Introduction
非再生可能燃料とその関連製品の下落のグローバルな供給として、科学者たちは、植物由来の源1から同様の燃料や化学物質を作成するために挑戦されています。この研究の重要な側面は、植物の種がバイオ燃料及びバイオマテリアル2,3の製造に適している可能性が決定されます。典型的には、これらの原料は、リグニン、セルロース、およびヘミセルロース含有量について評価されます。同様に、熱的、機械的、および/または化学的な前処理を経て解体（反抗）に対する感受性を持つか、その後の酵素糖化なし。より詳細な分析は、リグニンおよびヘミセルロース画分の特定の組成物、ならびに必要に応じて、最適な酵素活性を決定するために使用されます。本質的に希望する商品に生化学的または熱化学変換のための理想的な特性を持たない植物のトランスジェニック修正は鍋の大幅に拡張ソースで研究者に提供していますential原料4。小さ なサンプルセットのために非常に有用であるが、植物の化学的特性を定量化するための標準的な分析方法は、サンプル5-7の数百または数千の迅速なスクリーニングには不向きです。本明細書に記載のHTP法は、迅速かつ効率的に熱および/または酵素分解に細胞壁反抗の変化をバイオマス変異体の大きな番号を評価するために開発されてきました。
これは、HTPスクリーニングアッセイは、本明細書に記載の変換または収量を最大にするように設計されていないことを理解することが重要です。目的は、従来のバイオマス試料の固有の反抗の相対的差異を決定することです。その結果、分析ステップの多くは、目的の最大変換速度または程度を得ることである "典型的な"バイオマス変換アッセイ、異なります。例えば、下部前処理重大度および短い酵素加水分解時間は、異なる最大化するために使用されサンプル間ences。ほとんどの場合、比較的高い酵素負荷を大幅に結果をゆがめる可能性が酵素活性の実験的変動に起因する差異を減少させるために使用されます。
植物の細胞壁と単糖の組成を決定するための迅速な技術は、酵素糖化以下の遊離したロボット、カスタマイズされた、熱化学互換性の96ウェルプレート、および標準的な実験方法8-11や、振動分光法などの楽器のプロトコル（赤外線の変更が含まれます（IR）、近赤外線（NIR）、またはラマン）および核磁気共鳴（NMR）12-17。これらの方法論は、実験の削減につながる、高セルロース、低リグニン含量、または最高グルコース、キシロース、エタノールを得ることが予想される、 などが挙げられる。これらの方法は、バイオマスや消耗品の少量を採用するダウンスケールの分析を有効にしているとの供給原料を分離するための鍵です費用18 9、ポプラ8,10、サトウキビバガス8、およびスイッチグラス8など人気の原料は、首尾よくこれらのHTP法を用いて評価されています。
総リグニンおよびリグニン単量体組成物はまた、一般的にバイオマスの特性を定量化します。リグニン含量の減少は、多糖類19,20の酵素消化を増加させることが示されています。 （多くの場合、シリン/グアイアシル（S / G）の含有量として報告される）リグニン単量体の比率は植物細胞壁の解体で果たす役割はまだ調査中です。一部のレポートは、S / Gでその削減を示しています他の研究は反対の傾向19,22を発表しながら、比は、加水分解21後に増加したグルコース収量につながりました。リグニンおよびそのモノマーを評価するためのハイスループット法は、振動多変量解析と結合された分光法（IR、NIR、およびラマン23-26）、および熱分解分子ビーム質量分析法（pyMBMS）27,28を含みます 。
バイオマスをスクリーニングするためのHTP法を開発する場合、いくつかの不可欠な考慮事項が念頭に置いておく必要があります。一つの重要な側面は、方法の複雑さです。技術に必要なスキルレベルとは何ですか？計量化学分析は、例えば、構築評価し、予測モデルを維持するための特定のスキルを必要とします。標準的な方法は、望ましくない、準備やデータ解析の手順を示すか、有毒な試薬を使用しています。モデルの開発は、新しいデータがモデルの堅牢性を高めるために時間をかけてモデルに組み込まれている継続的なプロセスです。別considerationはコスト削減であると提案された高スループット法の実験的な分析時間を減少させました。この方法は非常に迅速ですが、非常に高価である場合には、採用する多くのラボのための実現可能な技術ではないかもしれません。この原稿に示される方法は、スループット能力を増幅するように修正された標準化された技術の変異体です。これらのプロトコルは、定量的予測モデルの開発を必要とすることなく、興味のあるバイオマスの特性を測定します。 、モデルを開発するために使用される標準的な分析と強い相関を示すが、実際にサンプルに対する関心の量を測定するほど正確ではありませんしながら、予測方法以来、これらの技術の重要な属性です。使用方法は、基本的に、標準的なベンチスケールの分析方法のバージョンをスケールダウンしているのに対し、正確さと精度、速度とスループットのために取引されています。ほとんどの場合、この結果は、小容量のピペッティングおよび計量の上位エラーに起因するものです。同様の増加サンプルサイズとして十分な不均一性が低減されます。大規模なサンプルセットをスクリーニングし、比較することができますが、別個のキャンペーンの間とベンチスケールの結果との比較を行う際に、細心の注意を払わなければなりません。
