Abstract
Frisch isolierte Tumor-spezifische Endothelzellen (TEC) kann zur molekularen Mechanismen der Tumorangiogenese zu erforschen und dienen als ein in vitro-Modell für die Entwicklung neuer Inhibitoren der Angiogenese bei Krebs ist. Jedoch ist die langfristige in-vitro-Expansion von murinen Endothelzellen (EC) herausfordernde aufgrund phänotypischer Drift in Kultur (endothelial-to-mesenchymale Transition) und Verunreinigungen mit Nicht-EC. Dies gilt insbesondere für die TEC die leicht durch co-gereinigte Fibroblasten oder Tumorzellen in Kultur outcompeted werden. Hier wird ein High-Fidelity-Isolierungsverfahren, die die Vorteile der Anreicherung immun gepaart mit Kolonie-Auswahl und in vitro Expansion dauert beschrieben. Dieser Ansatz erzeugt reine EG Fraktionen, die völlig frei von verunreinigenden Stromazellen oder Tumorzellen sind. Es wird auch gezeigt, dass die linien zurückzuführen CDH5 cre: ZsGreen l / s / l Reportermäusen, mit dem Protokoll, beschrieben, sind ein wertvolles Werkzeug, um Zell verifizierenReinheit der isolierten EG Kolonien aus diesen Mäusen zeigen, langlebige und brillante ZsGreen Fluoreszenz in Kultur.
Introduction
Endothelzellen (EC) sind bei der Entwicklung von soliden Tumoren essentiell. Von Einleitung der Angiogenese-Schalter in ruhenden Tumoren zu Verbreitung und Aussaat von Metastasen an entfernten Stellen, EG bilden die Leitungen, die Blut, Sauerstoff bereitzustellen und Nährstoffe, um das Tumorwachstum 1 aufrecht zu erhalten. Wie vor kurzem vorgeschlagen, EC auch Perfusions-unabhängige Funktionen und bilden eine Nische, die das Wachstum von Krebs-Stammzellen und anderen Tumor Stromazellen 2-5 unterstützt. So hochgereinigte Tumor-spezifischen EG (TEC) für die in-vitro-Kultur ermöglicht Routine funktionelle Studien, die Licht auf neuartigen molekularen Mechanismen der Vermittlung der Tumorangiogenese und Übersprechen mit Tumorzellen zu vergießen wird.
EC sind hochspezialisierte Abhängigkeit von dem Ursprungsgewebe 6. Aufgrund der Heterogenität der verschiedenen Tumorarten und der Tumor-Mikroumgebung kann TEC auch einzigartige Funktionen, die eine tumorspezifische Spezialisierung o widerspiegeln anzeigenf das Gefäßsystem. Zum Beispiel gibt es auffallende Variabilität der Genexpressions in TEC aus unterschiedlichen Typen oder Qualitäten von Tumoren 7,8 isoliert. Allerdings können häufige Co-Reinigung von Nicht-EG, insbesondere Tumor-assoziierten Fibroblasten und Tumorzellen, mit TEC verwechseln genomweite Expressionsanalysen. Diese unerwünschten Zelltypen sind besonders problematisch, in Studien, die auf langfristigen in vitro Expansion des TEC Kulturen verlassen.
Hier beschrieben wird ein High-Fidelity-Verfahren, die durchweg reine EG Kulturen von Tumoren und anderen Geweben produziert. Nach immunomagnetische Spalte Bereicherung der EG-Fraktionen und Entfernen von co-gereinigten Nicht-EG, um eine zusätzliche Klonen-Ring Schritt reine EG Kolonien verwendet 9 zu erfassen. Jede Kolonie in Kultur für mehrere Passagen, ohne die Entstehung von gefährdend Nicht-EG erweitert werden. Dieses Verfahren ergibt ebenfalls mehrere EC-Klone aus einer einzelnen Isolierungsverfahren, die ideal für die Untersuchung von Endothelial Heterogenität. Darüber hinaus wird gezeigt, dass CDH5 cre: ZsGreen l / s / l-Reporter-Mäuse sind ein wertvolles Werkzeug zur Erzeugung von "Schicksal-mapped" lesbar und dauerhaft markierte EC, die ZsGreen Fluoreszenz in Kultur 10 aufrecht zu erhalten. Mit geringfügigen Anpassungen des Protokoll sollte dieses Verfahren an verschiedene Tumortypen oder normalen Geweben sein.
