Introduction
Da die weltweite Versorgung mit nicht-erneuerbaren Energieträger und die dazugehörigen Produkte sinkt, haben Wissenschaftler herausgefordert, ähnlichen Kraftstoffen und Chemikalien aus pflanzlichen Quellen 1 zu erstellen. Ein wichtiger Aspekt dieser Arbeit ist zu bestimmen, welche Arten von Pflanzen können für die Produktion von Biokraftstoffen und Biomaterialien 2,3 sein. Üblicherweise werden diese Einsatzstoffe für Lignin, Cellulose und Hemicellulose bewertet; sowie ihre Anfälligkeit für deconstruction (recalcitrance), durch thermische, mechanische und / oder chemische Vorbehandlung mit oder ohne anschließender Enzym Verzuckerung. Detailliertere Analysen werden verwendet, um die spezifische Zusammensetzung der Lignin und Hemicellulose-Fraktionen sowie eine optimale Enzymaktivitäten benötigt bestimmen. Transgene Modifikationen von Pflanzen, die nicht eigen Sie besitzen ideale Merkmale für biochemische oder thermochemische Umwandlung, um die gewünschten Rohstoffe haben die Forscher mit einer stark erweiterten Quelle Topf bereitgestelltzielle Ausgangsmaterialien 4. Die Standard-Analyseverfahren zum Quantifizieren der chemischen Eigenschaften einer Pflanze, während sehr nützlich für kleine Probenmengen, nicht geeignet sind für das schnelle Screening von Hunderten oder Tausenden von Proben 5-7. Die hierin beschriebenen HTP Methoden wurden entwickelt, um schnell und effizient auszuwerten zahlreiche Biomasse Varianten für Veränderungen in der Zellwand recalcitrance thermochemische und / oder enzymatischen Abbau.
Es ist wichtig zu verstehen, dass die hier beschriebenen HTP-Screening-Assays wurden nicht entwickelt, um Wandlungs- oder Ertrag zu maximieren. Das Ziel ist der relative Unterschied in der intrinsischen recalcitrance verwandter Biomasseproben zu bestimmen. Als Folge sind viele der Analyseschritte von den "typischen" Umwandlung von Biomasse-Assays, wo das Ziel ist es, maximale Conversion-Rate oder das Ausmaß zu erhalten, abweichen. Beispielsweise werden geringer Vorbehandlung severities und kürzere Enzymhydrolyse verwendet zu maximieren abweichenschiede zwischen den Proben. In den meisten Fällen relativ hohe Enzymbeladungen verwendet werden, um Unterschiede, die durch experimentelle Variation der Enzymaktivität, die die Ergebnisse erheblich verfälschen könnte reduzieren.
Schnelle Techniken zur Bestimmung der Zusammensetzung von Pflanzenzellwänden und den monomeren Zuckern freigesetzte folgenden enzymatischen Verzuckerung gehören Robotik, besonders angefertigt, thermochemisch kompatible 96-Well-Platten, und Modifikationen der Standard-Labormethoden 8-11 und Instrumental-Protokolle, wie Schwingungsspektroskopie (IR- (IR), im nahen Infrarotbereich (NIR) oder Raman) und magnetische Kernresonanz (NMR) 12-17. Diese Methoden sind der Schlüssel zur Isolierung von Ausgangsmaterialien mit hoher Cellulose oder niedrigen Ligningehalt, oder diejenigen erwartet, die höchsten Glucose, Xylose, Ethanol Ausbeute usw. Diese Methoden wurden heruntergerechnet Analysen, die kleinere Mengen an Biomasse und Verbrauchsmaterialien verwenden aktiviert, was zu einer Senkung der Versuchs Kosten 18 9, Pappel 8,10, Bagasse 8 und Switch 8 wurden erfolgreich unter Verwendung dieser HTP Verfahren bewertet.
Gesamt Lignin und Lignin Monomerzusammensetzung werden auch üblicherweise quantifiziert Biomasse Züge. Verringerungen der Ligningehalt haben gezeigt, dass die enzymatische Verdaubarkeit von Polysacchariden 19,20 erhöhen. Die Rolle, die das Lignin monomeren Verhältnis (oft als Syringyl / Guaiacyl (S / G) gemeldet) spielt in der Dekonstruktion der Pflanzenzellwand wird noch untersucht. Einige Berichte haben gezeigt, dass eine Verringerung des S / GQuote führte zu einer erhöhten Glucoseausbeuten nach der Hydrolyse 21, während andere Studien enthüllen den gegenläufigen Trend 19,22. Hochdurchsatz-Methoden zur Bewertung Lignin und seine Monomere sind Schwingungsspektroskopie (IR, NIR und Raman-23-26), die mit der multivariaten Analyse und Pyrolyse Molekularstrahl-Massenspektrometrie (pyMBMS) 27,28.