最も時間のかかるステップは、バイオマスの物理的操作を必要とします。研削サンプルはサンプル間圧延機を掃除などのサンプルあたりのいくつかの分をとることができます。手動でアンロードをロードし、クリーニングホッパー、充填、ティーバッグやサンプルバッグを空にすることも非常に労働集約的です。各ステップは分以上かかる場合がありますが、数千のサンプルを実行すると、数時間または数日かかる場合があります。ロボットは約3〜4時間または6〜8プレート1日目ロボット-1にバイオマスと典型的な反応容器プレートをロードすることができます。この状況は、同様にテストされる種類、バイオマスの量として使用される精度パラメータに依存します。水を原子炉プレートを充填、希酸、または酵素を迅速に液体処理ロボットを使用して行われます。 Pプレートスタック（1〜20の原子炉プレート）の再治療は、アセンブリは、クールダウン時に1〜3時間がかかり、解体は含まれています。酵素加水分解は3日かかり、糖分析は、アッセイを完了し、結果を読み取るために準備時間の約1時間を加えた反応容器プレートあたり10分を必要とします。設定前処理と分析日の週間スケジュールは、継続的に週〜800〜1000のサンプルをアッセイの人間コンポーネントの奇数時間や週末の努力を最小限に抑え、合理的な作業スケジュールを収納して処理することができます。最大スループットは、主にどのくらいのハードウェア（ロボット、原子炉プレートなど ）、いくつかの要因に依存し、どのくらいの「ソフトウェア」（ すなわち 、人材派遣）マニュアル作業を行うことが可能です。実用的な上限は、2,500〜3,000サンプル/週です。しかし、その出力は、7日週の操作と複数の学生のインターンや技術を必要とします。比較では、HPLCによる3000サンプルは、SAMの約125日を必要とするであろうPLE分析に加えて、手動で分析前に反応器およびフィルタリングのサンプルにサンプルを計量の追加の労働。
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Protocol
酵素糖化9,29に続いてグルコースおよびキシロース収量の1.高スループットの決意
- サンプル調製（研削、デ糊付け、抽出、前処理）
- 粒子は、20メッシュ（850ミクロン）スクリーンを通過するように、ウィリーミルを使用して、各バイオマス試料の少なくとも300ミリグラムを挽きます。帯電防止ジップトップバッグに移す（通常はバーコード）とバーコードのデータベースにサンプル情報を記録します。
- 番号が（鉛筆で、インクまたはマーカーを使用しないでください）ティーバッグに約静電気防止用の袋から地上バイオマスの250 mg以上を追加し、慎重にティーバッグをロールアップし、防止するために、バイオマスの上に端を折るようにしてくださいというデ糊付けし、抽出中の損失。
- ティーバッグは、スズ被覆銅線を使用して閉じたラップ。各バーコードのサンプルのティーバッグの数を記録します。
- 商業的な酵素（典型的には、0.25％（v / v）のグルコアミラーゼ（〜1600 AGU / L）からの脱糊付け酵素溶液を調製します0.1 M酢酸ナトリウム（pHは5.0）1.5％（v / v）のα-アミラーゼ（〜2900 KNU-S / L））。バルクバイオマスのグラムあたり16 mlまたは120ティーバッグサンプルあたり500ミリリットルを準備します。注意：地上バイオマスから澱粉を除去することができる負荷量は、酵素負荷および比の範囲で消化した後、デンプンのために試験することにより実験的に決定されるべきです。
- プラスチック容器では、バルク地上バイオマス1g当たりデ糊付け酵素液の16ミリリットルを追加します。バッチデ糊付けプロトコルの場合、緩衝酵素溶液500 mlに120ティーバッグを追加します。
- 可能な澱粉を除去するために、120rpmで、24（±4）時間、55℃でシェーカーでインキュベートします。
- 脱糊付けインキュベートした後、30分間脱イオン水で数リットルのバイオマスを洗浄し、浸し。カスケードに熱い液体エタノールを引き起こし、解決策のレベルの突然の暴力的な上昇をもたらすことができる溶液中の気泡のバンピング（形成を引き起こす可能性がありますバッファー塩を除去するために、このプロセスをさらに2回繰り返し抽出時の反応容器）のうち。
- 脱糊のバイオマスを徹底的にすすいだ後、抽出のためにソックスレー列にティーバッグを置きます。いいえシンブルは、このステップのために必要とされません。
- 95％のエタノールを用い、ソックスレー還流を設定し、24時間のサンプルを抽出します。
- ソックスレー反応器からティーバッグを取り外し、平らなトレイの上に単層に広がります。
- サンプルは、ヒュームフード中で室温で一晩乾燥することができます。
- ティーバッグをアンロールし、元のバーコード静電気防止袋に乾燥バイオマスを返します。
注：帯電防止袋取り扱い特性を改善する、バイオマス中の静電気を低減することで効率的です。他のストレージオプションが使用される場合、追加のバイオマスによる貯蔵容器の側面に付着したバイオマスに必要とされるかもしれません。 - バーコードホッパーに乾燥バイオマスの少なくとも50 mgの転送（より多くの材料を使用すると、正確な分注のためのより良いです）。 S帯電防止バッグや受信ホッパーのバーコードは正確なサンプルの追跡を確保することができます。
- 固体は、ラック内のサンプルのために細心の注意を払って、ロボットの重さにロードホッパー。すべてのサンプルが含まれており、使用したプレートの数に基づいて、分配プロトコルを選択するのに十分な原子炉プレートをロードします。
- ロボット耐酸性ステンレス鋼96ウェルプレートに乾燥した試料（±0.3 mg）を5mgの重量を量ります。いずれかの局所的な変動を最小限にするために、プレートの周りに分布し、各サンプルの3複製を秤量。
- アッセイ性能を追跡するために、十分に特徴付けられたバイオマス標準材料の8制御バイオマスサンプルを含みます。複数のプレートは、複数の標準的なバイオマスホッパーの使用を繰り返し、分配サイクルでホッパーにふるいにかけることによって生じる粒子サイズのずれを最小限に抑えることができます。