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Protocol
Das folgende Protokoll wird gemäß den Leitlinien, die von der Abteilung für Labortiermedizin an der University of North Carolina in Chapel Hill niedergelassen.
1. Bereiten Sie das folgende Material und Reagenzien vor dem Start
- Vorbereitung EC Medien durch Hinzu 400 ml niedrigen Glucose (1 g / l D-Glucose oder LG) Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 50 ml hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum, 50 ml Nu-Serum IV, 5 ml Antibiotika-Antimykotika, und hFGF, VEGF, hEGF, R3-IGF-1 und Heparin-Komponenten aus dem im Handel erhältlichen Kits.
- Vorbereitung 500 ml FACS-Puffer (0,5% BSA und 2 mM EDTA in PBS); filtriert durch ein steriles 0,22 um Filtertasse.
- Zu sterilisieren oder zu desinfizieren Sezieren Bord.
- Dissektion Stifte, chirurgische Scheren und Dissektoren sterilisieren.
2. EG-Isolation (Tag 1, ~ 5 Stunden)
- Euthanize Maus mit Kohlendioxid oder einem anderen Verfahren konform with der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) Politiken.
Hinweis: Mehrere Brusttumoren unterschiedlicher Größe (von 5 bis 15 mm Durchmesser) in einem einzigen genetisch veränderten Maus zu entwickeln, wie beispielsweise C3-Tag, sollten Sie alle von ihnen für TEC Isolation zu ernten. Bei Verwendung von Tumoren, die orthotop bei Mäusen eingepflanzt werden, Pool zwei vor drei 1 cm 3 Tumoren für eine einzige EG-Isolation. Hier verwenden wir Brusttumoren als Demonstration, aber das Protokoll kann für andere Tumorarten modifiziert werden. - Desinfizieren Maus durch Sprühen oder mit reichlichen Menge von 75% v / v Ethanol Abwischen des Mausbauchseite.
- Resezieren Tumoren mit einer Schere und Dissektoren unter aseptischen Bedingungen in eine sterile Haube oder an einer Sterilbank.
- Ausstrecken und die Glieder der Mäuse Stift auf einem Seziertisch Bord. Machen Sie eine Mittellinie Bauchschnitt mit der Schere ohne Öffnen des Bauchfells. Lateral zerlegen zwischen der Haut und dem Bauchfell zu den Brustdrüsen, wo Tumore befinden.Das Bauchfell nicht öffnen.
- Verbrauch nur Tumorgewebe von den Brustdrüsen, Weglassen normalen Brust Margen. Sorgfältig schneiden Sie Nicht-Tumor-Gewebe wie Haut und Muskeln, und legen Sie sezierten Tumoren in einem konischen Röhrchen mit 30 ml DMEM-LG auf Eis.
- Bringen Tumorproben zur Gewebekultur Kapuze; waschen Gewebe mit sterilem LG-DMEM 1-2 mal.
- Transfer Tumoren von der konischen Röhrchen in einen sterilen Gewebekulturpetrischale, 2 ml DMEM-LG in der Schale, und Hackfleisch mit einem Paar von sterilen Schere in Stücke <5 mm.
- 5 ml Collagenase (stock = 2 mg / ml in Hanks Balanced Salt Solution, im Folgenden HBSS), 1 ml Dispase (stock = 2,5 U / ml in HBSS) und 75 & mgr; l Desoxyribonuclease (lieferbar = 1 mg / ml in PBS ) in die Petrischale. Gesamtvolumen ist jetzt ~ 10 ml.
- Übertragen Sie die Kollagenase / Gewebemischung aus der Petrischale mit einem gewebe Dissociator Rohr und auf einem Gewebe Dissociator für 60 Sekunden laufen zweimal (voreingestellt Dissoziation prOgram auf der Dissociator: 1270 Gesamt Schuss pro Lauf). Inkubieren mit leichten Schütteln auf einem Schüttler für 75 min bei 37 ° C.
- Filter verdaute Gewebe durch ein 100 & mgr; m Zellsieb über einem 50 ml konischen Röhrchen. Rinse-Filter mit 5 ml FACS-Puffer, um jegliche verbleibenden Zellen zu waschen. Spin bei 280 xg für 5 Minuten und der Überstand vorsichtig abzusaugen, ohne das Zellpellet zu stören.
