Abstract
Fraîchement isolés cellules endothéliales spécifiques de tumeurs (TEC) peuvent être utilisées pour étudier les mécanismes moléculaires de l'angiogenèse tumorale et servir comme un modèle in vitro pour le développement de nouveaux inhibiteurs de l'angiogenèse pour le cancer. Cependant, à long terme dans l'expansion in vitro des cellules endothéliales murines (CE) est difficile en raison de la dérive phénotypique dans la culture (de transition endothéliale-à-mésenchymateuses) et la contamination avec des non-CE. Cela est particulièrement vrai pour TEC qui sont facilement surpassés par les fibroblastes co-purifié ou des cellules tumorales en culture. Ici, une méthode d'isolement de haute fidélité qui tire parti de l'enrichissement immunomagnétique couplée avec la sélection de la colonie et dans l'expansion in vitro est décrite. Cette approche génère des fractions pures CE qui sont entièrement libres de contaminer les cellules stromales ou tumorales. Il est également démontré que la lignée tracée Cdh5-cre: / l de souris rapporteurs de ZsGreen l /, utilisés avec le protocole décrits ici, sont un outil précieux pour vérifier cellulairela pureté que les colonies isolées CE de ces souris montrent durable et brillante fluorescence ZsGreen dans la culture.
Introduction
Les cellules endothéliales (CE) sont essentiels lors du développement de tumeurs solides. De l'initiation du switch angiogénique dans les tumeurs dormantes à la diffusion et l'ensemencement des métastases à des sites distants, CE former les conduits qui fournissent du sang, de l'oxygène et de nutriments pour soutenir la croissance de la tumeur 1. Comme suggéré récemment, EC ont aussi des fonctions de perfusion indépendantes et former une niche qui prend en charge la croissance des cellules souches cancéreuses et d'autres cellules du stroma de la tumeur 2-5. Ainsi, hautement purifié CE (TCE) pour la culture in vitro spécifique de la tumeur permet études fonctionnelles de routine qui va faire la lumière sur les mécanismes moléculaires de médiation angiogenèse tumorale et la diaphonie avec des cellules tumorales.
CE sont très spécialisés en fonction du tissu d'origine 6. En raison de la nature hétérogène de différents types de tumeurs et le microenvironnement de la tumeur, TEC peut également afficher des caractéristiques uniques qui reflètent une tumeur spécifique à la spécialisation of le système vasculaire. Par exemple, il existe une variabilité frappante dans les signatures d'expression génique dans TEC isolés à partir de différents types ou classes de tumeurs 7,8. Toutefois, fréquemment co-purification de non-CE, en particulier les fibroblastes associés à une tumeur et les cellules tumorales, avec TEC peut confondre analyses d'expression du génome entier. Ces types de cellules non désirées sont particulièrement problématiques dans les études qui reposent sur le long terme dans l'expansion in vitro de cultures de TEC.
Décrit ici est un procédé haute-fidélité qui produit toujours des cultures pures CE de tumeurs et d'autres tissus. Suite à l'enrichissement immunomagnétique des fractions de la CE et l'élimination des co-purifié non-CE colonne, une étape clonage torique supplémentaire pour capturer colonies CE pur est utilisé 9. Chaque colonie peut être étendue en culture pendant plusieurs passages sans l'émergence de contamination non-CE. Cette méthode donne également de multiples clones CE d'une procédure d'isolement unique, ce qui est idéal pour l'étude de l'endohétérogénéité épithélial. En outre, il est démontré que Cdh5 CRE: les souris rapporteurs / l de ZsGreen l / sont un outil précieux pour générer CE "de sort-mappé" et indélébile marqué qui maintiennent ZsGreen fluorescence dans la culture 10. Avec quelques ajustements mineurs au protocole, cette méthode devrait être adaptable à différents types de tumeurs ou de tissus normaux.
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Protocol
Le protocole suivant est effectué conformément aux lignes directrices établies par le ministère de médecine de laboratoire vétérinaire de l'Université de Caroline du Nord à Chapel Hill.