注：各プレートには、3反復で24サンプル、脱イオン水と酵素からなる4ブランク、および8制御があるはずですLS、以前に特徴付け標準バイオマスを使用。プレートの4隅の各々の3コーナーウェルは、糖標準用に予約されています。 - 誤ったバイオマス粒子のための空白と砂糖標準井戸を確認し、存在する場合は削除します。
- 各ウェルに脱イオン水250μlを添加し、シリコーン接着剤付きポリテトラフルオロエチレン（PTFE）テープでプレートをシール。
- 1/8「はんだごてチップを用いて、各プレートのために、各蒸気口（117合計）でPTFEテープを突き刺します。密封された反応容器プレート上に積層空のプレートをガイドとして使用して、PTFEフィルムの動きを制限します。
- スタックの上下にプレートし、空のプレートの間に0.031 "の厚さのガラス繊維強化PTFE製ガスケット（蒸気ポート用の穴をあらかじめパンチ）でしっかりとプレートを固定します。 17.5分、または所望の重症度に基づいて、他の温度/時間の組み合わせのために180℃に設定した蒸気反応器を用いてサンプルを前処理。
- 50℃に冷却し、反応器プレート;脱イオン水でフラッディングすることで、C。
- 酵素的糖化
- 1.0 Mクエン酸ナトリウム、pHが5.0に8％（v / v）の酵素溶液からなる酵素糖化液を準備します。反応容器プレートあたり5ミリリットルを準備します。注：必要な希釈は、特定のストック酵素溶液の活性およびタンパク質含量に基づいて決定されるべきです。
- プレートがクールである場合、20分間1500×gで、スイングバケットローターでそれらを遠心分離します。封止膜削除します。注：これらのプレートは重く、遠心仕様は互換性のためにチェックする必要があります。
- 各ウェルに8％の酵素原液（グラムバイオマスあたり70 mgの酵素）の40μLを追加します。
- 新しいPTFEテープで再密封。磁性板クランプに密封プレートを置きます。
- 静かに反転によるサンプル（少なくとも15倍）を混合し、70時間50℃でインキュベートします。
- 糖化が終了した場合には、1,500 xで反転し、遠心分離することによって、プレートを混ぜます20分間グラム。
- シュガーアッセイ
- 6グルコースおよび0.014 Mクエン酸緩衝液中のキシロース組み合わせ校正標準0から0.750ミリグラム/ mlの範囲（pHは5.0）のセット準備（0、0.2、0.3、0.45、0.65、および0.75 mgの/ mlの推奨）、および0から0.600それぞれグルコースとキシロースのためミリグラム/ mlの（0、0.1、0.2、0.35、0.45、および0.6 mgの/ mlのを推奨）、。
- キットの説明書に従って、グルコースオキシダーゼ/ペルオキシダーゼ（GOPOD）およびキシロースデヒドロゲナーゼ（XDH）試薬を準備します。
- ピペットを用いて、反応容器プレートのコーナーウェル（12ウェルの合計）に隣接する4コーナー井戸とエッジウェルから液体の200μlのを削除します。
- ピペットを用いて、96ウェルポリスチレン平底希釈プレートの各ウェルに180μlの脱イオン水を分配します。 12砂糖標準とコーナー井戸に水を追加しないでください（96チャンネルヘッドを使用している場合、これらのヒントを削除します）。
- ピペットを使用して、グルコースアッセイPLの各ウェルに180μlのGOPOD試薬を分配食べました。
- ピペットを用いて、キシロースアッセイプレートの各ウェルに180μlのXDH試薬を分注します。
- ピペットを用い、希釈プレートに96ウェルの反応器プレートから20μlの加水分解物のアリコートを移します。井戸の上部からピペットは、バイオマス固形分とコーナーウェル内の残液を避けるために。少なくとも10サイクル粉砕して混合します。
- ピペットを用い、希釈プレートのコーナーウェルに、二重に、糖標準の110μLを移します。
- ピペットを使用して、グルコースおよびキシロースアッセイプレートに、希釈プレートからの20μlのアリコートを移します。粉砕して混ぜます。
- 30分間室温でグルコースおよびキシロースアッセイプレートをインキュベートします。慎重に読む前に任意の表面の気泡を破ります。簡単にプレートの表面上を通過ヒートガンはうまく動作します。
- 紫外/可視96ウェルプレートリーダーを使用して、510 nmの測定波長を設定し、試薬ブランクに対して吸光度を記録。この測定は、グルコース濃度に比例するキノンイミンの形成を監視します。グルコース濃度は、1.3.1で調製した較正標準に基づく較正曲線から計算します。
- 紫外/可視96ウェルプレートリーダーを使用して、340 nmの測定波長を設定し、吸光度を記録します。この測定は、キシロース濃度に比例したNADHのNAD +の還元を、監視します。キシロース濃度は、1.3.1で調製した較正標準に基づく較正曲線から計算します。
pyMBMS 28を用いて、全リグニンおよびリグニン単量体含有量の2.高スループット決意
- サンプル調製
- ステップ1.1.1、および1.1.6-1.1.8に記載の方法を用いてバイオマスを粉砕し、抽出します。これは、研削、実験のコントロールとして使用する標準のセットの抽出が含まれます。
注：pyMBMS measurementsではなく、粒子サイズに依存しているので、唯一pyMBMSプロトコルを使用する場合、バイオマスの調製は、試料は、<、サンプルホルダーに4ミリメートル適合できるようにするために行われるべきです。 - 約4 mgの小さなへら分配を使用したオートサンプラー用に設計された80μlのステンレス製のカップに準備されたバイオマスの（3〜5 mgのが好ましいです）。
- （または麦わら-8494;ポプラ-8492;松-8493サトウキビバガス-8491）、分析されるサンプルの少なくとも10％は、米国立標準技術研究所から入手可能なもののような管理基準であることを確認してください。標準はまた、すでに標準的な方法を用いて特徴付けられた分析されるべきサンプルに類似の任意の種であってもよいです。
