Abstract
Frisk isolerede tumorspecifikke endotelceller (TEC) kan bruges til at udforske molekylære mekanismer af tumorangiogenese og tjene som en in vitro model for udvikling af nye angiogeneseinhibitorer for kræft. , Langsigtet in vitro-udvidelse af murine endothelceller (EF) er imidlertid en udfordring på grund af fænotypisk drift i kultur (endotel-til-mesenchymale overgang) og forurening med ikke-EF. Dette gælder især for TEC som let udkonkurreret af co-oprenset fibroblaster eller tumorceller i kultur. Her er en high fidelity isolation metode, der drager fordel af immunmagnetisk berigelse kombineret med koloniselektion og in vitro ekspansion beskrevet. Denne tilgang skaber rene EF fraktioner, der er helt fri for forurenende stromale eller tumorceller. Det er også vist, at slægt-spores Cdh5 CRE: ZsGreen l / s / l reporter mus, der anvendes sammen med protokollen beskrevet heri, er et værdifuldt redskab til at kontrollere cellerenhed som de isolerede EF kolonier fra disse mus viser holdbare og strålende ZsGreen fluorescens i kultur.
Introduction
Endotelceller (EF) er afgørende under udviklingen af solide tumorer. Fra indledningen af angiogene kontakten i hvilende tumorer til formidling og såning af metastaser på fjerne steder, EF udgør ledningerne, der giver blod, ilt og næringsstoffer til at opretholde væksten tumor 1. Så sent antydet, EF har også perfusion-uafhængige funktioner og danner en niche, som understøtter væksten af kræft stamceller og andre stromale tumorceller 2-5. Således højt oprenset tumor-specifikke (TEC), EF for in vitro-dyrkning muliggør rutinemæssige funktionelle studier, som vil belyse nye molekylære mekanismer medierer tumor angiogenese og krydstale med tumorceller.
EF er højt specialiserede afhængigt af vævet oprindelseslandet 6. På grund af den heterogene karakter af de forskellige tumortyper og tumor mikromiljø kan TEC også vise unikke funktioner, der afspejler en tumor-specifik specialisering of vaskulaturen. For eksempel er der slående variabilitet i genekspression signaturer i TEC isoleret fra forskellige typer eller kvaliteter af tumorer 7,8. Hyppige co-oprensning af ikke-EF, især tumorassocierede fibroblaster og tumorceller, med TEC, kan dog forvirre hele genomet ekspression analyser. Disse uønskede celletyper er særligt problematisk i undersøgelser, der er afhængige af langsigtede in vitro-udvidelse af TEC kulturer.
Beskrevet her er der en high-fidelity metode, konsekvent producerer rene kulturer fra EF tumorer og andre væv. Efter immunomagnetisk kolonne berigelse af EF fraktioner og fjernelse af co-oprensede ikke-EF at en yderligere kloning-ring skridt indfange rene EF kolonier anvendes 9. Hver koloni kan udvides i kultur til flere passager uden fremkomsten af kontaminerende ikke-EF. Denne metode giver også flere EF-kloner fra et enkelt isolation procedure, som er ideel til studiet af endothelial heterogenitet. Desuden er det vist, at Cdh5 CRE: ZsGreen l / s / l reporter mus er et værdifuldt redskab til at generere "skæbne-kortlagt" og uudsletteligt mærket EF, som opretholder ZsGreen fluorescens i kultur 10. Med mindre justeringer af protokollen, bør denne metode kunne tilpasses forskellige tumortyper eller normale væv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende protokol udføres i henhold til retningslinjer fastlagt af Institut for Laboratory Animal Medicine ved University of North Carolina i Chapel Hill.
1. Forbered følgende materiale og reagenser Inden start
- Forbered EF medier ved at supplere 400 ml lav glucose (1 g / L D-glucose eller LG) Dulbeccos modificerede Eagles-medium (DMEM) med 50 ml varmeinaktiveret føtalt bovint serum, 50 ml Nu-Serum IV, 5 ml antibiotisk-antimykotisk, og hFGF, VEGF, hEGF, R3-IGF-1 og heparin bestanddele fra kommercielt kit.
- Forbered 500 ml FACS buffer (0,5% BSA og 2 mM EDTA i PBS); filtreres gennem et sterilt 0,22 um filter cup.
- Sterilisere eller desinficere dissekere bord.
- Sterilisere dissektion stifter, kirurgiske sakse og dissectors.
2. EF Isolering (dag 1, ~ 5 timer)
- Aflive mus med kuldioxid eller andre metoder kompatibel with Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) politikker.