Bei der Entwicklung von HTP Verfahren zum Screenen von Biomasse müssen mehrere integrale Überlegungen im Auge gehalten werden. Ein wichtiger Aspekt ist die Komplexität des Verfahrens. Was ist die erforderliche Qualifikationsniveau für die Technik? Chemometrische Analysen zum Beispiel erfordern bestimmte Fähigkeiten für den Aufbau, Bewertung und Aufrechterhaltung der Vorhersagemodelle. Die Standardmethoden weisen unerwünschte Vor- oder Datenanalyseschritte oder beschäftigen toxischen Reagenzien. Entwicklung der Modelle ist ein laufender Prozess, wo neue Daten über die Zeit, um die Robustheit des Modells zu erhöhen in das Modell ein. Ein weiterer ConsIDmenarbeit ist die Kosteneinsparungen und verringerte experimentellen Analysezeiten der vorgeschlagenen Hochdurchsatzverfahren. Wenn die Methode ist sehr schnell, aber sehr teuer ist, kann es keine praktikable Methode für viele Labors, um anzunehmen. Die in dieser Handschrift dargestellten Verfahren sind Varianten von standardisierten Techniken modifiziert, um die Durchsatzfähigkeiten zu verstärken. Diese Protokolle quantitativ die Biomasse Merkmale von Interesse zu messen, ohne die Notwendigkeit der Entwicklung von Vorhersagemodellen. Dies ist ein Schlüsselattribut dieser Techniken, da Vorhersagemethoden, während sie eine starke Korrelationen mit den Standardanalysen verwendet, um die Modelle zu entwickeln, sind nicht so genau wie eigentlich Messung der Menge von Interesse für die Proben. Während die Verwendung von im wesentlichen nach unten Versionen von Standard-Labormaßstab Analysemethoden skaliert Verfahren werden Genauigkeit und Präzision für die Geschwindigkeit und Durchsatz gehandelt. Meist ist dieses Ergebnis aufgrund höherer Fehlern in kleinen Volumen Pipettieren und Wiegen; sowie erhöhte sreichliche Heterogenität als Stichprobengröße wird verringert. Während große Sample-Sets können gesiebt und verglichen werden, müssen große Sorgfalt, wenn Vergleiche zwischen den einzelnen Kampagnen und den Labormaßstab Ergebnisse ausgeübt werden.
Die zeitaufwendigsten Schritte erfordern die physikalische Manipulation der Biomasse. Schleifen Proben kann mehrere Minuten pro Probe, einschließlich Reinigung der Mühle zwischen den Proben zu nehmen. Manuelles Laden, Entladen und Reinigungstrichter und Befüllen und Entleeren Teebeutel und Probenbeutel ist auch sehr arbeitsintensiv. Während jeder Schritt kann eine Minute oder länger dauern kann dabei Tausende von Proben viele Stunden oder sogar Tage dauern. Die Roboter können eine typische Reaktorplatte mit Biomasse in etwa 3 bis 4 Stunden oder 6 bis 8 Platten Tag -1 Roboter laden -1. Diese Situation hängt von der Genauigkeit Parameter sowie der Art und der Menge an Biomasse zu prüfenden verwendet. Füllen Reaktorplatten mit Wasser, verdünnter Säure oder Enzym wird schnell mit einem Liquid-Handling-Roboters durchgeführt. PNachbehandlung von einem Plattenstapel (1 bis 20 Reaktorplatten) dauert zwischen 1 und 3 Stunden, wenn Montage, abkühlen und Demontage enthalten. Enzymhydrolyse dauert 3 Tage und die Zuckeranalyse benötigt etwa 1 Stunde Vorbereitungszeit plus 10 min pro Reaktorplatte, um den Test abzuschließen und lesen Sie die Ergebnisse. Ein Wochenplan gesetzt Vorbehandlung und Analyse Tage nimmt eine vernünftige Arbeitszeiten, ungerade Stunden und am Wochenende Anstrengungen für die menschliche Komponente des Assays zu minimieren und ermöglicht die Verarbeitung ~ 800 bis 1000 Proben pro Woche auf kontinuierlicher Basis. Der maximale Durchsatz von mehreren Faktoren abhängig, vor allem, wie viel Hardware (Roboter, Reaktoren Platten, etc.) und wie viel "Software" (dh Personal) stehen zur Verfügung, um die manuelle Arbeit zu tun. Die praktische obere Grenze ist 2500 bis 3000 Proben / Woche; erfordert jedoch, dass Ausgangs 7 Tage in der Woche Betrieb und mehrere Praktikanten und Techniker. Im Vergleich dazu würden 3.000 Proben mittels HPLC etwa 125 Tagen sam erforderlichB. Analyse plus die zusätzliche Arbeit der Hand mit einem Gewicht von Proben in Reaktoren und Filterproben vor der Analyse.