- Verdünnen Sie 1 ml der Stamm RBC Lysispuffer (10x) in 9 ml sterilem Wasser. Lyse der roten Blutzellen mit 10 ml Lyse-Puffer (1x) und unmittelbar Spin 5 min bei 280 x g. Hinweis: Dieser Schritt kann übersprungen, wenn wenig Blut sichtbar ist.
- Resuspendiere in 10 ml FACS-Puffer. Mischen Sie 10 ul der Zellsuspension mit 10 ul Trypanblau, und zählen lebende Zellen mit einer Zählkammer.
- Die Zellen bei ~ 10 7 Zellen / 100 ul. Zugabe von 10 & mgr; l FcR-Block pro 100 ul Zellsuspension, und Inkubieren auf Eis für 10 min.
- In Ratten-Anti-Maus-PE-konjugierten CD31 Antikörpers nach. Tabelle 1 auf Eis inkubieren 10-15 min und das Röhrchen klopfen, gelegentlich.
- 10 ml FACS-Puffer auf das Rohr und Schleudern bei 280 × g für 5 min. Den Überstand vorsichtig abnehmen und waschen Sie das Zellpellet erneut mit 5 ml FACS-Puffer. Zentrifuge Zellen zu pelletieren. Überstand wird abgesaugt, ohne störende Zellpellet.
- Hinzufügen FACS-Puffer und Anti-PE-Mikrokügelchen gemäß Tabelle 2 auf Eis inkubieren. 10 - 15 min. Flick Rohr gelegentlich.
- 10 ml FACS-Puffer und Spin-Proben bei 280 × g für 5 min; sofort abwaschen mit 5 ml FACS-Puffer und Zentrifuge wieder. Überstand wird abgesaugt, ohne störende Pellet.
- Das Volumen auf 300 ul in FACS-Puffer. Spin durch 35 & mgr; m-Sieb Zell Röhrchen mit 5 min bei 280 x g. Benutzen Sie 2 Rohre und ein größeres Volumen, wenn nötig.
- Einrichten Magnet mehrgerüstigen und magnetischen Spalten in Haube, fügen Sie eine Spalte mit dem Separator und ins Gleichgewicht der Säule mit 2 ml FACS-Puffer.
- Aspirate des Überstandes und Resuspendieren des Zellpellets in 0,5 - 1 ml FACS-Puffer.
- Übergeben Sie die Zellsuspension durch die äquilibriert magnetischen Spalte.
- Dreimal mit 2 ml FACS-Puffer Die Säule, und sammeln Flow-Through (FT) in einem 15-ml-Tube (FT-Fraktion).
- Nehmen Sie die Spalte aus dem Separator und Elution mit 2 ml FACS-Puffer in einen anderen 15 ml-Röhrchen (Eluatfraktion). Verwenden Sie Kolben, um sicherzustellen, alle Zellen aus der Säule. Wiederholung der Elution noch zwei Mal mit 2 ml FACS-Puffer jedesmal.
- Spin des Eluats bei 280 × g für 5 min.
- Entfernen des Überstandes und Resuspendieren des Pellets in 10 ml EC Medien.
- Ebenso teilen die Eluatfraktion (~ 6 ml) in 10 cm Gelatine beschichteten Schalen. Seit drei 1 cm 3 Tumoren, Platte eluiert Zellen in mindestens vier Platten. Alternativ Platte eluiert Zellen in unterschiedlichen Konzentrationen in mehrere Platten (z. B. Saatgut, 0,5 ml, 1 ml, 1,5 ml und 3 ml des Eluates in vier Platten), um sicherzustellen, daß einet mindestens eine Platte ist dünn mit eluierten Zellen ausgesät. Prüfen, ob die Konfluenz der anhaftenden Zellen ist bei ~ 1% am nächsten Tag (dh ungefähr 1,0 bis 2,0 x 10 5 anhaftenden Zellen).
Anmerkung: Die Zellen brauchen spärlich zu plattierenden sodass EC Kolonien können, ohne von anderen Zelltypen kontaminierten bilden. - Platte FT-Fraktion in einem 10 cm-Schale zu lassen Zellen zu gewinnen O / N. Überprüfen Sie, ob die Platte 80-100% konfluent am nächsten Tag. Frieren Sie die Zellen nach unten (-80 ° C) in 250 ul zellgefrierenden Medien in einem Kryoröhrchen und speichern sie in flüssigem Stickstoff am nächsten Tag. Anmerkung: FT-Fraktion kann zur Tumorzellisolierung zu einem späteren Zeitpunkt und / oder als Negativkontrolle für EC Genexpressionsanalyse der isolierten EC-Klone verwendet werden.