Bemærk: Flere mammatumorer varierende i størrelse (5 - 15 mm i diameter) kan udvikle sig i en enkelt genetisk modificeret mus som C3-Tag, skal du sørge for at høste dem alle for TEC isolation. Hvis du bruger tumorer, der er orthotopisk indpodede i mus, pool to til tre 1 cm 3 tumorer for en enkelt EF isolation. Her bruger vi brysttumorer som en demonstration, men protokollen kan ændres til andre typer tumorer. - Desinficere musen ved sprøjtning eller aftørring musen ventrale side med rigelig mængde på 75% v / v ethanol.
- Resecere tumorer med en saks og dissectors hjælp af aseptiske teknikker i en steril hætte eller en ren bænk.
- Strække ud og pin lemmerne af mus på en dissekere bord. Lav en midterlinjen ventrale snit med saksen uden at åbne bughinden. Dissekere lateralt mellem huden og peritoneum mod mælkekirtler, hvor tumorer er placeret.Åbn ikke bughinden.
- Punktafgifter kun tumorvæv fra mælkekirtler, udelader normale brystkirtler margener. Trim forsigtigt ikke-tumorvæv såsom hud og muskler, og placer dissekerede tumorer i en konisk rør indeholdende 30 ml LG-DMEM på is.
- Bring tumor prøver til vævskultur hætte; vask med sterilt væv LG-DMEM 1 - 2 gange.
- Overfør tumorer fra konisk rør til en steril vævskultur-petriskål, tilsættes 2 ml LG-DMEM i skålen, og hakkekød med et par steril saks i stykker <5 mm.
- Tilsæt 5 ml collagenase (lager = 2 mg / ml i Hanks Balanced Salt Solution, herefter HBSS), 1 ml dispase (lager = 2,5 U / ml i HBSS) og 75 pi deoxyribonuklease (lager = 1 mg / ml i PBS ) i petriskålen. Samlede volumen er nu ~ 10 ml.
- Overfør collagenase / væv mix fra petriskålen til et væv-dissociator rør og kørt på en væv dissociator for 60 sec to gange (forudindstillet dissociation prOGRAM på dissociator: 1.270 total runder per løb). Inkuber med lys omrystning på et rysteapparat i 75 minutter ved 37 ° C.
- Filter fordøjet væv gennem en 100 um cellefilter over en 50 ml konisk rør. Skyl filter med 5 ml FACS-buffer til at vaske eventuelle resterende celler. Spin ved 280 xg i 5 minutter og forsigtigt aspireres supernatanten uden at forstyrre cellepelleten.
- Fortynd 1 ml af stock RBC lysis buffer (10x) i 9 ml sterilt vand. Lyserer røde blodlegemer med 10 ml lysepuffer (1x), og straks spinde 5 minutter ved 280 x g. Bemærk: Dette trin kan springes over, hvis lidt blod er synlig.
- Resuspender i 10 ml FACS buffer. Bland 10 pi cellesuspension med 10 pi trypanblåt, og tælle levende celler under anvendelse af et hæmocytometer.
- Resuspender celler ved ~ 10 7 celler / 100 pi. Tilsæt 10 pi FcR blok 100 pi cellesuspension, og der inkuberes på is i 10 minutter.
- Tilføj rotte-anti-muse-PE-konjugeret CD31 antistof ifølge. til tabel 1 inkuberes på is i 10 - 15 min og svirp rør lejlighedsvis.
- Der tilsættes 10 ml FACS buffer til røret og centrifugering ved 280 xg i 5 minutter. Fjern forsigtigt supernatanten og vask cellepelleten igen med 5 ml FACS buffer. Der centrifugeres for at pelletere cellerne. Aspirer supernatanten uden at forstyrre cellepellet.
- Tilføj FACS-buffer og anti-PE mikroperler ifølge tabel 2 Der inkuberes på is i 10 -. 15 min. Flick rør lejlighedsvis.
- Der tilsættes 10 ml FACS-buffer og spin-prøver ved 280 xg i 5 min; vaskes en gang med 5 ml FACS-buffer og centrifugeres igen. Aspirer supernatanten uden at forstyrre pellet.
- Bring volumen til 300 pi i FACS buffer. Spin gennem 35 um celle-si udjævnede slangen 5 minutter ved 280 x g. Bruge 2 rør og en større mængde, hvis nødvendigt.
- Opsæt magnetisk Multistand og magnetiske kolonner i hætte, vedhæfte en kolonne til separatoren og ligevægt kolonnen med 2 ml FACS-buffer.
- Aspirate supernatanten og resuspender cellepelleten i 0,5 - 1 ml FACS buffer.