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Protocol
1. Hochdurchsatz-Bestimmung von Glucose und Xylose Renditen nach enzymatischer Verzuckerung 9,29
- Probenvorbereitung (Schleifen, De-starching, Gewinnung, Vorbehandlung)
- Schleifen mindestens 300 mg jeder Biomasse Probe unter Verwendung einer Wiley-Mühle, so daß die Teilchen durch ein 20 mesh passieren (850 um) Bildschirm. Transfer zum antistatischen zip-Top-Taschen (typischerweise Strichcode) und Plattenprobeninformationen zum Barcode-Datenbank.
- In etwa 250 mg oder mehr des Grund Biomasse aus antistatischen Beutel mit einem nummerierten (mit Bleistift, verwenden Sie keine Tinte oder Marker) Teebeutel vorsichtig rollen die Teebeutel, dass auf jeden Fall die Enden über die Biomasse zu falten, um zu verhindern, Verlust während de-starching und Extraktion.
- Wickeln Sie den Teebeutel geschlossen mit verzinnten Kupferdraht. Nehmen Sie den Teebeutel Nummer für jede Probe mit Strichcode.
- Vorbereitung de-Stärkeenzymlösung aus kommerziellen Enzyme (typischerweise 0,25% (v / v) Glucoamylase (~ 1.600 AGU / l) und1,5% (v / v) alpha-Amylase (~ 2.900 KNU-S / L) in 0,1 M Natriumacetat (pH 5,0)). Bereiten Sie 16 ml pro g des Groß Biomasse oder 500 ml pro 120 Teebeutel-Proben. Anmerkung: Die Beladungen entfernen kann Stärke aus irdische Biomasse sollte empirisch durch Testen der Stärke nach der Verdauung mit einer Reihe von Enzymbeladungen und Verhältnisse bestimmt werden.
- In einem Kunststoffbehälter, fügen Sie 16 ml de-Stärkeenzymlösung pro 1 g des Großirdischen Biomasse. Für eine Charge de-Appretur Protokoll hinzufügen 120 Teebeutel auf 500 ml der Puffer-Enzymlösung.
- Inkubieren in einem Schüttler bei 55 ° C für 24 (± 4) Stunden, bei 120 UpM auf mögliche Stärke zu entfernen.
- Nach der de-Stärke Inkubation spülen Sie und genießen die Biomasse in mehreren Litern entionisiertem Wasser für 30 Minuten. Wiederholen Sie diesen Vorgang zwei weitere Male, um Puffersalze, die Stöße (Bildung von Gasblasen in der Lösung, die in einer plötzlichen und heftigen Anstieg des Niveaus der Lösung führen kann, was zu heißen flüssigen Ethanol, um Kaskaden verursachen können, zu entfernenaus dem Reaktionsgefäß) während der Extraktion.
- Nach der Vollständigkeit Spülen der de-gestärkten Biomasse, legen Sie die Teebeutel in die Soxhlet-Säule für die Extraktion. Kein Kausche ist für diesen Schritt erforderlich.
- Einrichten der Soxhlet Reflux, mit 95% Ethanol und extrahieren Sie die Proben für 24 Stunden.
- Entfernen Sie die Teebeutel aus der Soxhlet-Reaktor und verteilt in einer einzigen Schicht auf einem flachen Fach.
- Man lässt die Proben über Nacht bei Raumtemperatur in einem Abzug trocknen.
- Rollen Sie die Teebeutel und gibt die getrocknete Biomasse zur Original barcodierte antistatischen Beuteln.