- Ändern Medien alle 2 - 3 Tage. Kolonien beginnen, nach 7 bilden - 10 Tage. Kleine EG Kolonien können so früh wie Tag 3. Markieren Sie die Kolonien mit einer feinen Spitze-Markierung auf dem Boden der Schale identifiziert werden.
- Abkratzen unspezifische cEllen rund um die identifizierten Kolonien mit einer sterilen 200 ul Pippet Spitze.
3. Colony Auswahl mit Cloning Ringe
- Ändern Medien alle 2 - 3 Tage. 7 Tage - EC Reinheit kann durch LDL (Dil-Ac-LDL) zusätzlich bei etwa 5 überprüft werden. In 50 ul LDL pro 10 ml EC-Medium und Inkubation für 3-4 h vor der Überprüfung der Zellen unter dem Fluoreszenzmikroskop.
Hinweis: Mehrere LDL + EC-Klone konnten bei ~ Tag 7 beobachtet werden. - Beginnen Ernten EC Kolonien, wenn sie Durchmessern von 3 erreichen - 5 mm in der Größe. (Wählen Sie große Kolonien, die mit kleinen LDL + Zellen, die für beste Ergebnisse gepackt werden.)
- Vor der Ernte EG mit Clonierungsringen, Vorstrich ein paar 6-Well-Platten mit 0,5% Gelatine. Saugen Sie Gelatine, 2 ml EC Medien in jede Vertiefung, und halten Sie die Platten in einen Inkubator, bis sie benötigt.
- Abkratzen Nicht-EG an den Rändern der Kolonien, um sicherzustellen, dass keine anderen Zelltypen werden mit dem Klonen Ring eingefangen werden.
- Mit einemPhasenkontrastmikroskop (4X oder 10X-Objektiv), Exposé mit einer feinen Spitze-Markierung auf dem Boden der Kulturschale die Bereiche mit EC Kolonien.
- Waschen Sie die Platte mit 10 ml PBS und lassen Sie eine sehr dünne Schicht aus PBS in der Platte beim Ansaugen. (Wichtig: eine kleine Menge (~ 0,5 ml) PBS werden die Zellen während des Klonen-Ring-Verfahren am Leben zu erhalten; auch muss Gewebekleber Wasser zu binden.)
- Wählen Sie eine Klonierung Ring entsprechender Größe. Verwenden Sie ein Paar Pinzette zu holen ein Ring, und mit einer 10 ul Pipettenspitze eine kleine Menge von Gewebekleber gleichmäßig auftragen auf das Klonen Ring.
Hinweis: Verwenden Sie nur eine minimale Menge (~ 0,2 & mgr; l für einen kleinen Ring) der Gewebekleber zum Klonen Ringe, und stellen Sie sicher, Gewebekleber wird gleichmäßig über die Bodenfläche verteilt, um eine gute Abdichtung zu gewährleisten. Übermäßige Gewebekleber erzeugt Wärme und bildet Filme, die Zellen zu töten kann. - Legen Sie das Klonen Ring über die EG-Kolonie. Drücken Sie vorsichtig das Klonen Ring um die ri klebenng auf die Platte. Stellen Sie sicher, dass die Kolonien werden nicht vor dem Kleben der Ring getrocknet.
- Unmittelbar Pipettieren von 25 ul der enzymatischen Zellablösung Lösung in den Klonierungsvektor Ring und inkubiere ~ 1 min oder bis die Zellen sind lose befestigt.
- Pipet-Zellen bei der Klonierung Ring tropfenweise in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte mit vorgewärmten EG Medien. (Wichtig: die Platte, um Zellen zu dispergieren, nicht schütteln; EG lieber in dichten Trauben wachsen.) Waschen Sie das Klonen Ring mit 50-100 ul EG Medien, um so viele Zellen wie möglich zu sammeln und übertragen alle Waschanlagen in den gleichen 6-Well- .
- Wenn einige Kolonien in der 10 cm-Schale zu klein, um zu ernten, 10 ml frischem Medium, lassen die Kolonien wachsen für ein paar Tage, und wiederholen Sie den Klonen Ring Prozedur erneut.