- Pass cellesuspensionen gennem ækvilibreret magnetiske kolonne.
- Vask kolonnen tre gange med 2 ml FACS buffer og indsamle gennemstrømning (FT) i et 15 ml rør (FT fraktion).
- Tag kolonnen fra separatoren og der elueres med 2 ml FACS buffer i en anden 15 ml rør (eluatfraktion). Brug stemplet for at sikre, at alle celler er fra søjlen. Gentag elueringen to gange mere med 2 ml FACS buffer hver gang.
- Spin eluatet ved 280 xg i 5 minutter.
- Fjern supernatanten, og pellet resuspenderes i 10 ml EF medier.
- Ligeligt dele eluatfraktionen (~ 6 ml) i 10 cm gelatinecoatede retter. I tre 1 cm 3 tumorer, plade eluerede celler i mindst fire plader. Alternativt plade eluerede celler ved forskellige koncentrationer i flere plader (f.eks., Frø 0,5 ml, 1 ml, 1,5 ml, og 3 ml af eluatet i fire plader) for at sikre, at ent mindst én plade er tyndt podes med eluerede celler. Kontroller, at konfluens af de vedhæftede celler er ~ 1% næste dag (dvs. ca. 1,0 - 2,0 x 10 5 vedhæftede celler).
Bemærk: Cellerne skal forgyldt sparsomme, så EF kolonier kan danne uden at blive forurenet med andre celletyper. - Plate FT fraktionen i en 10 cm parabol til at lade celler genvinde O / N. Kontroller at pladen er 80 - 100% konfluente den næste dag. Nedfrysning af cellerne (-80 ° C) i 250 pi cellefrysemedium medier i en cryotube og gemme dem i flydende nitrogen næste dag. Bemærk: FT fraktion kan anvendes til tumorcelle isolering på et senere tidspunkt og / eller som en negativ kontrol for EF genekspression analyse af de isolerede kloner EF.
- Skift medier hver 2 - 3 dage. Kolonier begynder at danne efter 7 - 10 dage. Små EF kolonier kan identificeres så tidligt som dag 3. Markér kolonierne med en fin spids markør på bunden af skålen.
- Skrab uspecifik calen omkring de identificerede kolonier med en steril 200 gl pippet spids.
3. Colony Selection Brug kloningsringe
- Skift medier hver 2 - 3 dage. EF renhed kan kontrolleres ved LDL (Dil-Ac-LDL) tilsætning på omkring 5 - 7 dage. Tilsæt 50 ul af LDL pr 10 ml EF medium og inkuberes i 3 - 4 timer før kontrol cellerne under fluorescensmikroskop.
Bemærk: Flere LDL + EF-kloner kunne observeres på ~ dag 7. - Begynd at høste EF kolonier, når de når en diameter på 3 - 5 mm i størrelse. (Vælg store kolonier, der er pakket med små LDL + celler for de bedste resultater.)
- Før høst EF med kloningsringe, pre-coat et par 6-brønds plader med 0,5% gelatine. Aspirer gelatine, tilsættes 2 ml EF medier til hver brønd, og holde pladerne i en inkubator indtil brug.
- Skrab ikke-EF på kanten af kolonierne for at sikre ingen andre celletyper vil blive fanget i kloning ringen.
- Ved hjælp af enfasekontrastmikroskop (4X eller 10X mål), skitsere med en fin-tip markør på bunden af dyrkningsskålen de områder, der indeholder EF kolonier.
- Vask pladen med 10 ml PBS og efterlade et meget tyndt lag af PBS i pladen, når opsugning. (Vigtigt: en lille mængde (~ 0,5 ml) PBS vil holde celler i live under kloning-ring proceduren, også, væv lim brug for vand til at lime.)
- Vælg en kloning ring af passende størrelse. Brug et par dissekere pincet til at afhente en ring, og med en 10 pi pipettespids jævnt anvende en lille mængde væv klæbemiddel på kloning ring.
Bemærk: Brug kun minimal mængde (~ 0,2 pi for en lille ring) af væv lim på kloningsringe, og sørg for væv lim er spredt ud jævnt omkring bunden overflade for at sikre en god tætning. Overdreven vævsadhæsiv producerer varme og danner film, der kan dræbe celler. - Placer kloning ring over EF koloni. Tryk forsigtigt ned kloning ringen at lime ring på pladen. Sørg for, at kolonierne ikke tørret ud før limning ringen.
- Umiddelbart pipette 25 pi enzymatisk Cellefrigørelse opløsningen i kloning ring og inkuberes ~ 1 min eller indtil cellerne er løst tilknyttet.