1. Préparer le matériel suivant et réactifs Avant de partir
- Préparer les médias CE en la complétant 400 ml faible taux de glucose (1 g / L D-glucose ou LG) modifié par Dulbecco du milieu de Eagle (DMEM) avec 50 ml de sérum bovin foetal inactivé par la chaleur, 50 ml Nu-Sérum IV, 5 ml antibiotique-antimycosique, et le hFGF, le VEGF, le hEGF, R3-IGF-1, et des composants de l'héparine à partir du kit commercial.
- Préparer 500 ml FACS tampon (0,5% de BSA et 2 mM d'EDTA dans du PBS); filtrer à travers un filtre de 0,22 um tasse stérile.
- Stériliser ou désinfecter conseil dissection.
- Stériliser les repères de dissection, ciseaux chirurgicaux, et dissecteurs.
2. Isolement CE (Jour 1, ~ 5 h)
- Euthanasier la souris avec du dioxyde de carbone ou d'autres méthodes d'esprit conformeh Comité des soins et de l'utilisation des animaux institutionnel (IACUC) politiques.
Remarque: tumeurs mammaires multiples de taille variable (5 - 15 mm de diamètre) peuvent se développer en une seule souris génétiquement modifiée comme C3-Tag, assurez-vous de les récolter tous pour l'isolement du TEC. Si vous utilisez des tumeurs qui sont orthotopiquement greffées chez la souris, la piscine deux à trois 1 cm 3 tumeurs pour un seul isolement CE. Ici, nous utilisons des tumeurs mammaires comme une démonstration, mais le protocole peut être modifié pour d'autres types de tumeurs. - Désinfecter souris par pulvérisation ou essuyage de la face ventrale de souris avec une quantité abondante de 75% v / v d'éthanol.
- Réséquer tumeurs avec une paire de ciseaux et ciseaux à l'aide de techniques aseptiques sous une hotte stérile ou à un banc propre.
- Allongez-vous et épinglez les membres de la souris sur une planche de dissection. Faire une incision médiane ventrale avec les ciseaux sans ouvrir le péritoine. Disséquer latéralement entre la peau et le péritoine vers les glandes mammaires où se trouvent les tumeurs.Ne pas ouvrir le péritoine.
- Accise uniquement de tissu tumoral à partir des glandes mammaires, en laissant de côté les marges mammaires normales. Soigneusement couper les tissus non tumoraux tels que la peau et les muscles, et de placer les tumeurs disséquées dans un tube conique contenant 30 ml de DMEM-LG sur la glace.
- Apportez des échantillons de tumeurs à la culture de tissus hotte; laver avec les tissus stériles LG-DMEM 1 - 2 fois.
- Tumeurs de transfert du tube conique à une boîte de Pétri de culture de tissu stérile, ajouter 2 ml de DMEM-LG dans le plat, et mâchent avec une paire de ciseaux stériles en morceaux <5 mm.
- Ajouter 5 ml de la collagénase (Stock = 2 mg / ml dans une solution saline équilibrée de Hank, ci-après HBSS), 1 ml de dispase (stocks = 2,5 U / ml dans HBSS) et 75 ul de désoxyribonucléase (Stock = 1 mg / ml dans PBS ) dans la boîte de Pétri. Le volume total est maintenant ~ 10 ml.
- Transférer le mélange collagénase / tissu de la boîte de Pétri à un tube de tissu-dissociateur et courir sur un dissociateur de tissu pendant 60 secondes deux fois (pré-réglé dissociation prOgram sur le dissociateur: 1.270 tours au total par cycle). Incuber avec la lumière secouant sur un agitateur pendant 75 min à 37 ° C.
- Filtrer à travers un tissu digéré cellule tamis 100 pm sur un tube conique de 50 ml. Le rinçage du filtre avec 5 ml de tampon FACS pour laver toutes les cellules restantes. Spin à 280 g pendant 5 min et aspirer soigneusement le surnageant sans déranger le culot cellulaire.