Hinweis: Die Anti-Statik-Taschen sind effizienter bei der Reduzierung statischer Elektrizität in der Biomasse, die Verbesserung der Fahreigenschaften. Wenn andere Speicheroptionen verwendet werden, können zusätzliche Biomasse aufgrund der Biomassefesthalten an der Seite des Vorratsbehälters erforderlich sein. - Übertragen mindestens 50 mg der getrockneten Biomasse mit einem Barcode versehene Trichter (unter Verwendung von mehr Material ist besser für eine genaue Abgabe). Skann Barcodes von den antistatischen Beuteln und dem Aufnahmetrichter, um genaue Probenverfolgung zu gewährleisten.
- Last Trichtern auf Feststoffe mit einem Gewicht von Roboter, aufmerksam auf die Reihenfolge der Proben in den Racks. Laden Sie genug Reaktorplatten, alle Proben enthalten und wählen Sie das Ausgabeprotokoll auf der Basis der Anzahl der Platten verwendet.
- Roboter wiegen 5 mg der getrockneten Proben (± 0,3 mg) in säurebeständigen Edelstahl-Platten mit 96 Vertiefungen. Abwiegen 3 Wiederholungen jeder Probe auf der Platte verteilt auf jede lokalisierte Variationen zu minimieren.
- Fügen 8 Steuer Biomasse Proben eines gut charakterisierten Biomasse Standard-Material, um die Assayleistung zu verfolgen. Für mehrere Platten, wird die Verwendung von mehreren Standard Biomasse Trichtern Teilchengröße Drift durch Sieben in den Trichtern über wiederholte Abgabezyklen zu minimieren.
Anmerkung: In jeder Platte, sollte 24 Proben mit 3 Wiederholungen, 4 Rohlinge bestehend aus deionisiertem Wasser und Enzym und 8 contro seinls, mit der zuvor gekennzeichnet Standard Biomasse. Die 3 Ecke Vertiefungen von jeder der 4 Ecken der Platte sind für die Zuckerstandards vorbehalten. - Überprüfen blank und Zucker Standard Brunnen für fehlerhafte Biomassepartikel und falls vorhanden entfernen.
- Fügen Sie 250 ul entionisiertem Wasser in jedes Loch, und verschließen Sie die Platten mit Silikon-selbstklebenden Polytetrafluorethylen (PTFE) Band.
- Unter Verwendung eines 1/8 "Lötkolbenspitze, durchbohren die PTFE-Band an jedem Dampfanschluss (117 gesamt) für jede Platte. Verwenden Sie eine leere Platte auf versiegelten Reaktorplatte als Führung gestapelt und zu beschränken, PTFE-Filmbewegung.
- Klemmen Sie die Platten fest mit 0,031 "dicken glasfaserverstärktem PTFE-Dichtungen (mit Löchern für Dampföffnungen vorgestanzt) zwischen den Platten und leere Teller auf Ober- und Unterseite des Stapels. Vorbehandlung der Proben mit einem Dampfreaktor auf 180 ° C für 17,5 min, oder eine andere Temperatur / Zeit-Kombinationen, basierend auf gewünschten Härte eingestellt.
- Kühlen Reaktorplatten bis 50 °; C durch Hochwasser mit VE-Wasser.
- Enzymatischen Verzuckerung
- Vorbereitung einer enzymatischen Verzuckerung Lösung, bestehend aus 8% (v / v) Enzym-Lösung in 1,0 M Natriumcitrat, pH 5.0. Bereiten Sie 5 ml pro Reaktorplatte. Hinweis: Die Verdünnung erforderlich sollte basierend auf Aktivität und Proteingehalt der spezifischen Aktienenzymlösung bestimmt werden.
- Wenn die Platten sind cool, zentrifugieren sie in einem Schwingbecher-Rotor bei 1.500 × g für 20 min. Entfernen Siegelfolie. Hinweis: Diese Platten sind schwer und die Zentrifuge Spezifikationen sollten auf Verträglichkeit überprüft werden.
- In 40 ul der 8% Enzymstammlösung in jede Vertiefung (70 mg Enzym pro g Biomasse).
- Verschließen Sie mit neuen PTFE-Band. Zeigen versiegelt Platte in Magnetplattenklemme.
- Vorsichtig mischen die Proben durch Inversion (mindestens 15-fach), und Inkubieren bei 50 ° C für 70 Std.