- Pipetter celler i kloning ring dråbevis til en brønd i en 6-brønds plade indeholdende forvarmet EF medier. (Vigtigt: Ryst ikke pladen for at sprede celler EF foretrækker at vokse i stramme klynger.) Vask kloning ring med 50 - 100 gl EF medier til at indsamle så mange celler som muligt, og overføre alle vaske i den samme 6-godt .
- Hvis nogle kolonier i 10 cm skål er for små til at høste, tilsæt 10 ml frisk medier, lad kolonierne vokser for et par dage mere, og gentag kloning ring proceduren igen.
- Grow høstet kolonier i 6-brønds plader til 80 - 100% konfluente, og overførsel celler til 3 brønde i en 6-brønds plade, før de udvider dem i en 10 cm vævskulturskål. Skrab forurenende celler. Gentagen anden runde af kloning ring procedure (trin 3,5-3,10) om nødvendigt. Hold celler relativt sammenflydende (~ 60-70%), når voksende. EF, kan stoppe voksende, hvis forgyldt for sparsomme.
- Karakterisere EF ved FACS, farvning, PCR, etc. Bemærk, at Dil-Ac-LDL er fluorescerende og kan interferere med PE eller andre fluorescerende antistoffer til FACS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
EF udgør kun mindre en brøkdel af den totale cellepopulation i de fleste voksne væv 11. Det er derfor vigtigt at fuldt fordøje det høstede væv i en enkelt-cellesuspension, der sikrer den maksimale frigivelse af EF ekstracellulær matrix (ECM) og bindevæv. Det er vores erfaring, kun CD31-medieret immunomagnetisk udvælgelse giver berigede, men ikke rene EF fraktioner; derfor et andet afgørende skridt er fysisk fjernelse af co-oprensede ikke-EF og udvælgelse / udbygning af EF kolonier ved hjælp kloningsringe (figur 1). For eksempel, når CD31-beriget EF udpladedes uden yderligere valg koloni, ikke-EF-hurtigt spredt og blandet med EF, der producerer urene EF kulturer afsløret af Dil-Ac-LDL + og Dil-AC-LDL - populationer (figur 2A) . Men når søjleeluater blev udpladet ved lav densitet, voksede, EF kolonier med relativt få omgivende ikke-EF, som blev fjernet ved scvoldtage med en pipettespids (figur 2B). Væksten og renheden af de ekspanderede kolonier kan overvåges yderligere ved tilsætning af Dil-Ac-LDL. Små EF kolonier kan observeres på ~ dag syv efter CD31-medieret kolonne berigelse (figur 2B, toppanel). Efter selektion og udvidelse af EF kolonier, Dil-Ac-LDL - celler elimineres, og cellepopulationen er meget rent til Dil-Ac-LDL + EF som angivet ved Dil-Ac-LDL-optagelse (figur 2B, bundpaneler).
For at teste om isoleringen metode kan give ensartede resultater, flere kloner afledt fra enten brysttumorer reseceret fra C3-tag (FVB / N C3 1 -tagget) mus eller normale mælkekirtler fra aldersmatchede vildtype-FVB-mus blev isoleret og udvidet 12. Renheden af hvert TEC og normal EF (NEC) population blev derefter forsigtigt karakteriseret for at sikre renhed. Flowcytometri analyser af tre uafhængige prøver viste et enkelt, uniforMed CD31 + -populationen, der var forskellig fra IgG isotype kontrol (figur 3A). MRNA-ekspression af EF-markører, herunder CD31, Cdh5 (VE-cadherin), CD133 og VEGFR2 i alle fire EF-kloner testet var ~ 200 til 7.000 gange højere end den for muse embryonale fibroblaster (MEF'er), der blev anvendt som en negativ kontrol (figur 3B). Som forventet, alle EF-kloner udtrykte næsten ikke-detekterbare niveauer af mesenkymale markørgener COL1A1 og Tagln forhold til MEF'er. Immunfluorescensfarvning viste, at alle celler i en repræsentativ TEC klon var ensartet CD31 + (figur 3C). Desuden er disse EF kloner var i stand til at danne spontane vessel-lignende strukturer in vitro, hvilket indikerer, at de bevarer endotelceller funktioner efter dyrkning (figur 3D).
Isoleringen Metoden blev yderligere valideret ved hjælp Cdh5 CRE: ZsGreen
Figur 1. Flow Chart og Oversigt over EF Isolation Procedure.