- Diluer 1 ml d'actions RBC tampon de lyse (10x) dans 9 ml d'eau stérile. Lyse des globules rouges avec 10 ml de tampon de lyse (1x), et immédiatement tourner 5 min à 280 x g. Remarque: Cette étape peut être ignorée si peu de sang est visible.
- Remettre en suspension dans 10 ml de tampon FACS. Mélanger 10 pi de suspension cellulaire avec 10 pi de bleu trypan, et compter les cellules vivantes en utilisant un hémocytomètre.
- Reprendre cellules à ~ 10 7 cellules / 100 pi. Ajouter 10 ul de bloc FcR pour 100 ul de suspension de cellules, et on incube sur de la glace pendant 10 min.
- Ajouter anticorps CD31 de rat anti-souris conjugué à PE selon. Tableau 1 incuber sur de la glace pendant 10 - 15 min et le tube de film de temps en temps.
- Ajouter 10 ml de tampon FACS pour le tube et centrifuger à 280 g pendant 5 min. Retirer délicatement le surnageant et laver le culot cellulaire à nouveau avec 5 ml de tampon FACS. Centrifuger pour culotter les cellules. Aspirer le surnageant sans culot cellulaire inquiétante.
- Ajouter tampon FACS et des microbilles anti-PE conformément au Tableau 2 incuber sur de la glace pendant 10 -. 15 min. Tube de Flick occasionnellement.
- Ajouter 10 ml de tampon et des échantillons de rotation FACS à 280 xg pendant 5 min; laver une fois avec 5 ml de tampon FACS et centrifuger à nouveau. Aspirer le surnageant sans culot inquiétante.
- Amener le volume à 300 pi dans du tampon FACS. Spin à 35 um cellule crépine plafonné tube 5 min à 280 x g. Utilisez 2 tubes et un plus grand volume si nécessaire.
- Mettre en place Multistand magnétique et colonnes magnétiques dans le capot, joindre une colonne pour le séparateur et équilibrer la colonne avec 2 ml de tampon FACS.
- Aspirate le surnageant et remettre le culot cellulaire dans 0,5 - 1 ml de tampon FACS.
- Passez la suspension de cellules à travers la colonne magnétique équilibrée.
- Laver la colonne trois fois avec 2 ml de tampon FACS, et recueillir écoulement (FT) dans un tube de 15 ml (fraction FT).
- Prendre la colonne hors du séparateur et on élue avec 2 ml de tampon FACS dans un autre tube de 15 ml (fraction d'éluat). Utilisez piston pour assurer que toutes les cellules sont de la colonne. Répéter l'élution deux fois avec 2 ml de tampon FACS à chaque fois.
- Spin l'éluat à 280 g pendant 5 min.
- Retirer le surnageant et remettre le culot dans 10 ml de médias CE.
- Tout aussi diviser la fraction d'éluat (~ 6 ml) dans des boîtes revêtues de gélatine 10 cm. Pour trois de 1 cm 3 tumeurs, plaque cellules élue dans au moins quatre plaques. Cellules variante, la plaque est éluée à des concentrations différentes dans plusieurs plaques (par ex., 0,5 ml, ensemencer 1 ml, 1,5 ml et 3 ml de l'éluat en quatre plaques) veiller à ce qu'unt moins une plaque est peu ensemencé avec des cellules élues. Vérifiez que la confluence des cellules attachées est à ~ 1% le lendemain (soit environ 1,0 - 2,0 x 10 5 cellules attachées).
Remarque: Les cellules doivent être plaqué rares de sorte que les colonies CE peuvent former sans être contaminés par d'autres types de cellules. - Plate fraction FT dans un plat de 10 cm pour laisser les cellules récupérer O / N. Vérifiez que la plaque est 80 - 100% de confluence le lendemain. Congeler bas les cellules (-80 ° C) dans 250 médias congélation de cellules-ul dans un cryotube et rangez-les dans de l'azote liquide le lendemain. Remarque: fraction FT peut être utilisé pour l'isolement de cellules de tumeur à un stade ultérieur et / ou en tant que témoin négatif pour l'analyse de l'expression des gènes clones CE CE de isolées.