- ランダムに時間をかけて可能な分光器のドリフトによるバイアスを避けるために、ピンセットを使用して、オートサンプラーカップにサンプルをロードします。注：サンプルの典型的なランダム化は、一度、すべてのサンプルの測定が含まれるであろう、再ランダム化が続きます重複した測定のためのサンプル程度の。ランダム化プログラムは、オンラインで入手できます。
- 標準穴パンチを使用して、手動でなしバインダーと、型A / Dガラス繊維シートからガラスフィルターディスクを製造します。 、ピンセットでラウンドガラス繊維フィルターを持ち、サンプルカップの上にセンター、実験中に各カップ内の物質を閉じ込めるために3.5ミリメートル六角レンチを使用して、試料中に押し込みます。
- ステップ1.1.1、および1.1.6-1.1.8に記載の方法を用いてバイオマスを粉砕し、抽出します。これは、研削、実験のコントロールとして使用する標準のセットの抽出が含まれます。
- インストゥルメンタル・プロトコル
- 実験試料のために存在することができる化合物の全範囲にわたって最大強度を持つ既知の標準を用いて、質量分析計を較正します。典型的なバイオマスサンプルについては、パーフルオロトリブチルアミン（PFTBA）を使用します。
- ガス流量計を使用して、0.9 L /分のヘリウムキャリアガス流量を設定します。
- 500℃での熱分解温度とオートサンプラーソフトウェアを使用して350°Cまでの界面温度にオートサンプラー炉を設定します。注記：1/8 "ステンレス鋼を加熱質量分析計にオートサンプラーを接続する熱テープで包まれた移送ラインを、250℃での熱コントローラを用いて制御されます。
- 質量分析計でのデータ収集を開始し、バックグラウンドスペクトルの収集のための十分なデータを取得するために、少なくとも60秒待ってください。
- 2.2.2からの仕様に自動化されたオートサンプラー法を開始します。注意：オートサンプラーは、オートサンプラー炉に個別に各サンプルを削除します。総データ収集時間は約1.5分です。しかし、典型的な4 mgのサンプルの熱分解は、30秒後に完了しました。
- 0.5秒のスキャン速度で、質量分析ソフトウェアを使用して、各サンプルの記録総イオン量（TIC）。 m / z 30〜450の間でレコードの強度。
注意：代表的なバイオマス化合物は、17 eVの時にソフトイオン化を使用します。機器は、1,000のm / z 1から大きな間隔を記録することができます。しかし、走査速度は、コンピュータのCPUパワーによって制限されます。 - MAを使用して、スペクトルから背景を削除しますヌアルはソフトウェアで機能を強化します。注：データ収集の開始時にベースラインの60スキャン部は、平均バックグラウンド値を計算するために使用されます。この平均背景スペクトルは、質量分析計ソフトウェアで自動的に実験サンプルスペクトルから除去されます。
- データベースプログラムの中に、各サンプルのスペクトルデータを含む質量分析計ソフトウェアによって作成された単一列のテキストファイルをインポートし、1のデータベースにすべてのサンプルを組み合わせます。スプレッドシートに適用可能なメタデータを追加します。統計ソフトウェアパッケージにフォーマットされたデータ（表計算/ CSVファイル）をインポートし、熱分解サンプルの質量の変動を考慮するためにスペクトルを正規化する意味。
- 測定に使用される複製された標準サンプルのグループを分析するためにスペクトルデータを用いて、主成分分析（PCA）を実行するために、統計ソフトウェアパッケージを使用し、ならびに化学物質の分類に不可欠であるピークを評価しますローディングプロット28中の化合物。
PCAグループそのスペクトルの類似性に基づいて、サンプル、および標準のチェックは実行時に起因する機器のドリフトに実験誤差を測定することができます注意してください。 - リグニンシリン（S）/グアイアシル（G）の比を計算するために、Sのピーク面積を合計（M / Z = 154、167、168、182、194、208、および210）Gピークの和で除算124、137、138、150、164、および178で。
- 総リグニン含量を計算するには、M / Z = 120、124、137、138、150、152、154、164、167、178、180、182、194、及び210とリグニンのピークを合計。
- そのようなKlasonリグニンとして、総リグニンを推定するための標準的な方法にpyMBMS測定値をスケーリングするための補正係数を算出します。 pyMBMSを使用して、標準試料に対して測定された全リグニン含量によって、個々の標準のKlasonリグニン値を割ります。
- データセット内のすべてのような種には、この補正係数を適用します。分析バイオマスの種類ごとに繰り返します。 NOTE：補正係数を分析バイオマスのS / Gに基づいて大きく変化することができます。
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Representative Results
熱前処理およびそれに続く酵素糖化の複合効果は、アッセイの終了時に放出されるグルコースおよびキシロースの質量の関数として測定されます。結果は、バイオマスのグラムあたりの放出されたグルコースとキシロースのミリグラムで報告されています。これは通常、出発材料の組成分析に基づく理論収率パーセントとして報告されているベンチスケールのアッセイから報告されたデータとは全く対照的です。それはまだ週あたりのサンプルの数千に組成分析を行うことは現実的ではないように、データは、最高の質量に基づいて、変換レベルとして報告されます。これは限り比較がバイオマスの密接に関連したサンプル間で行われており、サンプルの組成があまり変化しないよう合理的なサンプル評価を可能にします。