Figur 2. Dil-Ac-LDL Adskiller EF Kontaminerende Ikke-EF levende kulturer. (A) Fase kontrast og fluorescerende billeder, der viser EF og co-isolerede ikke-EF uden kloning-ring udvalg af EF kolonier. (B) Fase kontrast og fluorescerende billeder af EF kolonier på forskellige stadier af isolation. Stiplede linjer markerer boundaries af Dil-Ac-LDL + EF og de omkringliggende kontaminerende celler. Hvide pilespidser indikerer ikke-EF uden en EF-koloni, som bør fjernes med en pipettespids. Scale søjler repræsenterer 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. kloningsringe og fysisk fjernelse af ikke-EF-Producere Rene og funktionelle Langsigtede EF kulturer. (A) Repræsentative FACS dot plots af CD31 farvning af forskellige EF-kloner. Tre repræsentative prøver er vist. Den åbne sorte firkant i hver parcel skitserer CD31 + befolkning. En IgG isotype anvendes som en negativ kontrol. (B) Måling af endotel genekspression i udvalgte NEC og TEC-kloner. MRNA-niveauerne af endothelial gener CD31, CD133, Cdh5 og VEGFR2 udtrykkes forhold til dem for muse embryonale fibroblaster (MEF'er) og mRNA-niveauer af mesenchymale gener COL1A1 og Tagln udtrykkes i forhold til de af NEC-1. (C) Repræsentant immunfluorescensfarvning en udvidet TEC-klon. CD31 er vist i grønt og kerner farves blå med 4'6'-diamidino-2-phenylindol (DAPI). (D) Repræsentative billeder af rør dannelse af forskellige EF-kloner belagt på Matrigel. Scale søjler repræsenterer 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. EF Isoleret fra Cdh5 CRE: ZsGreen
| Celleantal | FACS buffer (pi) | CD31-PE-antistof (pi) |
| 1 x 10 7 | 100 | |
| 2 x 10 7 | 200 | 6 |
| 3 x 10 7 | 300 | 7 |
| 4 x 10 7 | 400 | 8 |
| 5 x 10 7 | 500 | 9 |
| 6 x 10 7 | 600 | 10 |
Tabel 1. PE-konjugeret anti-CD31 antistof Mængderne påkrævet for forskellige Cell Numbers.
| Celleantal | FACS-buffer (pi) | Anti-PE magnetiske mikrokugler (pl) | 1 x 10 7 | 80 | 20 |
| 2 x 10 7 | 160 | 40 |
| 3 x 10 7 | 240 | 60 |
| 4 x 10 7 | 320 | 80 |
| 5 x 10 7 | 400 | 100 |
| 6 x 10 7 | 480 | 120 |
Tabel 2. Anti-PE mikroperle Mængderne påkrævet for forskellige Cell Numbers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På grund af de problemer med at opnå rene primære TEC kulturer, mange in vitro-undersøgelser erstatning TEC med kommercielt tilgængelige EF linjer eller primær EF såsom menneskelig navlestrengen vene EF (HUVEC) 13. Dog kan disse EF befolkninger mod normalt væv kun tjene som en proxy for TEC, der markant adskiller sig fra deres normale modstykker. For eksempel TEC er fænotypisk og funktionelt unormale in vivo og nogle af disse abnormaliteter kan være smitsomme in vitro 14-18. TEC har afvigende vækst, vandrende, og differentiering evner og kan smelte sammen med CD31 + tumorceller til at danne fartøj-lignende strukturer 16,19,20. Undersøgelser med enten dyrkede TEC eller laser capture mikro-dissekeret tumor skibe har vist, at TEC afviger fra normal EF genekspression, cytogenetiske og epigenetiske profiler 12,18,21-23. Trods uddybe vores forståelse af tumor angiogenese i det forløbneårtier, meget få funktionelle og mekanistiske undersøgelser ved hjælp af dyrkede primære TEC er tilgængelige.
EF blev isoleret fra human umbilical årer i begyndelsen af 1970'erne 24. Efterfølgende isolering og dyrkning af mikrovaskulære EF fra andre humane og murine væv har givet et stærkt værktøj til at undersøge endoteliale funktioner i både sundhed og sygdom 25-28. De fleste EF isolation protokollerne omfatter tre hovedtrin: opnåelse af en enkeltcelle-suspension efter mekanisk dissociering eller enzymatisk spaltning, mærkning EF med en endotel-specifikt antistof, som er konjugeret til enten en fluorophor eller magnetiske mikroperler, og berige EF befolkningen, der bruger cellesortering eller magnetiske kolonner. Men isolering af muse EF, især fra tumorer, har vist sig vanskelig på grund af det lave udbytte af levedygtige EF og hyppige forurening af andre celletyper, herunder tumorceller og fibroblaster. Hertil kommer, in vitro fænotypisk drift af EF i migsenchymal-lignende celler (endotel-til-mesenkymal overgang, EndMT) udgør en yderligere udfordring for langsigtet dyrkning af EF fra normale væv, tumorer, og omprogrammerede forstadier.