- Changer de support tous les 2 - 3 jours. Colonies commencent à se former après 7 - 10 jours. Petites colonies CE peuvent être identifiés dès le jour 3. Marquez les colonies avec un marqueur à pointe fine sur le fond du plat.
- Grattez c non spécifiqueaunes entourant les colonies identifiées avec une pointe de Pippet 200 pi stérile.
3. Colony sélection Anneaux Utilisation de clonage
- Changer de support tous les 2 - 3 jours. CE pureté peut être vérifiée par les LDL (Dil-Ac-LDL) plus à environ 5 - 7 jours. Ajouter 50 pi de LDL par 10 ml de milieu CE et incuber pendant 3 - 4 heures avant de vérifier les cellules sous un microscope à fluorescence.
Remarque: LDL Multiple + clones CE pourraient être observés à ~ 7 jours. - Lancer la récolte des colonies CE quand ils atteignent un diamètre de 3 - 5 mm. (Choisissez grandes colonies qui sont emballés avec les petites LDL + cellules pour de meilleurs résultats.)
- Avant la récolte CE avec des anneaux de clonage, de pré-couche de quelques plaques de 6 puits avec 0,5% de gélatine. Aspirer la gélatine, ajouter 2 ml de milieu CE à chaque puits, et de garder les plaques dans un incubateur jusqu'à ce que nécessaire.
- Grattez non-CE sur les bords des colonies pour vous assurer que pas d'autres types de cellules seront piégés dans le cycle de clonage.
- Utilisation d'unmicroscope à contraste de phase (4X ou 10X objectif), contour avec un marqueur à pointe fine sur le fond de la boîte de culture les zones contenant des colonies de la CE.
- Laver la plaque avec 10 ml de PBS et de laisser une très fine couche de PBS dans la plaque lors de l'aspiration. (Important: une petite quantité (~ 0,5 ml) de PBS va garder les cellules vivantes au cours de la procédure de clonage torique; aussi, tissu adhésif a besoin d'eau pour coller.)
- Choisissez un anneau de clonage de taille appropriée. Utilisez une paire de pince à disséquer pour ramasser une bague, et avec une pipette de 10 pi appliquer uniformément une petite quantité de tissu adhésif sur l'anneau de clonage.
Remarque: Utilisez uniquement quantité minimale (~ 0,2 pi pour un petit anneau) d'adhésif de tissu sur des anneaux de clonage, et assurez-vous colle tissulaire est répartie uniformément autour de la surface de fond pour assurer une bonne étanchéité. Adhésif tissulaire excessive produit de la chaleur et fait des films qui peuvent tuer les cellules. - Placez l'anneau de clonage sur la colonie CE. Appuyez doucement l'anneau de clonage pour coller les ring sur la plaque. Veiller à ce que les colonies ne sont pas séchés avant le collage de la bague.
- Immédiatement pipette 25 pi de solution enzymatique de détachement cellulaire dans l'anneau de clonage et incuber ~ 1 min ou jusqu'à ce que les cellules sont mal fixés.
- Pipet cellules dans l'anneau de clonage goutte à goutte dans un puits d'une plaque à 6 puits contenant les médias communautaires préchauffées. (Important: Ne secouez pas la plaque pour disperser les cellules; CE préfèrent poussent en grappes serrées.) Lavez la bague de clonage avec 50 - 100 médias communautaires ul de collecter autant de cellules que possible, et de transférer tous les lavages dans le même 6 puits .
- Si certaines colonies dans la boîte de 10 cm sont trop petits pour récolter, ajouter 10 ml de milieu frais, laisser les colonies pousser pendant quelques jours de plus, et de répéter la procédure d'anneau de clonage.
