75分間シェーカー上で振盪しながらインキュベートします。
- フィルターを50mlコニカルチューブの上に100μmのセルストレーナーを通して組織を消化しました。残りの細胞を洗浄するためにFACS緩衝液5mlでフィルターを洗浄します。 5分間280×gでスピンし、慎重に細胞ペレットを乱すことなく、上清を吸引除去します。
- 滅菌水9mlの株式RBC溶解バッファー（10倍）の1ミリリットルを希釈します。溶解緩衝液（1×）の10 mlの溶解赤血球、すぐ280 X gで5分間回転さ。注：少し血が表示されている場合、この手順はスキップすることができます。
- FACS緩衝液10ml中に再懸濁。トリパンブルーの10μlの細胞懸濁液10μlを混合し、血球計数器を使用して生細胞を数えます。
- 〜10 7細胞 /100μlので細胞を再懸濁します。 100μlの細胞懸濁液あたりのFcRブロックの10μlを添加し、氷上で10分間インキュベートします。
- ラット抗マウスPE結合CD31抗体を追加。たまに15分とフリックチューブ- 表1に10氷上でインキュベートします。
- 5分間280×gでチューブとスピンにFACS緩衝液10mlのを追加します。注意深く上清を除去し、FACS緩衝液5mlで再び細胞ペレットを洗浄します。細胞をペレット化するために遠心分離。細胞ペレットを乱すことなく、上清を吸引。
- 表2に記載の FACS緩衝液および抗PEマイクロビーズを追加10氷上でインキュベートする- 。15分。時折フリックチューブ。
- 5分間280×gでFACS緩衝液とスピンのサンプルの10ミリリットルを追加します。再びFACS緩衝液および遠心5mlで1回洗浄。ペレットを乱すことなく上清を吸引。
- FACS緩衝液中で300μlにボリュームを持参してください。 280 X gで5分間、35ミクロンの細胞ストレーナーキャップ付きチューブを介してスピン。必要に応じて2チューブと、より大きなボリュームを使用してください。
- 、フード内で磁気multistandと磁気カラムを設定し、セパレータに列を添付し、FACS緩衝液2mlでカラムを平衡化。
- AspiratE上清と0.5で細胞ペレットを再懸濁 - FACS緩衝液1ml。
- 平衡化した磁気カラムを通して細胞懸濁液を渡します。
- FACS緩衝液2mlでカラムを3回洗浄し、15mlチューブ（FT画分）にフロースルー（FT）を収集。
- セパレーターオフ列を取り、別の15mlチューブ（溶出画分）にFACS緩衝液2mlで溶出します。すべてのセルが列をオフであることを確認するために、プランジャーを使用してください。毎回バッファーFACS 2mlの溶出をさらに2回繰り返します。
- 5分間280×gで溶出液をスピン。
- 上清を除去し、EC培地10mlにペレットを再懸濁。
- 同様に10cmのゼラチンコートディッシュに溶出画分（〜6ml）に分割します。 3 1 cm 3の腫瘍については、プレートは、少なくとも4つのプレートで細胞を溶出しました。複数のプレートで、異なる濃度の代わりに、プレートを溶出した細胞（ 例えば 、0.5ミリリットル、1ミリリットル、1.5ミリリットル、及び4枚のプレートに溶出液の3ミリリットルをシード）ことを確実にするためにトン少なくとも一つのプレートがまばらに溶出細胞を播種されます。 （ - 2.0×10 5細胞が付着すなわち、約1.0）付着した細胞の密集度が〜1％で、次の日であることを確認してください。
注：細胞は、ECのコロニーは、他の細胞種によって汚染されることなく形成することができるように、スパースメッキされる必要があります。 - 1 10cmディッシュでプレートのFT画分は、細胞は、O / Nを回復させます。翌日、100％コンフルエント - プレートが80であることを確認してください。細胞（-80℃）250μlの細胞凍結培地中にクライオチューブ内を下に凍結し、翌日、液体窒素に保管してください。注：FTフラクションは、後の段階で腫瘍細胞の単離および/または単離されたECクローンのEC遺伝子発現解析のための陰性対照として使用することができます。
- 3日 - ごとに2メディアを変更します。 10日 - コロニーは7の後に形成し始めます。小型のECコロニーが皿の底に先の細いマーカーで早くも3日目としてマークするコロニーを同定することができます。
- 非特異的なCを削り取ります無菌の200μlのpippetチップで識別されたコロニーを取り巻くells。
クローニングリングを使用3.コロニーセレクション
- 3日 - ごとに2メディアを変更します。 7日 - ECの純度は約5でLDL（DII-AC-LDL）を添加することによって確認することができます。 10ミリリットルのEC媒体ごとのLDLの50μLを加え、3インキュベート - 蛍光顕微鏡下で細胞をチェックする前に4時間。
注：複数のLDL + ECクローンは、〜7日目に観察することができました。 - 大きさが5ミリメートル - 彼らは3の直径に達したときのECコロニーを収穫開始。 （最良の結果を得るための小型LDL +細胞が充てんされて大きなコロニーを選択してください。）
- クローニングリング、0.5％ゼラチンでプレコート数6ウェルプレートでECを回収する前に。吸引しゼラチン、各ウェルにECメディアの2ミリリットルを追加し、必要になるまでインキュベーターにプレートを保ちます。
- 他の細胞型はクローニングリング内に捕捉されませんを確認するために、コロニーの縁に非ECを削り取ります。