Den største udfordring i løbet af TEC isolation er forurening med tumorceller, som nemt kan udkonkurrere de langsommere voksende EF kolonier, der typisk vises efter ~ 7 - 10 dage i kultur. Desuden er en almindeligt anvendt selektionsmarkør til isolering EF CD31, som er rigeligt udtrykt i endotelet, men også markerer hæmatopoietiske celler og i nogle tilfælde tumor cellesubpopulationer 20,30. Desuden samtidig berigende for EF immunomagnetisk kolonne udvælgelse CD31-medieret kan ikke fjerne hver eneste forurenende celle, der i sidste ende kan overtage EF kulturer efter et par passager. Ved at tilføje en kloning-ring trin, man er i stand til at vælge og udvide rene klonalt afledte EF befolkningsgrupper, som er fri for disse kontaminerende celletyper. En anden udfordring er den langsigtede vigtigstevedligeholdelse af ren EF uden fremme af EndMT. EndMT forekommer under udvikling, kan sammenfattet i vaskulær dysfunktion og er almindelig i dyrkede EF (især i nærvær af TGFp) 31-33. For at minimere EndMT, fjerne kontaminerende celler, der kan fungere som en kilde TGFp, holde kulturer ved høje densiteter, og opretholde høje koncentrationer af bFGF i medierne på alle tidspunkter. Som vi har vist for nylig, bFGF er vigtigt at bevare EF specifikation som det antagoniserer TGF-drevne udtryk for glatmuskelactin (en EndMT markør) 34.
Ved hjælp af denne metode, isolering af EF fra en "skæbne-kortlagt" reporter mus blev også vist. Disse mus er særligt anvendelige til undersøgelser, hvor intravital billeddannelse er brug 35. Selvom der kan forekomme nogle mærkning af hæmatopoietiske celler i Cdh5 CRE: ZsGreen l / S / L-mus, der anvendes her, denne model giver en relativt hurtig og nem metode til at generere influenzaorescent EF in vivo. En alternativ EF afstamning-mærkning model er en tamoxifen-inducerbart mus (Cdh5 CRE / ERT2) krydset med en floxed reporter musestamme (ZsGreen l / s / l), der vil have EF trofast og irreversibelt markeret 36,37 . Fluorescerende EF fra inducerbare CRE mus kan også renses ved hjælp af FACS eller ved hjælp af metode beskrives heri.
EF er heterogene tværs af forskellige vaskulære senge og "intra-fartøj" heterogenitet kan også findes blandt EF inden for samme beholder 38,39. Desuden er et hierarki af EF med forskellige proliferativ potentiale blevet observeret i EF populationer isoleret fra vener, og en lille brøkdel af klonal EF kan passeres over 40 populationsfordoblinger 40. Derfor begrænsninger af den beskrevne fremgangsmåde her nævnes: 1) mulige udvalg af disse meget proliferativ EF bosiddende i karvæggen; og 2) tilsætning af kun en specSp ec ifik vaskulær undertype afledt af arterier, vener, eller kapillærer, hvilket kan frembringe kloner, der ikke helt repræsenterer den samlede EF-befolkning in vivo. Ikke desto mindre, som flere klonede subpopulationer kan fås fra en isolation procedure, kan denne metode være nyttig for funktionelle og genetiske analyser af EF heterogenitet, der eksisterer inden for tumorer og andre væv 12. Tilsammen er beskrevet her er en EF isolation metode, der frembringer ren EF kolonier blottet for kontaminerende non-EC. De isolerede celler bør være nyttige til in vitro funktionelle studier, genom-dækkende udtryk profilering, og molekylær karakterisering af nye veje, der styrer tumorangiogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic-Antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium (1 g/L D-glucose) (LG-DMEM) | Gibco | 11885-084 | |
| EGM-2 Bullet Kit | Lonza | CC4176 | Not all components used |
| Fetal bovine serum (Hyclone) | Thermo Scientific | SH30071.03 | Heat inactivated at 56 °C for 30 min |
| Nu-Serum IV | Corning | CB-51004 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBBS) | Gibco | 14175-095 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | |
| FACS buffer | 0.5 % BSA and 2 mM EDTA in PBS, filtered through a 0.22 μm filter | ||
| 75% v/v ethanol for disinfection | |||
| Anti-PE microbeads | Miltenyi Biotech | 130-048-801 | |
| Bovine serum albumin (BSA) fraction V, 7.5% | Gibco | 15260-37 | |
| Cell freezing media (Bambanker) | Wako Chemicals | 302-14681 | |