アッセイの主な目標は、組み合わせ熱/ enzymに植物細胞壁の抵抗値の相対的差異を評価することです個々の変異体の範囲にわたってATIC糖化。これは、アッセイは、糖化のために使用される条件のいずれかを最適化しようとしないことは注目に値します。実際には、前処理の重要度の条件は理論値の70％に50％の最終的な変換収率を標的、アッセイの感度範囲を拡大するために大幅に最適以下です。最適またはその近く前処理条件が大幅にアッセイのダイナミックレンジを狭め、高い変換にすべてのサンプルをプッシュするだろう。逆に、酵素負荷は、典型的には、ベンチスケールの消化のために報告されているものよりもはるかに大きいです。繰り返しますが、この方法の目標は最高の酵素を見つけるか、酵素コストを最小限に抑えるが、変換に細胞壁の固有の反抗を測定し、非常に高い酵素負荷を用いたアッセイからの変動を削除することではありません。
最後に、全体的なアッセイにおける変動はbencについて報告されたよりも有意に高いことを理解することは重要ですHスケールの作品。範囲ははるかに広いですが、典型的な標準誤差は、8％程度です。これは単に、小規模、HTPの研究の性質です。蒸発および凝縮損失であるためピペッティングし、計量誤差は、マイクロリットルとmgのスケールで比例高くなっています。各サンプル中の大きさより少ない粒子、 すなわち 、複数のG対5ミリグラムのいくつかの注文を検定する際にバイオマス不均一性は非常に大きな変数になります。グルコースおよびキシロースを決定するために使用される比色アッセイは、HPLCの結果とよく相関します。糖分析のための酵素結合アッセイは迅速であり、並行して実施することができるがしかし、それらは、例えば、HPLCのような分析方法の不正確さの別の層を導入する（ 図1）のように正確ではありません。
以上により考慮事項のすべてに、結果のみ解釈されるべきであり、一定の制限内で報告されました。データはセット全体ではなく、個々のサンプルとして検討されるべきです。反復は、MEAのために必要とされますningful結果。トレンドと異常値は意味があるが、1つの結果がありません。比較は、最良の単一実験セット内で行われています。時間的または空間的に分離されたキャンペーン間の比較は意味のあることが、非常にタイトなコントロールと慎重な精査を必要とします。 HTPデータは、ベンチや他の規模データに直接比較することはできません。トレンドは、HTPと他のスケール間のトラックが、直接のサンプルの比較は、同一の結果が得られません。
データ表現は、一般的な傾向、外れ値、またはサブ母集団/バリアントの比較に落ちます。トレンドの例は、米国19の太平洋岸北西部での広い範囲でサンプリングされたポプラの755天然の変異体の反抗の調査です。 pyMBMSによって決定されるように、これらのサンプルの反抗は、それらのリグニン含量とシリン/グアイアシル比に対してプロットしました。結果は、S / Gが上昇すると、反抗は約2のS / G比、反抗のインプレッションまで減少することを示していますovementレベルオフ（ 図2）。外れ値は、明らかにPt4CL1遺伝子は、ポプラにダウンレギュレートされた図3に見ることができます。数百品種をスクリーニングし、減少した糖放出によって証明されるように、いくつかが明らかに反抗して増加している。 図4は 、いくつかの異なるコムギわら品種は成長条件のいくつかのバリエーション2年後、収穫に比べていくつかの観光スポットに成長された研究を示しています、上記の変数の組み合わせに基づいて、20の異なる集団が得られます。これらのサンプルセットは、容易に区別され、反抗のための正と負の変数を示す。pyMBMSは細胞壁組成の変化を評価するために使用する方法を図5に示す図 。質量スペクトルフラグメントは異なるリグニンモノマー（ 表1）に割り当てられています。高い炭水化物含量対高リグニンで試料を比較すると、スペクトルデータにおける格差が明らかです。 T彼は、主成分分析（PCA）と結合されたpyMBMSデータを用い、図6に示されている。この例では、サンプルは、低または高窒素施肥に従って分類されます。リグニンと炭水化物内容はPC1に沿って逆に揃えます。主成分ローディングプロットを使用すると、化学的形質は形質は、サンプルクラスタ間で変化しているのスコア分類プロットだけでなく、解明に説明されているかを特定するのに役立ちます。
図1：HPLC 9対ハイスループット比色アッセイを用いて、グルコースとキシロース定量の比較 。グルコースおよびキシロースの検出の比較は、キシロースデヒドロゲナーゼ（XDH、上のパネル）およびグルコースオキシダーゼ/ペルオキシダーゼ（GOPOD、下パネル）、高スループットの比色酵素結合アッセイおよび高性能Lを用いて行きました。iquidクロマトグラフィー。
図2：リグニン画分中の（S / G）のコンテンツをグアイアシルするシリンの関数としてポプラ細胞壁の反抗を増やす中のリグニン9（S / G）のコンテンツをグアイアシルするシリンの関数としてのポプラの細胞壁の反抗ています観察され、報告されて。同じポプラ品種の755ポプラコアサンプルは、熱前処理と酵素糖化後に北アメリカの太平洋岸北西部の森林の数百マイル以上取られ、グルコースとキシロースリリースのためにスクリーニングしました。 pyMBMSによって決定される結果は、細胞壁リグニンにおけるS / G比に対してプロットしました。反抗は、より高いS / Gで一定のままであり、約2まで、S / Gの増加に伴って減少します。理論収率の値はBESC「標準」ポプラに基づいており、リファレとして提供されます比較のためにCE。
図3：反抗ポプラでダウンレギュレーションPt4CL1式のポプラでPt4CL1遺伝子のダウンレギュレーションは、しかし、いくつかの大幅増加反抗変異体が容易に識別され、クローン間細胞壁反抗にほとんど変化が生じた。 拡大表示するにはここをクリックしてくださいこの図のバージョン。