- Wachsen geernteten Kolonien in Platten mit 6 Vertiefungen bis 80 - 100% konfluent waren, und die Übertragungszellen zu 3 Vertiefungen einer Platte mit 6 Vertiefungen, zuvor in einer 10 cm-Gewebekulturschale expandierenden ihnen. Abkratzen Verunreinigung Zellen. Wiederholeneine weitere Runde des Klonens Ringverfahren (Schritte von 3,5 bis 3,10), wenn nötig. Halten Zellen relativ konfluent (~ 60-70%) bei der Erweiterung. EG kann aufhören zu wachsen, wenn überzogen zu spärlich.
- Charakterisieren EG durch FACS, Färbung, PCR usw. Beachten Sie, dass Dil-Ac-LDL ist fluoreszierend und können mit PE oder andere fluoreszierende Antikörper für FACS stören.
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Representative Results
EC stellen nur geringfügige einen Bruchteil der gesamten Zellpopulation in den meisten Geweben von Erwachsenen 11. Es ist daher wichtig, vollständig zu verdauen, die geerntete Gewebe in eine Einzelzellsuspension, die die maximale Freisetzung von EC von extrazellulärer Matrix (ECM) und Bindegewebe gewährleistet. Nach unserer Erfahrung bietet CD31-vermittelte immunomagnetische Auswahl nur angereicherten aber nicht reine EG Fraktionen; Daher ist ein weiterer entscheidender Schritt, die physische Entfernung von co-gereinigten Nicht-EG und Auswahl / Ausbau der EG-Kolonien unter Verwendung Clonierungsringen (Abbildung 1). So wurden beispielsweise bei der CD31-angereicherten EG ohne weitere Kolonieselektion, Nicht-EG rasch vermehrt und vermischt mit EC, Herstellung unreine EG Kulturen wie von Dil-Ac-LDL + und DiI-AC-LDL zeigte vernickelt - Populationen (2A) . Wenn jedoch Säuleneluate wurden bei niedriger Dichte plattiert, wuchsen die EG-Kolonien mit relativ wenigen umgebenden Nicht-EG, die von sc entfernt wurden,Vergewaltigung mit einer Pipettenspitze (2B). Das Wachstum und die Reinheit der expandierte Kolonien können weiter durch Zugabe von Dil-Ac-LDL überwacht werden. Kleine EG Kolonien können bei ~ Tag sieben nach der CD31-vermittelten Anreicherung in der Säule (2B, oberen Platten) zu beachten. Nach der Auswahl und den Ausbau der EG-Kolonien, Dil-Ac-LDL - Zellen werden eliminiert und die Zellpopulation ist hochrein für Dil-Ac-LDL + EG, geändert durch Dil-Ac-LDL-Aufnahme (2B, Bodenplatten) angezeigt.
Um zu testen, ob der Isolationsmethode können konsistente Ergebnisse, mehrere Klone von beiden Brusttumoren aus C3-Tag reseziert abgeleitet sind (FVB / N C3 1 -Tag) Mäusen oder normalen Brustdrüsen von altersangepassten Wildtyp-FVB-Mäusen wurden isoliert und expandiert 12. Die Reinheit jeder TEC und normale EG (NEC) Bevölkerung wurde dann vorsichtig gekennzeichnet, um die Reinheit zu gewährleisten. Durchflusszytometrie Analysen von drei unabhängigen Proben zeigte einen einzigen, uniformed CD31 + Population, die sich von IgG Isotypkontrollen (3A) war. Die mRNA-Expression von EC Markern, einschließlich CD31, CDH5 (VE-Cadherin), CD133 und VEGFR2 in allen vier EC getesteten Klone betrug ca. 200 bis 7000 mal höher als die von embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF), die als negative Kontrolle verwendet wurde, (3B). Wie erwartet, ausgedrückt alle EG-Klone im Vergleich zu MEFs fast nicht nachweisbare Mengen der mesenchymalen Marker-Gene COL1A1 und Tagln. Immunfluoreszenzfärbung zeigte, daß alle Zellen in einer repräsentativen TEC Klon wurden gleichmßig CD31 + (3C). Außerdem waren diese EC-Klone in der Lage, spontane gefäßartige Strukturen in vitro zu bilden, was sie Endothelfunktionen nach Kultivierung (3D) zu halten.
Die Isolierungsverfahren wurde weiter validiert mit CDH5 cre: ZsGreen
Abbildung 1. Flussdiagramm und Übersicht der EG-Isolierungsverfahren.