- 使い方位相差顕微鏡（4Xまたは10X目的）は、培養皿の底に先の細いマーカーで概説ECコロニーを含む領域。
- 10mlのPBSでプレートを洗浄し、吸引したときに、プレートにPBSの非常に薄い層を残します。 （重要：少量のPBS（〜0.5ml）をクローニングリング手順中に生きている細胞を維持します。また、組織接着剤は、結合に水を必要とします。）
- 適切なサイズのクローニングリングを選択してください。リングを拾うために解剖ピンセットを使用し、10μlのピペットチップを均等にクローニングリングに組織接着剤の少量を適用します。
注：リングのクローニングに組織接着剤の最小限の量（小さなリングのための〜0.2μl）を使用し、組織接着剤は、良好なシールを確実にするために、底面の周りに均一に広がることを確認してください。過剰な組織接着剤は、熱を生成し、細胞を死滅させることができるフィルムを形成します。 - ECコロニーの上クローニングリングを置きます。優しく里を接着するためにクローニングリングを押し下げますプレート上にngの。コロニーがリングを接着前に乾燥されていないことを確認してください。
- すぐにクローニングリングに酵素的細胞剥離溶液25μlをピペットと〜1分間インキュベートするか、細胞が緩く付着されるまで。
- クローニングリング滴下予熱EC培地を含む6ウェルプレートの1ウェル中にピペットで細胞。 50でクローニングリングを洗う - できるだけ多くの細胞を収集するために、100μlのECメディア、および同じ6ウェルにすべての洗浄を転送;：（。重要ECはタイトなクラスターに成長することを好む細胞を分散させるためにプレートを振らないでください） 。
- 10cmディッシュ内のいくつかのコロニーが収穫するには小さすぎる場合、コロニーはさらに数日間増殖させ、10ミリリットル新鮮な培地を追加し、再びクローニングリングの手順を繰り返します。
- 10cmの組織培養皿でそれらを拡大する前に、6ウェルプレートの3ウェルに細胞を100％コンフルエントと転送 - 80まで6ウェルプレート中に採取したコロニーを成長させます。汚染物質の細胞を削り取ります。繰り返し必要に応じて - リングの手順（3.10ステップ3.5）をクローニングの別のラウンド。拡張時 - （70％〜60）は比較的コンフルエント細胞を保管してください。あまりにもまばらなメッキ場合ECが成長している停止することがあります。
- など、FACS、染色、PCR法により、ECを特徴づけるはディル-AC-LDLは蛍光性であるし、FACSのためにPEまたは他の蛍光抗体を妨げる可能性があることに注意してください。
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Representative Results
ECは、ほとんどの成人組織11の総細胞集団のわずかな割合を表しています。これは、完全に細胞外マトリックス（ECM）および結合組織からECの最大放出を確実にする単一細胞懸濁液中に採取した組織を消化することが重要です。我々の経験では、CD31媒介免疫磁気選択は、濃縮されただけではなく、純粋なEC画分を提供します。従って、別の重要なステップは、クローニングリング（ 図1）を用いて ECコロニーの共精製非ECおよび選択/拡大の物理的除去です。例えば、ECがCD31に富んだときには、さらにコロニーの選択、非EC急速に増殖し、ディル-AC-LDL +とのDiI-AC-LDLによって明らかにされたように不純なEC培養を生産する、ECと混在することなく、プレーティングした-集団（ 図2A） 。カラム溶出液は、低密度でプレーティングしたときただし、ECコロニーは、SCにより除去した比較的少数の周囲の非ECで育ちましたピペットチップ（ 図2B）を強姦。拡大コロニーの成長及び純度は、さらにディル-AC-LDLを添加することによってモニターすることができます。小さ いECコロニーはCD31媒介カラム濃縮（ 図2B、上部パネル）後〜7日目で観察することができます。選択とECコロニーの拡大した後、ディル-AC-LDL -細胞が除去され、ディル-AC-LDLの取り込み（ 図2B、下部パネル）で示すように、細胞集団は、ディル-AC-LDL + ECのための非常に純粋です。
分離法は、一貫性のある結果を生み出すことができるかどうかをテストするには、C3-TAG（FVB / N C3 1 -tag）マウスや年齢をマッチさせた野生型FVBマウス由来の正常乳腺から切除乳腺腫瘍のいずれかに由来し、複数のクローンを単離し、増殖させました12。各TECおよび正常EC（NEC）集団の純度は注意深く純度を保証するために特徴付けられました。フローサイトメトリー3の独立したサンプルの分析は、単一の、uniforを示しましたIgGアイソタイプコントロール（ 図3A）は異なっていたMED CD31 +集団 。試験したすべての4つのECクローンにおけるCD31、Cdh5（VEカドヘリン）、CD133、およびVEGFR2を含むECマーカーのmRNA発現は、陰性対照として使用したマウス胚線維芽細胞（MEFの）より〜200 7000倍高かったです（ 図3B）。予想されたように、すべてのECクローンは間葉マーカー遺伝子のMEFに比べCOL1A1とTaglnのほぼ検出不可能なレベルで発現しました。免疫蛍光染色は、代表的なTECクローン内のすべてのセルが一様にCD31 +（ 図3C）であることを示しました。さらに、これらのECクローンは、それらが（ 図3D）を培養した後、内皮機能を保持示し、in vitroでの自発的な血管様構造を形成することができました。