図4：さまざまなwheatstraw集団で反抗明確に区別反抗レベルの品種の種類、栽培のサイト、施肥、および散水率結果の影響。異なるシンボルはdiffere表しますNT実験成長条件。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5：植物細胞壁28内の化学的変化を分析するためのpyMBMSの応用矢印で示されたピークは、リグニン断片であり、（a）は、高リグニン（b）の培地リグニンまたは（c）の低リグニン含有量を評価しました。
図6：上位と下位受精率28を用いて成長させた人口の多い樹木の細胞壁の化学的性質の違いの主成分分析のスコアプロット （上）主成分分析。スコアは、異なる分類を示すプロットし、したがって、人口の多い樹木の細胞壁の化学的性質の差は、より高い及びより低い受精率で成長しました。主成分1は、より高いリグニン（負）以上炭水化物（正）の内容に基づいてサンプルを分配しました。 （下）主成分負荷量は、化学成分がスコアプロット中のサンプルの2つのクラスター間変化する解明します。正の負荷が負の相関負荷が負のスコアと、そのため、より高いリグニン含量に合わせながら、高い炭水化物の内容を代表するものであり、正のスコアと相関しています。
| m / z | 分子の割り当て30 | S / G / Hの割り当て |
| 94 | フェノール | S / G / H |
| 120 | ビニルフェノール | H |
| 124 | グアヤコール | G |
| 137 | Ethylguaiacol、homovanillin、コニフェリルアルコール | G |
| 138 | Methylguaiacol | G |
| 150 | ビニルグアヤコール | G |
| 154 | シリン | S |
| 164 | アリル+プロペニルグアヤコール | G |
| 167 | Ethylsyringol、syringylacetone、propiosyringone | S |
| 168 | 4-メチル-2,6-ジメトキシ | S |
| 178 | コニフェリルアルデヒド | G |
| 180 | コニフェリルアルコール、syringylethene | S、G |
| 182 | シリンガ | S |
| 194 | S | |
| 208 | Sinapylaldehyde | S |
| 210 | Sinapylalcohol | S |
表1：pyMBMSによって検出された代表的な化合物の質量分析によって検出されるようにリグニン由来の熱分解フラグメントのピークのm / zと割り当てリスト。エバンス、RJとTAミルン（1987）に基づいて分子の割り当て。バイオマスの熱分解の分子特性エネルギーと燃料 1（2）：123-137。
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Discussion
次のようにハイスループットスクリーニング実験を行う際に、正確で再現性のあるデータを得るための重要なサンプル調製手順は次のとおりです。
シュガー放出アッセイ：
一般に、サンプルは、一度に、数十から数千の範囲のロットで製造されます。それぞれの主なステップは、典型的には、サンプル間の調製の変動を最小にするために前方に移動する前に、すべての試料について行われます。デ糊付けは、もともとプロトコルの一部ではなかったし、ある場合には省略することができます。ウッドコア試料と老化草本材料は、デンプン中一貫して低く、したがってばらつきを低減するために、脱糊付け必要としません。澱粉は、主要な関心事です。しかし、緑の組織植物のサンプルセットで、特に収穫は数時間にわたって生じる大きなサンプルセットについて。デンプンレベルは日照時間の間に上昇し、暗闇の間に枯渇しているとして、デンプンレベルはSで大幅に変化することができます澱粉からeveral時間とグルコースは、セルロースからのグルコースと区別がつかないため、高デンプンレベルが歪ん低反抗の測定につながることができます。 destarching工程での実際の酵素負荷は限りデンプン加水分解工程の時間枠内でアクセス可能なすべてのデンプンを除去するのに十分な余分なアクティビティがあるので、少ない問題です。使用される特定の酵素の変化は、時間、温度、デンプン除去工程の体積、及び攪拌速度は、確実に、デンプン除去レベルと速度の違いにつながることができ、可能な場合、経験的に決定されるべきです。最後に、抽出のためのティーバッグを包むとき、錫被覆銅線を使用しています。裸銅線は、偽糖値を与え、酵素溶液との望ましくない化学反応を引き起こすことができます。ステンレス鋼線は、密閉ティーバッグを維持するのに十分可鍛性ではありませんでしたがスズ被覆銅は、この問題を解決しました。
バイオマスの一貫した小型化は、ACCUに重要です二つの理由率データ：より簡単かつ一貫して分注しながら1）微粉砕バイオマスも、粗い素材よりも消化しやすいです。 2）粗すぎるバイオマスは詰まりが部分的にのみ開口部をブロックしている場合、それはふるいとして作用し、微粒子のみを介して可能にする、試料の観察された反抗を減少させることができ、不十分な材料が得られ、ホッパを詰まらせるか、することができます。少なすぎるバイオマスはホッパーに含まれている場合、それはコートホッパーの側面は、ロボットがホッパーを想定させることは空であり、サンプルは、分配工程にスキップされます。さらに、バイオマスの低レベルは、（皮など）より高密度の粒子は、コーンの底にふるいする傾向があり、最初に分配されます特にとして、誇張されたサンプルの不均一性に寄与することができます。材料の50mg未満が利用可能な場合、アッセイは、依然として行うことができます。しかし、サンプルが手に秤量する必要があります。しかし、手計量の結果が奪うからのものよりも可変です耳の計量。