Abbildung 2. Dil-Ac-LDL Unterscheidet EG verunreinigen Nicht-EG in lebenden Kulturen. (A) Phasenkontrast und Fluoreszenzbilder, die EG und Co-isoliert Nicht-EG ohne Klonen-Ring Auswahl der EG Kolonien. (B) Phasenkontrast und Fluoreszenzbilder von EC-Kolonien in den verschiedenen Phasen der Isolation. Gestrichelten Linien markieren die boundaries von Dil-Ac-LDL + EG und die umliegenden kontaminierenden Zellen. Weiß Pfeilspitzen zeigen Nicht-EG außerhalb eines EG-Kolonie, die mit einer Pipettenspitze entfernt werden sollte. Maßstabsbalken entsprechen 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Klonierung Ringe und physikalische Entfernung von Nicht-EG produzieren pure und funktionelle Langzeit EG Kulturen. (A) Repräsentative FACS Dot-Plots von CD31-Färbung von verschiedenen EG-Klone. Drei repräsentative Proben gezeigt. Die offene schwarze Rechteck in jeder Parzelle skizziert die CD31 + Population. Ein IgG-Isotyp als negative Kontrolle verwendet. (B) Messung der endothelialen Genexpression in ausgewählten NEC und TEC-Klone. Die mRNA-Niveaus von Endothelial Gene CD31, CD133, CDH5 und VEGFR2 sind relativ zu denen der embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) exprimiert und die mRNA-Spiegel von mesenchymalen Gene COL1A1 und Tagln sind relativ zu denen der NEC-1 ausgedrückt. (C) Repräsentative Immunfluoreszenzfärbung eines erweiterten TEC-Klon. CD31 wird grün dargestellt und Kerne mit 4'6'-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) Blau gefärbt. (D) Repräsentative Bilder der Röhrenbildung durch verschiedene EG-Klone auf Matrigel beschichtet. Maßstabsbalken entsprechen 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. EG Isoliert von CDH5 cre: ZsGreen
| Handynummer | FACS-Puffer (ul) | CD31-PE-Antikörper (ul) |
| 1 x 10 & sup7; | 100 | |
| 2 x 10 & sup7; | 200 | 6 |
| 3 x 10 & sup7; | 300 | 7 |
| 4 x 10 & sup7; | 400 | 8 |
| 5 x 10 & sup7; | 500 | 9 |
| 6 x 10 & sup7; | 600 | 10 |
Tabelle 1 PE-konjugiertem Anti-CD31-Antikörper-Volumes für verschiedene Zellzahlen benötigt.
| Handynummer | FACS-Puffer (ul) | Anti-PE magnetischen Mikrokügelchen (ul) | 1 x 10 & sup7; | 80 | 20 |
| 2 x 10 & sup7; | 160 | 40 |
| 3 x 10 & sup7; | 240 | 60 |
| 4 x 10 & sup7; | 320 | 80 |
| 5 x 10 & sup7; | 400 | 100 |
| 6 x 10 & sup7; | 480 | 120 |
Tabelle 2. Anti-PE Microbead Volumes für verschiedene Zellzahlen benötigt.
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Discussion
Aufgrund der Schwierigkeiten bei der reinen Primär TEC Kulturen, viele in vitro-Studien Ersatz TEC mit handelsüblichen EC Linien oder primäre EC wie humane Nabelvenen-EC (HUVEC) 13. Jedoch können diese EG-Populationen aus normalen Geweben dienen nur als Proxy für TEC, die sich deutlich von ihren normalen Gegenstücken unterscheiden. Zum Beispiel sind TEC phänotypisch und funktionell abnormalen in vivo und einige dieser Anomalien können tragbare in vitro 14-18 sein. TEC haben anomale Wachstum, wandernd, und Differenzierung Fähigkeiten und kann mit CD31 + Tumorzellen verschmelzen, um gefäßähnlichen Strukturen 16,19,20 bilden. Studien unter Verwendung von entweder kultiviert TEC oder Laser Capture Mikro seziert Tumorgefäße haben ergeben, dass TEC weichen von normalen EC in der Genexpression, zytogenetische und epigenetische Profile 12,18,21-23 demonstriert. Trotz vertiefen unser Verständnis der Tumor-Angiogenese in den letztenJahrzehnten sehr wenige funktionale und mechanistische Studien mit kultivierten primären TEC zur Verfügung.