分離法は、さらにCdh5のCREを使用して確認した：ZsGreen
図1のフローチャートとEC単離手順の概要。
図2にDil-AC-LDLはライブ培養における非ECを汚染ECを区別します。ECコロニーのクローニングリング選択なしECと共同孤立非ECを示す（A）位相コントラストおよび蛍光画像。 （B）位相コントラストおよび分離の異なる段階でのECコロニーの蛍光画像。点線はboundariをマークディル-AC-LDL + ECおよび周囲の混入細胞のES。白矢じりは、ピペットチップで除去されるべきであるECコロニー外に非ECを示します。スケールバーは100μmで表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3.クローニングリングおよび非ECの物理的除去はピュアと機能長期のEC文化を生成します。（A）は、異なるECクローンのCD31染色の代表的なFACSドットプロットは。 3つの代表的なサンプルが示されています。各プロットで開い黒い長方形は、CD31 +集団の概要を説明します。 IgGアイソタイプは、陰性対照として使用します。 （B）選択されたNECとTECクローンにおける内皮遺伝子発現の測定。内皮のmRNAレベルIAL遺伝子CD31、CD133、Cdh5、およびVEGFR2は、マウス胚性線維芽細胞（MEF）のものと比較して表現され、間葉系遺伝子COL1A1とTaglnのmRNAレベルは、NEC-1のものと比較して表しています。 （C）が展開TECクローンの代表的な免疫蛍光染色。 CD31は緑色で示されており、核は4'6'ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）で青色に染色されています。 （D）マトリゲル上に播種し、異なるECクローンによる管形成の代表的な画像。スケールバーは100μmで表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4. ECはCdh5のCREから単離された：ZsGreen
| 細胞の数 | FACS緩衝液（μL） | CD31-PE抗体（μL） |
| 1×10 7 | 100 | |
| 2×10 7 | 200 | 6 |
| 3×10 7 | 300 | 7 |
| 4×10 7 | 400 | 8 |
| 5×10 7 | 500 | 9 |
| 6×10 7 | 600 | 10 |
表1のPE結合抗CD31抗体のボリュームは、異なる細胞数の場合は必須。
| 細胞の数 | FACS緩衝液（μL） | アンチPE磁気マイクロビーズ（μL） | 1×10 7 | 80 | 20 |
| 2×10 7 | 160 | 40 |
| 3×10 7 | 240 | 60 |
| 4×10 7 | 320 | 80 |
| 5×10 7 | 400 | 100 |
| 6×10 7 | 480 | 120 |
表2アンチPEマイクロビーズのボリュームは、異なる細胞数の場合は必須。
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Discussion
これにより、純粋な一次TEC培養、例えば、ヒト臍帯静脈EC（HUVEC）13として市販されているEC線や主要EC を用いたin vitro の研究で多くの代替TECを得ることが困難に。しかし、正常組織からこれらのEC集団は、それらの正常な対応物とは著しく異なるTECのためのプロキシとして機能することができます。例えば、TEC は 、生体内で表現型および機能的異常であるとこれらの異常のいくつかは 、インビトロ14-18 で送信可能とすることができます。 TECは、異常増殖、遊走、及び分化能力を持っており、血管様構造16,19,20を形成するために、CD31 +腫瘍細胞と融合することができます。培養されたTECまたはレーザー捕捉微小解剖腫瘍血管のいずれかを用いた研究は、TECは、遺伝子発現、細胞遺伝学的、および後成的プロファイル12,18,21-23通常ECから外れることを実証しました。過去の上に腫瘍血管新生の理解を深めたにもかかわらず初代培養TECを使用して数十年、非常にいくつかの機能とメカニズムの研究が可能です。
ECは1970年代初期24でヒト臍帯静脈から単離しました。他のヒトおよびマウス組織からの微小血管ECのその後の単離および培養は、健康と病気25-28両方における内皮機能を調査するための強力なツールを提供しています。最もEC分離プロトコルは、三つの主要工程を含む：機械的解離または酵素消化後の単一細胞懸濁液を得るフルオロフォア又は磁気ビーズのいずれかに結合している内皮特異的抗体を用いてECを標識し、そしてEC集団を富化細胞選別を使用するか、または磁気カラム。しかし、特に腫瘍からマウスECの単離は、ECによる生存腫瘍細胞および線維芽細胞を含む他の細胞タイプの頻繁な汚染の低い収率に困難であることが判明しました。また、ECのインビトロ表現型ドリフト私にsenchymal様細胞（内皮間葉移行、EndMT）正常組織、腫瘍、および再プログラム前駆体から、ECの長期培養のための追加的な課題を提起します。