準備工程に必要なバイオマスの実際の量は、十分に定義されていません。我々は、しかし、それぞれのバイオマスサンプルが原因で、取り扱い研削、およびホッパーの中に保持されているか、再現性分配されるだけでなく、抽出による損失に関して異なる特性を示し、妥当な出発点として250ミリグラムを示唆しています。タイプ間、さらには同じタイプ内のバイオマスの不均一性は、より定義されたプロトコルを排除します。経験はそれを容易にしても、これらのアッセイ法を実施するために希望される方は、単純に、自分自身のためのこれらの変数の多くを決定する必要があります。
エラーを導入することができる別のステップは、悪名高い困難であり、いくつかの理由のために、これらのアッセイにおいて重要である、マイクロタイタープレート中で混合されます。使用酵素液を濃縮し、バイオマスを酵素アクセス可能性を制限する、ウェルに添加した際に階層化することができます。糖化が進むにつれて、SUG解放ARSは、糖アッセイが不自然に高いまたは低いことができ、階層化、バイオマスの近くに集中し、サンプリング深さに依存することができます。これは重要な一貫性の糖分析を可能にするためであっても糖化し、得られた糖の均一な分布のためのバイオマスを有する酵素の完全な混合を可能にする、酵素添加酵素糖化後の試料を混合することが理由です。このような希釈またはアッセイプレートなどのバイオマスを含まないプレートでは、ピペッティングを繰り返す（トリチュレーション）による混合揺れよりもはるかに優れていることが証明されています。このプロトコルでのソリューションは、可変密度および粒子レベルを持っているようしかし、液柱内の分注速度と垂直先端の場所は重要です。速度は先端でキャビテーションに速すぎて、精度が悪い（吸引）と液体保持する場合（調剤）が発生することがあります。先端がウェル内の深すぎる場合には、バイオマスは、先端を詰まらせたり、先端が正確な吸引を防止し、底に押されて、そこにすることができます次のステップへ持ち越しおよび固執する液体のためのより外側の表面積があります。遅いチップの除去は、液体が表面張力によってバルク溶液を除去することを可能にするように、後者の問題は、若干、制御チップ離脱速度によって緩和することができます。先端撤退が遅すぎる場合、ピペッティングした液体は、同様にバックバルク溶液に忍び込むことがあります。バイオマス粒子は、先端に固執し、それらが混合またはアッセイプレートに移し、分析される試料の量の不正確さを作成する時に先端を詰まらせることができ、希釈プレートに移しなる傾向があります。これらは、読み出し時に光ビームを閉塞する場合、これらの粒子は、アッセイプレートの分光分析を妨害する可能性があります。
一貫性のある発色タイミングがGOPODとXDHアッセイのために非常に重要です。発色は、完了に行くことを許可する必要があります。しかし、GOPODアッセイ色が完了し、ゆっくりとXDHアッセイによって生成されたNADHの後に上昇し続ける傾向にありますNADHの自然酸化を減少します。その結果、タイミングばらつきが別々のプレート間のデータの一貫性のない比較につながることができます。ハードウェアまたはソフトウェアの問題に起因するストライキは、アッセイ時間の大きな差につながる可能性としてアッセイ工程は、注意深く監視する必要があります。各プレート中の糖標準および標準バイオマス対照ウェルの使用は、ある程度これを緩和することができます。
PyMBMS：
標準は慎重に、標準的な湿式化学法との比較のためpyMBMS実験のために考慮されなければなりません。バイオマス種の異なるリグニン組成物（S / G比）に、補正係数は、実験サンプルと同じ種である代表的な標準を使用して決定されなければなりません。使用可能な適切な標準が存在しない場合は、リグニン濃度の差は、直接リグニン前駆体の強度を用いて比較することができます。 （オーバー〜3.5）高S / G比がlの過大評価につながることができますpyMBMSによってigninコンテンツ。 Sリグニンが優先この方法で使用される標準的な条件の下でリリースされるのは、この傾向により引き起こされます。また、pyMBMS測定に必要な試料の量は、使用されるバイオマスの種類に依存します。試料のより大きなアリコートを使用して、検出器を飽和させることができるように、単離されたリグニンとリグニンモデル化合物は、より少ない材料（0.1 mg）を必要とします。
PyMBMSプロセスのもう一つの重要なステップは、各実験の前に、このようなパーフルオロ（PFTBA）として知られている標準に楽器の慎重な調整です。 PFTBAは、典型的なバイオマスの全体のスペクトルにわたって分子のピークが含まれており、したがって、実験ランの間に均一な楽器のチューニングを可能にします。 PFTBAスペクトルの中間領域は、のm / z 131およびm / zの219は、およそのm / z 69の強度この調整の50％は、ソフトイオン化（17 eV）での下で見られる典型的なピークを強調するために使用されるように調整された使用されています下の大衆に、イオンの断片化を最小限にするために、Cということ ANNOTの識別を容易に行うこと。
これは、これらの方法は、目的の分析物の正確な定量化のための分析方法ではないことに留意すべきです。むしろ、これらのハイスループット技術は、所望の化学的特性を有するものを同定するための大規模なバイオマスセットのスクリーニングのためのものです。これらのメソッドは、データセット内のサンプルのスクリーニング、ランク付け、および相関のために使用されるべきです。湿度の変化、温度の変動、およびヒントの違いと吸光度プレートロットにバイオマスにおける周囲の水分含有量、そのような楽器のドリフトなどの変動のソースに起因する別の日に、酵素活性の変化を収集した場合、データセットは、直接比較することはできません。また、試料調製プロトコルで使用される前処理は、最適化された前処理戦略ではなく、具体的には準最適であるように設計されています。これは、工場間の微妙な違いをより効率的に解明することができます。