- Poussent des colonies récoltées dans des plaques 6 puits jusqu'à 80 - 100% de confluence, et le transfert des cellules à 3 puits d'une plaque à 6 puits, avant de les étendre dans une boîte de culture de tissu de 10 cm. Grattez cellules contaminantes. Répéterune autre série de la procédure de l'anneau de clonage (étapes 03/05 au 03/10), si nécessaire. Gardez cellules relativement confluentes (~ 60 - 70%) lors de l'expansion. CE peut cesser de croître si plaqué trop clairsemée.
- Caractériser CE par FACS, la coloration, PCR, etc. Notez que Dil-Ac-LDL est fluorescent et peut interférer avec PE ou d'autres anticorps fluorescents pour FACS.
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Representative Results
CE représente seulement une fraction mineure de la population cellulaire totale dans la plupart des tissus adultes 11. Il est donc important pour digérer complètement le tissu récolté dans une suspension à cellule unique qui assure la libération maximale de CE à partir de la matrice extracellulaire (ECM) et les tissus conjonctifs. Dans notre expérience, la sélection immunomagnétique CD31 à médiation ne fournit fractions CE enrichis mais pas pures; par conséquent, une autre étape cruciale est l'élimination physique de co-purifié non-CE et la sélection / expansion des colonies à l'aide de la CE clonage anneaux (Figure 1). Par exemple, lorsque CD31 enrichi CE ont été étalés sans autre sélection de la colonie, non-CE proliféré rapidement et entremêlé avec la CE, la production de cultures CE impures tel que révélé par Dil-Ac-LDL + et Dil-AC-LDL - populations (figure 2A) . Toutefois, lorsque les éluats de la colonne ont été étalées à faible densité, les colonies ont augmenté CE avec relativement peu environnante non-CE, qui ont été éliminé par scviol avec une pointe de pipette (figure 2B). La croissance et la pureté des colonies expansées peuvent être en outre contrôlée par addition de Dil-Ac-LDL. Petites colonies CE peuvent être observés à ~ sept jours après enrichissement de la colonne CD31 médiée (figure 2B, panneaux supérieurs). Après la sélection et l'expansion des colonies CE, Dil-Ac-LDL - les cellules sont éliminées, et la population de cellules est très pur pour Dil-Ac-LDL + CE comme indiqué par Dil-Ac-LDL absorption (Figure 2B, panneaux inférieurs).
Pour tester si la méthode d'isolement peut produire des résultats cohérents, plusieurs clones issus soit de tumeurs mammaires résection de C3-Tag (FVB / N C3 1 -tag) des souris ou des glandes mammaires normales de souris FVB de type sauvage appariés selon l'âge ont été isolés et élargis 12. La pureté de chaque TEC et (NEC) CE population normale a ensuite été caractérisée soigneusement pour assurer la pureté. La cytométrie en flux analyses de trois échantillons indépendants ont montré une seule, UNIFORCD31 + med population qui était distincte de contrôles d'isotype IgG (figure 3A). L'expression de l'ARNm de marqueurs CE, y compris CD31, Cdh5 (VE-cadhérine), CD133, et VEGFR2 dans les quatre clones CE testé était d'environ 200 à 7000 fois supérieur à celui de fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) qui a été utilisé comme témoin négatif (Figure 3B). Comme prévu, tous les clones ont exprimé des niveaux CE presque indétectables de gènes marqueurs mésenchymateuses COL1A1 et Tagln par rapport aux MEF. La coloration par immunofluorescence ont montré que toutes les cellules d'un clone représentatif TEC étaient CD31 + uniformément (figure 3C). En outre, ces clones CE ont pu former des structures de type vaisseau spontanées in vitro, indiquant qu'ils conservent des fonctions endothéliales après culture (Figure 3D).
La méthode d'isolement a en outre été validée à l'aide Cdh5 CRE: ZsGreen
Figure 1. Organigramme et Aperçu de la séparation procédure CE.