EG wurden aus menschlichen Nabelvenen in den frühen 1970er Jahren 24 isoliert. Anschließende Isolierung und Kultivierung von mikrovaskulären EC von anderen Menschen und der Maus Gewebe hat ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung von endothelialen Funktionen sowohl in Gesundheit und Krankheit 25 bis 28 vorgesehen. Die meisten EG-Isolierung-Protokolle beinhalten drei wichtige Schritte: Erhalten einer Einzelzellsuspension nach mechanischer Dissoziation oder enzymatische Verdauung, Etikettierung EG mit einem Endothel-spezifischer Antikörper, die entweder an ein Fluorophor oder magnetischen Mikrokügelchen konjugiert ist, und Bereicherung der EG-Bevölkerung mit Zellsortierung oder Magnetspalten. Jedoch Isolierung von Maus-EC, insbesondere von Tumoren, hat sich als schwierig aufgrund der geringen Ausbeute an lebensfähigen EC und häufige Verunreinigung anderer Zelltypen, einschließlich Tumorzellen und Fibroblasten nachgewiesen. Darüber hinaus in vitro phänotypische Drift der EG in michsenchymal ähnlichen Zellen (Endothelzellen-to-mesenchymale Transition, EndMT) eine weitere Herausforderung für die Langzeitkultivierung von EG von normalen Geweben, Tumoren und umprogrammiert Vorstufen.
Die größte Herausforderung bei der TEC Isolation Kontamination durch Tumorzellen, die sich leicht verdrängen können die langsamer wachsenden EG Kolonien, die in der Regel angezeigt, nachdem ~ 7-10 Tagen in Kultur. Darüber hinaus ist eine häufig verwendete Selektionsmarker zum Isolieren EG CD31 die reichlich im Endothel exprimiert wird, sondern markiert hämatopoetischen Zellen und in einigen Fällen Tumorzellpopulationen 20,30. Darüber hinaus, während bereichernd für EC, CD31-vermittelten immunomagnetische Spaltenauswahl kann nicht jede einzelne verunreinigende Zellen, die schließlich über EC-Kulturen nach ein paar Durchgänge erfolgen zu entfernen. Durch das Hinzufügen einer Klonen-Ring Schritt ist man in der Lage zu wählen und zu erweitern reinen klonal abgeleitete EG-Populationen, die frei von diesen verunreinigenden Zelltypen sind. Eine zweite Herausforderung ist die langfristige HauptWartung von reinem EG ohne Förderung EndMT. EndMT tritt während der Entwicklung, während vaskuläre Dysfunktion rekapituliert werden, und ist üblich in kultivierten EC (insbesondere in Gegenwart von TGFß) 31-33. Zur Minimierung EndMT, entfernen kontaminierenden Zellen, die als Quelle TGFß tätig werden kann, halten Kulturen bei hohen Dichten und pflegen hohe Konzentrationen von bFGF in den Medien zu allen Zeiten. Wie wir kürzlich gezeigt, ist bFGF wichtig, EC-Spezifikation zu erhalten, wie es TGFß gesteuerte Ausdruck Glattmuskelaktin (ein EndMT Marker) 34 entgegenwirkt.
Unter Verwendung dieser Methodik Isolierung von EG von einem "Schicksals-mapped" Reporter Mäusen wurde ebenfalls gezeigt. Diese Mäuse sind besonders nützlich bei Studien, in denen intravital Bildgebung benötigt wird 35. Obwohl einige Etikettierung von blutbildenden Zellen können in der CDH5 cre auftreten: ZsGreen l / s / l Mäusen hier verwendet wird, bietet dieses Modell eine relativ schnelle und einfache Methode zur Erzeugung von Grippeorescent EG in vivo. Ein alternatives EC-Linie-Kennzeichnung Modell ist eine Tamoxifen-induzierbare Maus (CDH5 cre / ERT2) gekreuzt mit einer floxed Reporter Mausstamm (ZsGreen l / s / l), die EG treu haben werden und irreversibel markiert 36,37 . Fluorescent EG von den induzierbaren Cre Mäuse können auch unter Verwendung von FACS oder die Verwendung der Methodik die wir hier beschreiben, gereinigt werden.