jove_content ">ハイスループット法を採用する主な利点は、例えば、酸または酵素糖化の間に生成炭水化物を分析するための一般的な方法は、高性能の使用であり、より多くのサンプルが同じ期間18で測定することができることです。液体クロマトグラフィー（HPLC）。セリグら 、構造炭水化物の定量化に非常に有用であり、最も重要もののユビキタス二段階の酸加水分解、。9週あたり約25サンプルを評価することができることに、研究者を制限している状態分析しながらハイスループット方法に用いられる機器は、迅速な分析がサンプルを大量に評価することができるという研究贅沢を与える、HPLCのような標準的な技術の感度を提供することはできません。また、ハイスループット法は、多くの場合、実験プロトコルをダウンスケールしています、消耗品の使用を低減し、そのため、実験コストおよび廃棄物を減少させます。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biomek FX Automated Workstation | Beckman Coulter | Biomek FX | Automated Liquid Handler |
| Wiley mill | Thomas Scientific | 3375E15 (Model 4), or 3383L20 (Mini-mill) | |
| anti-static bags | Minigrip* | MGST4P02503 | 2.5x3", multiple suppliers available |
| tin-coated copper wire | McMaster-Carr | 8871K84 | 0.016" diameter, bend-and-stay wire |
| tea-bags | Herbco | press n' brew teabags | 3.5x5 inches |
| gluco-amylase | Novozymes | Spirizyme Fuel | |
| alpha-amylase | Novozymes | Liquozyme SC DS | |
| sodium acetate trihydrate | any chemical supplier | reagent grade | |
| acetic acid | any chemical supplier | reagent grade | |
| 190 proof (95%) ethanol | any chemical supplier | reagent grade | |
| hoppers | Freeslate | ||
| 96-well C-276 Hastelloy plates | Aspen Machining (Lafayette, Colorado) | N/A (custom built) | |
| 1/8” soldering iron tip | Sears | ||
| silicone-adhesive backed Teflon tape | 3M | 5180 | 3" wide (36-yard rolls) |
| enzyme solution | Novozymes | Cellic CTec2 | |
| citric acid monohydrate | any chemical supplier | ||
| trisodium citrate dihydrate | any chemical supplier | ||
| disposable, polystyrene 96-well plates | Greiner Bio-One | 655101 | or equivalent; multiple suppliers available |
| glucose oxidase/peroxidase | Megazyme | K-Gluc | Megazyme D-glucose assay kit |
| xylose dehydrogenase | Megazyme | K-Xylose | Megazyme D-xylose assay kit |
| glucose standard solution | Megazyme | K-Gluc | Megazyme D-glucose assay kit |
| xylose standard solution | Megazyme | K-Xylose | Megazyme D-xylose assay kit |
| stainless steel sample cups | Frontier Laboratories | PY1-EC80F | |
| glass fiber sheets | Pall | 66227 | 8x10" sheets; circles punched with standard hole punch |
| Sugarcane Bagasse Whole Biomass Feedstock | NIST | 8491 | |
| Eastern Cottonwood (poplar) Whole Biomass Feedstock | NIST | 8492 | |
| Monterey Pine Whole Biomass Feedstock | NIST | 8493 | |
| Wheat Straw Whole Biomass Feedstock | NIST | 8494 |
References
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