Figure 2. Dil-Ac-LDL Distingue CE de contaminer non-CE en cultures vivantes. (A) à contraste de phase et des images fluorescentes montrant CE et co-isolé non-CE sans sélection clonage anneau de colonies CE. (B) contraste de phase et des images fluorescentes de colonies CE à différents stades de l'isolement. Pointillés marquent la boundaries de Dil-Ac-LDL + CE et cellules contaminantes environnantes. Pointes de flèches blanches indiquent les non-CE en dehors d'une colonie CE qui doit être supprimé avec une pointe de pipette. Les barres d'échelle représentent 100 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Clonage Anneaux et élimination physique de non-CE Produire à long terme des cultures pures et fonctionnelles de la CE. (A) FACS représentatifs parsèment parcelles de CD31 coloration des différents clones CE. Trois échantillons représentatifs sont présentés. Le rectangle noir ouverte dans chaque parcelle présente la population CD31 +. Un isotype IgG est utilisée comme témoin négatif. (B) la mesure de l'expression génique dans endothéliale sélectionnés NEC et TEC clones. Les taux d'ARNm de endothelialeial gènes CD31, CD133, Cdh5, et VEGFR2 sont exprimés par rapport à ceux de fibroblastes embryonnaires de souris (MEF de), et les niveaux d'ARNm de gènes COL1A1 et Tagln mésenchymateuses sont exprimés par rapport à ceux de NEC-1. (C) représentant immunofluorescence d'un clone de TEC élargi. CD31 est représenté en vert et les noyaux sont colorés bleu avec 4'6'-diamidino-2-phénylindole (DAPI). (D) des images représentatives de la formation de tubes par différents clones CE plaquées sur Matrigel. Les barres d'échelle représentent 100 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. CE isolé à partir Cdh5 CRE: ZsGreen
| Numéro de portable | Tampon FACS (pi) | Anticorps CD31-PE (ul) |
| 1 x 10 7 | 100 | |
| 2 x 10 7 | 200 | 6 |
| 3 x 10 7 | 300 | 7 |
| 4 x 10 7 | 400 | 8 |
| 5 x 10 7 | 500 | 9 |
| 6 x 10 7 | 600 | 10 |
Tableau 1. PE-conjugué volumes Anti-CD31 anticorps requis pour différents numéros de cellulaire.
| Numéro de portable | Tampon FACS (ul) | Anti-PE Les microbilles magnétiques (ul) | 1 x 10 7 | 80 | 20 |
| 2 x 10 7 | 160 | 40 |
| 3 x 10 7 | 240 | 60 |
| 4 x 10 7 | 320 | 80 |
| 5 x 10 7 | 400 | 100 |
| 6 x 10 7 | 480 | 120 |
Tableau 2. Volumes Anti-PE microbilles requises pour les différents numéros de cellulaire.
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Discussion
En raison des difficultés à obtenir des cultures de TEC primaires pures, dont beaucoup dans des études in vitro TEC substitut avec des lignes disponibles dans le commerce de la CE ou primaire CE tels que la veine ombilicale humaine CE (HUVEC) 13. Cependant, ces populations CE de tissus normaux ne peuvent servir de proxy pour les TEC qui diffèrent sensiblement de leurs homologues normales. Par exemple, TEC sont phénotypiquement et fonctionnellement anormale in vivo et certains de ces anomalies peut être transmissible in vitro de 14 à 18. TEC ont aberrantes croissance, migration, et les capacités de différenciation et peut fusionner avec des cellules CD31 + de la tumeur à former des structures de type vaisseau 16,19,20. Des études utilisant soit des vaisseaux tumoraux micro-disséqués cultivées TEC ou par capture laser ont démontré que TEC CE écartent de la normale dans l'expression génique, cytogénétique, et les profils épigénétiques 12,18,21-23. Malgré approfondir notre compréhension de l'angiogenèse tumorale cours de la dernièrequelques décennies, très peu d'études fonctionnelles et mécanistiques utilisant TEC primaire cultivées sont disponibles.