| Collagenase type II | Worthington Biochemical | LS004176 | Make stock concentration 2 mg/ml in HBSS |
| Deoxyribonuclease I (DNase) | Worthington Biochemical | LS002004 | Make stock concentration 1 mg/ml in PBS |
| Dil-Ac-LDL | Biomedical Technologies | BT-902 | |
| EDTA, 0.5M, pH 8.0 | Cellgro | 46-034-CL | |
| Enzymatic cell detachment solution (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | |
| Gelatin, 2% in water, tissue culture grade | Sigma-Aldrich | G1393-100ML | Dilute in PBS to make 0.5% gelatin solution |
| Mouse FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotech | 130-092-575 | |
| Neutral protease (Dispase) | Worthington Biochemical | LS02104 | Make stock concentration 2.5 U/ml in HBSS |
| PE-rat anti-mouse CD31 antibody | BD Pharmingen | 553373 | |
| RBC lysis buffer (BD Pharm Lyse) | BD Pharmingen | 555899 | |
| Sterile water | |||
| Trypan blue, 0.4 % | Life Technologies | 15250-061 | |
| 10 mm tissue culture dishes | Corning | ||
| 15 ml conical tubes (sterile) | Corning | ||
| 50 ml conical tubes (sterile) | Corning | ||
| 6-well tissue culture plates | Corning | ||
| Tissue-dissociator tubes (gentleMACS) C tubes) | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | |
| Cell Separator (MidiMACS) | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| Cell strainer 100 μm | Corning | 352360 | |
| Cloning rings (assorted sizes) | Bel-Art Products | 378470000 | |
| Cryotubes | Thermo Scientific | ||
| Dissecting board | Sterilize or disinfect with 75% v/v ethanol before use | ||
| Dissecting forceps and scissors | Sterilize before use | ||
| Dissecting pins 2" | Sterilize before use | ||
| FACS tubes with 35 μm filter cap | Corning | 352235 | |
| Filter cup (Stericup, 0.22 μm) | Millipore | SCGPU05RE | |
| Fine-tip marker | |||
| Hemocytometer | |||
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| Magnetic Multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Tissue adhesive (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Or a centrifuge with similar capacity for 15 ml and 50 ml conical tube centrifugation |
| Tissue culture hood | |||
| Tissue dissociator (gentleMACS) | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | Preset program "m_impTumor_01" used for tissue dissociation |
| Liquid nitrogen freezer | |||
| Microplate or rotary shaker | |||
| Phase contrast light microscope |
References
- Folkman, J. Anti-angiogenesis: new concept for therapy of solid tumors. Ann. Surg. 175 (3), 409-416 (1972).
- Butler, J. M., Kobayashi, H., Rafii, S. Instructive role of the vascular niche in promoting tumour growth and tissue repair by angiocrine factors. Nat. Rev. Cancer. 10 (2), 138-146 (2010).
- Franses, J. W., Baker, A. B., Chitalia, V. C., Edelman, E. R. Stromal endothelial cells directly influence cancer progression. Sci. Transl. Med. 3 (66), 66ra5 (2011).
- Calabrese, C., et al. A perivascular niche for brain tumor stem cells. Cancer Cell. 11 (1), 69-82 (2007).
- Beck, B., et al. A vascular niche and a VEGF-Nrp1 loop regulate the initiation and stemness of skin tumours. Nature. 478 (7369), 399-403 (2011).
- Aird, W. C.
- Dudley, A. C.
- Aird, W. C.
- Voyta, J. C., Via, D. P., Butterfield, C. E., Zetter, B. R. Identification and isolation of endothelial cells based on their increased uptake of acetylated-low density lipoprotein. J. Cell Biol. 99 (6), 2034-2040 (1984).
- Zovein, A. C., et al. Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 3 (6), 625-636 (2008).
- Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., van der Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat. Protoc. 3 (6), 1085-1091 (2008).
- Xiao, L., Harrell, J. C., Perou, C. M., Dudley, A. C. Identification of a stable molecular signature in mammary tumor endothelial cells that persists in vitro. Angiogenesis. 17 (3), 511-518 (2014).
- Beijnum, J. R., et al. Gene expression of tumor angiogenesis dissected: specific targeting of colon cancer angiogenic vasculature. Blood. 108 (7), 2339-2348 (2006).
- McDonald, D. M., Choyke, P. L. Imaging of angiogenesis: from microscope to clinic. Nat. Med. 9 (6), 713-725 (2003).