文化の中で10日 - TEC分離時の主な課題は、簡単に、通常〜7の後に表示される遅い成長しているECコロニーを負かすことができ、腫瘍細胞による汚染です。また、ECを単離するための一般的に使用される選択マーカーは、豊富に内皮細胞で発現されるCD31であるが、造血細胞及びいくつかの例において、腫瘍細胞の亜集団20,30をマークします 。 ECのために豊かにしながら、さらに、CD31媒介免疫列選択は、最終的にいくつかの継代後のEC文化を引き継ぐことができるすべての単一汚染のセルを削除することはできません。クローニングリング工程を追加することにより、これらの汚染の細胞型を含まない純粋なクローン由来のEC集団を選択し、拡大することができます。第二の課題は、長期的なメインですEndMTの振興ない純粋なECのナンス。 EndMTは、血管機能不全中に再現されてもよく、開発中に発生し、（特にTGFβの存在下）で培養EC 31-33では一般的です。 EndMTを最小限に抑えるために、ソースTGFβとして機能し、高い密度で培養物を維持し、常にメディアにおけるbFGFの高濃度を維持することができる汚染細胞を除去します。我々が最近示されているように、bFGFが、それは平滑筋アクチン（EndMTマーカー）34のTGFβ駆動発現に拮抗するとして、ECの仕様を維持することが不可欠です。
この方法論を使用して、「運命マッピングされた「レポーターマウスからECの分離も示されました。これらのマウスは、生体内イメージングが35必要とされる研究において特に有用です。造血細胞のいくつかの標識はCdh5のCREで発生するかもしれないが：ここで使用するZsGreen リットル/秒/リットルのマウスを、このモデルでは、インフルエンザを生成するための比較的迅速かつ容易な方法を提供orescent EC in vivoで。代替EC系統標識モデルは、タモキシフェン誘導性マウス（Cdh5のCRE / ERT2）であるが、ECは忠実にかつ不可逆的に36,37をマークしなければなりませんflox化レポーターマウス系統（ZsGreen リットル/秒/リットル ）と交配。誘導性Creマウスからの蛍光ECはまた、FACSを使用して、または我々は、本明細書で説明する方法を用いて精製することができます。
ECはまた、同じ容器38,39内のEC間に存在し得る異なる血管床および「イントラ船「異質全体で不均一です。また、別の増殖能とのECの階層は、静脈から単離されたEC集団において観察されており、40集団が40倍加を超えてクローンECの小部分を継代することができます。したがって、ここで説明する方法の制限は、次のとおり、血管壁内に存在するこれらの増殖性の高いECの1）可能な選択。そして唯一のスペックの2）濃縮完全に生体内での総EC集団を表すものではありませんクローンを生成することが動脈、静脈、または毛細血管由来IFIC血管サブタイプ、。それにもかかわらず、多数のクローンの部分集団は1つの分離手順から得ることができるように、この方法は、腫瘍および他の組織12内に存在するECの異質の機能的遺伝的分析のために有用であり得ます。まとめると、ここで説明するには、非ECの汚染を欠い純粋なECのコロニーを生成EC分離法です。単離された細胞は 、in vitro機能研究、ゲノムワイドな発現プロファイリング、および腫瘍血管新生を制御する新たな経路の分子特性のために有用であるはずです。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic-Antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium (1 g/L D-glucose) (LG-DMEM) | Gibco | 11885-084 | |
| EGM-2 Bullet Kit | Lonza | CC4176 | Not all components used |
| Fetal bovine serum (Hyclone) | Thermo Scientific | SH30071.03 | Heat inactivated at 56 °C for 30 min |
| Nu-Serum IV | Corning | CB-51004 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBBS) | Gibco | 14175-095 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | |
| FACS buffer | 0.5 % BSA and 2 mM EDTA in PBS, filtered through a 0.22 μm filter | ||
| 75% v/v ethanol for disinfection | |||
| Anti-PE microbeads | Miltenyi Biotech | 130-048-801 | |
| Bovine serum albumin (BSA) fraction V, 7.5% | Gibco | 15260-37 | |
| Cell freezing media (Bambanker) | Wako Chemicals | 302-14681 | |
| Collagenase type II | Worthington Biochemical | LS004176 | Make stock concentration 2 mg/ml in HBSS |