EG sind heterogen in verschiedenen Gefäßbetten und "intra-Schiffes" Heterogenität kann auch unter den EG im gleichen Gefäß 38,39 existieren. Darüber hinaus hat eine Hierarchie von EC mit unterschiedlichen Proliferationspotential im EC-Populationen aus Venen isoliert beobachtet worden, und ein geringer Anteil der klonalen EC können passagiert werden über 40 Populationsverdopplungen 40. Daher Einschränkungen des hier beschriebenen Verfahrens sind: 1) eine mögliche Auswahl dieser hochproliferative EG die sich in der Behälterwand; und 2) die Anreicherung von nur einem specific Gefäß Subtyp von Arterien, Venen oder Kapillaren abgeleitet, die Klone, die nicht den gesamten EG-Bevölkerung in vivo vollständig darstellen zu produzieren kann. Dennoch, wie mehrere klonale Subpopulationen von einem Isolierungsverfahren erhalten werden, kann dieses Verfahren nützlich für die funktionelle und genetischen Analysen EC Heterogenität, die in Tumoren und anderen Geweben 12 existiert. Zusammengenommen hier beschrieben wird, ist eine EG-Isolationsverfahren, das reine EG Kolonien frei von verunreinigenden Nicht-EG-produziert. Die isolierten Zellen sollten nützlich für die in vitro funktionelle Studien, genomweite Expressionsprofilen und molekulare Charakterisierung von neuen Wegen, die Tumor-Angiogenese kontrollieren.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic-Antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium (1 g/L D-glucose) (LG-DMEM) | Gibco | 11885-084 | |
| EGM-2 Bullet Kit | Lonza | CC4176 | Not all components used |
| Fetal bovine serum (Hyclone) | Thermo Scientific | SH30071.03 | Heat inactivated at 56 °C for 30 min |
| Nu-Serum IV | Corning | CB-51004 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBBS) | Gibco | 14175-095 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | |
| FACS buffer | 0.5 % BSA and 2 mM EDTA in PBS, filtered through a 0.22 μm filter | ||
| 75% v/v ethanol for disinfection | |||
| Anti-PE microbeads | Miltenyi Biotech | 130-048-801 | |
| Bovine serum albumin (BSA) fraction V, 7.5% | Gibco | 15260-37 | |
| Cell freezing media (Bambanker) | Wako Chemicals | 302-14681 | |
| Collagenase type II | Worthington Biochemical | LS004176 | Make stock concentration 2 mg/ml in HBSS |
| Deoxyribonuclease I (DNase) | Worthington Biochemical | LS002004 | Make stock concentration 1 mg/ml in PBS |
| Dil-Ac-LDL | Biomedical Technologies | BT-902 | |
| EDTA, 0.5M, pH 8.0 | Cellgro | 46-034-CL | |
| Enzymatic cell detachment solution (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | |
| Gelatin, 2% in water, tissue culture grade | Sigma-Aldrich | G1393-100ML | Dilute in PBS to make 0.5% gelatin solution |
| Mouse FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotech | 130-092-575 | |
| Neutral protease (Dispase) | Worthington Biochemical | LS02104 | Make stock concentration 2.5 U/ml in HBSS |
| PE-rat anti-mouse CD31 antibody | BD Pharmingen | 553373 | |
| RBC lysis buffer (BD Pharm Lyse) | BD Pharmingen | 555899 | |
| Sterile water | |||
| Trypan blue, 0.4 % | Life Technologies | 15250-061 | |
| 10 mm tissue culture dishes | Corning | ||
| 15 ml conical tubes (sterile) | Corning | ||
| 50 ml conical tubes (sterile) | Corning | ||
| 6-well tissue culture plates | Corning | ||
| Tissue-dissociator tubes (gentleMACS) C tubes) | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | |
| Cell Separator (MidiMACS) | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| Cell strainer 100 μm | Corning | 352360 | |
| Cloning rings (assorted sizes) | Bel-Art Products | 378470000 | |
| Cryotubes | Thermo Scientific | ||
| Dissecting board | Sterilize or disinfect with 75% v/v ethanol before use | ||
| Dissecting forceps and scissors | Sterilize before use | ||
| Dissecting pins 2" | Sterilize before use | ||
| FACS tubes with 35 μm filter cap | Corning | 352235 | |
| Filter cup (Stericup, 0.22 μm) | Millipore | SCGPU05RE | |
| Fine-tip marker | |||
| Hemocytometer | |||
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| Magnetic Multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Tissue adhesive (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Or a centrifuge with similar capacity for 15 ml and 50 ml conical tube centrifugation |
| Tissue culture hood | |||
| Tissue dissociator (gentleMACS) | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | Preset program "m_impTumor_01" used for tissue dissociation |
| Liquid nitrogen freezer | |||
| Microplate or rotary shaker | |||
| Phase contrast light microscope |
References
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