- Baluk, P., Hashizume, H., McDonald, D. M. Cellular abnormalities of blood vessels as targets in cancer. Curr. Opin. Genetics Dev. 15 (1), 102-111 (2005).
- Ghosh, K., et al. Tumor-derived endothelial cells exhibit aberrant Rho-mediated mechanosensing and abnormal angiogenesis in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (32), 11305-11310 (2008).
- Amin, D. N., Hida, K., Bielenberg, D. R., Klagsbrun, M. Tumor endothelial cells express epidermal growth factor receptor (EGFR) but not ErbB3 and are responsive to EGF and to EGFR kinase inhibitors. Cancer Res. 66 (4), 2173-2180 (2006).
- Hida, K., et al. Tumor-associated endothelial cells with cytogenetic abnormalities. Cancer Res. 64 (22), 8249-8255 (2004).
- Dudley, A. C., et al. Calcification of multipotent prostate tumor endothelium. Cancer Cell. 14 (3), 201-211 (2008).
- Dunleavey, J. M., et al. Vascular channels formed by subpopulations of PECAM1(+) melanoma cells. Nat. Comm. 5, 5200 (2014).
- St Croix, B., et al. Genes expressed in human tumor endothelium. Science. 289 (5482), 1197-1202 (2000).
- Bhati, R., et al. Molecular characterization of human breast tumor vascular cells. Am. J. Pathol. 172 (5), 1381-1390 (2008).
- Johnson, C. S., Chung, I., Trump, D. L. Epigenetic silencing of CYP24 in the tumor microenvironment. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 121 (1-2), 338-342 (2010).
- Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Folkman, J. Human vascular endothelial cells in culture. Growth and DNA synthesis. J. Cell Biol. 60 (3), 673-684 (1974).
- Burridge, K. A., Friedman, M. H. Environment and vascular bed origin influence differences in endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 299 (3), H837-H846 (2010).
- Zhang, J., Burridge, K. A., Friedman, M. H. In vivo differences between endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries revealed by microarray analysis. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295 (4), H1556-H1561 (2008).
- Paruchuri, S., et al. Human pulmonary valve progenitor cells exhibit endothelial/mesenchymal plasticity in response to vascular endothelial growth factor-A and transforming growth factor-beta2. Circ. Res. 99 (8), 861-869 (2006).
- Wylie-Sears, J., Aikawa, E., Levine, R. A., Yang, J. -H., Bischoff, J. Mitral valve endothelial cells with osteogenic differentiation potential. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31 (3), 598-607 (2011).
- Ginsberg, M., et al. Efficient direct reprogramming of mature amniotic cells into endothelial cells by ETS factors and TGFβ suppression. Cell. 151 (3), 559-575 (2012).
- Sapino, A., et al. Expression of CD31 by cells of extensive ductal in situ and invasive carcinomas of the breast. J. Path. 194 (2), 254-261 (2001).
- Maddaluno, L., et al. EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations. Nature. 498 (7455), 492-496 (2013).
- Cooley, B. C., et al. TGF-β signaling mediates endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT) during vein graft remodeling. Sci. Transl. Med. 6 (227), 227ra34-227ra34 (2014).
- Garcia, J., et al. Tie1 deficiency induces endothelial-mesenchymal transition. EMBO Rep. 13 (5), 431-439 (2012).
- Xiao, L., et al. Tumor endothelial cells with distinct patterns of TGFβ-driven endothelial-to-mesenchymal transition. Cancer Res. 75 (7), 1244-1254 (2015).
- Kusumbe, A. P., Ramasamy, S. K., Adams, R. H. Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone. Nature. 507 (7492), 323-328 (2014).
- Wang, L., et al. Identification of a clonally expanding haematopoietic compartment in bone marrow. EMBO J. 32 (2), 219-230 (2012).
- Sawamiphak, S., et al. Ephrin-B2 regulates VEGFR2 function in developmental and tumour angiogenesis. Nature. 465 (7297), 487-491 (2010).
- Chi, J. -T., et al. Endothelial cell diversity revealed by global expression profiling. Proc. Natl. Acad. Sci. 100 (19), 10623-10628 (2003).
- Nolan, D. J., et al. Molecular signatures of tissue-specific microvascular endothelial cell heterogeneity in organ maintenance and regeneration. Dev. Cell. 26 (2), 204-219 (2013).
- Ingram, D. A., et al. Vessel wall-derived endothelial cells rapidly proliferate because they contain a complete hierarchy of endothelial progenitor cells. Blood. 105 (7), 2783-2786 (2005).