| Deoxyribonuclease I (DNase) | Worthington Biochemical | LS002004 | Make stock concentration 1 mg/ml in PBS |
| Dil-Ac-LDL | Biomedical Technologies | BT-902 | |
| EDTA, 0.5M, pH 8.0 | Cellgro | 46-034-CL | |
| Enzymatic cell detachment solution (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | |
| Gelatin, 2% in water, tissue culture grade | Sigma-Aldrich | G1393-100ML | Dilute in PBS to make 0.5% gelatin solution |
| Mouse FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotech | 130-092-575 | |
| Neutral protease (Dispase) | Worthington Biochemical | LS02104 | Make stock concentration 2.5 U/ml in HBSS |
| PE-rat anti-mouse CD31 antibody | BD Pharmingen | 553373 | |
| RBC lysis buffer (BD Pharm Lyse) | BD Pharmingen | 555899 | |
| Sterile water | |||
| Trypan blue, 0.4 % | Life Technologies | 15250-061 | |
| 10 mm tissue culture dishes | Corning | ||
| 15 ml conical tubes (sterile) | Corning | ||
| 50 ml conical tubes (sterile) | Corning | ||
| 6-well tissue culture plates | Corning | ||
| Tissue-dissociator tubes (gentleMACS) C tubes) | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | |
| Cell Separator (MidiMACS) | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| Cell strainer 100 μm | Corning | 352360 | |
| Cloning rings (assorted sizes) | Bel-Art Products | 378470000 | |
| Cryotubes | Thermo Scientific | ||
| Dissecting board | Sterilize or disinfect with 75% v/v ethanol before use | ||
| Dissecting forceps and scissors | Sterilize before use | ||
| Dissecting pins 2" | Sterilize before use | ||
| FACS tubes with 35 μm filter cap | Corning | 352235 | |
| Filter cup (Stericup, 0.22 μm) | Millipore | SCGPU05RE | |
| Fine-tip marker | |||
| Hemocytometer | |||
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| Magnetic Multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Tissue adhesive (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Or a centrifuge with similar capacity for 15 ml and 50 ml conical tube centrifugation |
| Tissue culture hood | |||
| Tissue dissociator (gentleMACS) | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | Preset program "m_impTumor_01" used for tissue dissociation |
| Liquid nitrogen freezer | |||
| Microplate or rotary shaker | |||
| Phase contrast light microscope |
References
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