CE ont été isolés à partir de veines ombilicales humaines dans le début des années 1970 24. L'isolement ultérieur et la culture de la CE microvasculaire d'autres tissus humains et de souris a fourni un outil puissant pour étudier les fonctions endothéliales à la fois la santé et la maladie 25-28. La plupart des protocoles d'isolement CE comportent trois étapes principales: l'obtention d'une suspension de cellules isolées après dissociation mécanique ou par digestion enzymatique, le marquage CE avec un anticorps spécifique de l'endothélium qui est conjugué soit à un fluorophore ou magnétiques des microbilles, et l'enrichissement de la population CE en utilisant le tri cellulaire ou colonnes magnétiques. Cependant, l'isolement de souris CE, en particulier de tumeurs, a révélé difficile en raison du faible rendement de CE viable et fréquent de contamination d'autres types cellulaires, y compris des cellules tumorales et des fibroblastes. En outre, in vitro phénotypique dérive des CE en moicellules senchymal-like (endothéliale-mésenchymateuse transition, EndMT) constitue un défi supplémentaire pour la culture à long terme de la CE à partir de tissus normaux, les tumeurs, et des précurseurs reprogrammées.
Le défi majeur lors de l'isolement de TEC est la contamination par les cellules tumorales, ce qui peut facilement supplanter les colonies de la CE à croissance plus lente qui apparaissent généralement après ~ 7 - 10 jours de culture. En outre, un marqueur de sélection utilisée pour isoler CE est CD31, qui est abondamment exprimé dans l'endothélium mais marque également les cellules hématopoïétiques et, dans certains cas, des sous-populations de cellules tumorales 20,30. En outre, tout en enrichissant pour les CE, sélection de colonne immunomagnétique CD31 à médiation ne peut pas supprimer chaque cellule contamination qui peuvent éventuellement prendre le relais cultures CE après quelques passages. En ajoutant une étape clonage anneau, on est en mesure de sélectionner et de développer des populations pures CE clonage dérivés qui sont exempts de ces types de cellules contaminantes. Un deuxième défi est la principale à long termeentretien de la pure CE sans promotion de EndMT. EndMT se produit au cours du développement, peut être récapitulé au cours de la dysfonction vasculaire, et est commun dans les CE cultivées (en particulier en présence de TGFß) 31-33. Pour minimiser EndMT, éliminer les cellules contaminantes qui peuvent agir comme une source TGFß, garder les cultures à haute densité, et de maintenir de fortes concentrations de bFGF dans les médias en tout temps. Comme nous l'avons montré récemment, bFGF est essentiel de préserver la spécification CE car il antagonise expression entraînée TGF-de l'actine musculaire lisse (un marqueur de EndMT) 34.
En utilisant cette méthodologie, l'isolement de la CE à partir d'une souris rapporteurs «destin mappé" a également été montré. Ces souris sont particulièrement utiles dans les études où l'imagerie intravitale 35 est nécessaire. Bien que certains l'étiquetage des cellules hématopoïétiques peut se produire dans la CRE Cdh5: ZsGreen l / S / L souris utilisées ici, ce modèle fournit une méthode relativement rapide et facile pour générer la grippeorescent CE in vivo. Un modèle de lignée d'étiquetage alternatif CE est une souris de tamoxifène inductible (Cdh5 cre / ERT2) croisé avec une souche de souris rapporteur floxé (s / l de ZsGreen / l) qui aura CE fidèlement et de manière irréversible marqué 36,37 . Fluorescent CE des souris cre inductibles peut également être purifiée en utilisant FACS ou en utilisant la méthodologie que nous décrivons ici.
CE sont hétérogènes entre les différents lits vasculaires et "intra-navire" hétérogénéité peut également exister entre les CE dans le même navire 38,39. En outre, une hiérarchie de CE avec potentiel prolifératif différent a été observé dans les populations isolées à partir de veines CE, et une petite fraction du CE clonale peut être au-delà des passages 40 40 doublements de population. Par conséquent, les limites de la méthode décrite ici comprennent: 1) la sélection possible de ceux-ci hautement proliférative CE résidant dans la paroi du vaisseau; et 2) l'enrichissement d'un seul specIFIC sous-type vasculaire dérivé de artères, les veines, ou capillaires, ce qui peut produire des clones qui ne représentent pas complètement la population totale de la CE in vivo. Néanmoins, des sous-populations clonales que de multiples peuvent être obtenues à partir d'une procédure d'isolement, cette méthode peut être utile pour des analyses fonctionnelles et génétiques de la CE hétérogénéité existe au sein de tumeurs que d'autres tissus et 12. Pris ensemble, décrit ici est un procédé d'isolement CE qui produit des colonies CE purs dépourvus de contamination non-CE. Les cellules isolées devraient être utiles pour les études in vitro fonctionnels, l'échelle du génome profilage de l'expression, et caractérisation moléculaire de nouvelles voies qui contrôlent l'angiogenèse tumorale.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic-Antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium (1 g/L D-glucose) (LG-DMEM) | Gibco | 11885-084 | |
| EGM-2 Bullet Kit | Lonza | CC4176 | Not all components used |
| Fetal bovine serum (Hyclone) | Thermo Scientific | SH30071.03 | Heat inactivated at 56 °C for 30 min |
| Nu-Serum IV | Corning | CB-51004 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBBS) | Gibco | 14175-095 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | |
| FACS buffer | 0.5 % BSA and 2 mM EDTA in PBS, filtered through a 0.22 μm filter | ||
| 75% v/v ethanol for disinfection | |||
| Anti-PE microbeads | Miltenyi Biotech | 130-048-801 | |
| Bovine serum albumin (BSA) fraction V, 7.5% | Gibco | 15260-37 | |
| Cell freezing media (Bambanker) | Wako Chemicals | 302-14681 | |
| Collagenase type II | Worthington Biochemical | LS004176 | Make stock concentration 2 mg/ml in HBSS |
| Deoxyribonuclease I (DNase) | Worthington Biochemical | LS002004 | Make stock concentration 1 mg/ml in PBS |
| Dil-Ac-LDL | Biomedical Technologies | BT-902 | |
| EDTA, 0.5M, pH 8.0 | Cellgro | 46-034-CL | |
| Enzymatic cell detachment solution (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | |
| Gelatin, 2% in water, tissue culture grade | Sigma-Aldrich | G1393-100ML | Dilute in PBS to make 0.5% gelatin solution |
| Mouse FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotech | 130-092-575 | |
| Neutral protease (Dispase) | Worthington Biochemical | LS02104 | Make stock concentration 2.5 U/ml in HBSS |
| PE-rat anti-mouse CD31 antibody | BD Pharmingen | 553373 | |
| RBC lysis buffer (BD Pharm Lyse) | BD Pharmingen | 555899 | |
| Sterile water | |||
| Trypan blue, 0.4 % | Life Technologies | 15250-061 | |
| 10 mm tissue culture dishes | Corning | ||
| 15 ml conical tubes (sterile) | Corning | ||
| 50 ml conical tubes (sterile) | Corning | ||
| 6-well tissue culture plates | Corning | ||
| Tissue-dissociator tubes (gentleMACS) C tubes) | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | |
| Cell Separator (MidiMACS) | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| Cell strainer 100 μm | Corning | 352360 | |
| Cloning rings (assorted sizes) | Bel-Art Products | 378470000 | |
| Cryotubes | Thermo Scientific | ||
| Dissecting board | Sterilize or disinfect with 75% v/v ethanol before use | ||
| Dissecting forceps and scissors | Sterilize before use | ||
| Dissecting pins 2" | Sterilize before use | ||
| FACS tubes with 35 μm filter cap | Corning | 352235 | |
| Filter cup (Stericup, 0.22 μm) | Millipore | SCGPU05RE | |
| Fine-tip marker | |||
| Hemocytometer | |||
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| Magnetic Multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Tissue adhesive (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Or a centrifuge with similar capacity for 15 ml and 50 ml conical tube centrifugation |
| Tissue culture hood | |||
| Tissue dissociator (gentleMACS) | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | Preset program "m_impTumor_01" used for tissue dissociation |
| Liquid nitrogen freezer | |||
| Microplate or rotary shaker | |||
| Phase contrast light microscope |
References
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