- Wenn die Verzuckerung zu dem Schluss gekommen, mischen durch Umdrehen und zentrifugieren Sie die Platten bei 1.500 xg für 20 min.
- Zucker Assay
- Einen Satz von 6 Glucose und Xylose kombinierten Kalibrierungsstandards in 0,014 M Citrat-Puffer (pH 5,0) von 0 bis 0,750 mg / ml (0, 0,2, 0,3, 0,45, 0,65 und 0,75 mg / ml empfohlen) und 0 bis 0,600 mg / ml (0, 0,1, 0,2, 0,35, 0,45 und 0,6 mg / ml empfohlen) für Glucose und Xylose sind.
- Bereiten Sie die Glucose-Oxidase / Peroxidase (GOPOD) und Xylose-Dehydrogenase (XDH) Reagenzien gemäß den Anweisungen im Kit.
- Mit einer Pipette zu entfernen 200 ul Flüssigkeit aus den 4 Ecken Brunnen und Rand Brunnen neben der Ecke Kavitäten (12 insgesamt Wells) der Reaktorplatte.
- Mit einer Pipette verzichtet werden 180 ul entionisiertem Wasser in jede Vertiefung einer 96-Well Polystyrol Flachboden-Verdünnungsplatte. Kein Wasser auf die 12 Zucker Standard und Ecke Brunnen nicht hinzufügen (entfernen Sie diese Tipps, wenn unter Verwendung eines 96-Kanal-Kopf).
- Verwendung eines Pipette jeweils 180 ul GOPOD in jede Vertiefung der Glucose-Assay plaß.
- Mit einer Pipette verzichtet werden 180 ul XDH Reagenz in jede Vertiefung der Xylose Assayplatte.
- Mit Hilfe einer Pipette 20 ul Aliquots Hydrolysat aus dem 96-Loch-Reaktorplatte auf der Verdünnungsplatte. Pipette aus dem oberen Teil der Vertiefungen zur Biomasse-Feststoffe und Restflüssigkeit in der Ecke Vertiefungen zu vermeiden. Mischen durch Verreiben für mindestens 10 Zyklen.
- Mit Hilfe einer Pipette 110 ul von Zucker-Standards, in zweifacher Ausfertigung an die Ecke Vertiefungen der Verdünnungsplatte.
- Mit Hilfe einer Pipette 20 ul Aliquots von der Verdünnungsplatte auf die Glucose und Xylose Assayplatten. Mischen Sie durch Verreiben.
- Inkubieren Glucose und Xylose Assay-Platten bei Raumtemperatur für 30 min. Keine Oberflächenblasen vorsichtig brechen vor dem Lesen. Ein kurz über die Oberfläche der Platte vergangen Heißluftpistole funktioniert gut.
- Verwendung eines UV / VIS-96-Well-Platten-Lesegerät, setzen Sie den gemessenen Wellenlänge um 510 nm und zeichnen Sie die Absorption gegen einen Reagenzienleer.Diese Messung überwacht die Bildung von Chinonimin, die proportional zur Glucosekonzentration ist. Die Glucosekonzentration wird aus der Eichkurve basierend auf den Kalibrierungsstandards in 1.3.1 hergestellten berechnet.
- Verwendung eines UV / VIS-96-Well-Platten-Lesegerät, setzen Sie den gemessenen Wellenlänge um 340 nm und zeichnen Sie die Absorption. Diese Messung überwacht die Reduktion von NAD + zu NADH, die proportional zur Xylose-Konzentration. Die Xylose-Konzentration von der Kalibrierungskurve auf Grundlage der Kalibrierungsstandards in 1.3.1 hergestellten berechnet.
2. Hochdurchsatz-Bestimmung von Gesamt Lignin und Lignin Monomere Inhalt Mit pyMBMS 28
- Probenvorbereitung
- Schleifen und extrahieren Sie die Biomasse unter Verwendung der in den Schritten 1.1.1 und 1.1.6-1.1.8 beschriebenen Methoden. Dazu gehören Mahlen und Extrahieren eines Satzes von Standards als experimentelle Kontrollen zu verwenden.
Hinweis: Die pyMBMS measurements nicht Teilchengröße abhängig, so dass, wenn nur mit dem pyMBMS Protokoll sollte Biomasse Herstellung durchgeführt, um damit die Probe in den Probenhalter 4 mm passen, <werden. - Mit einem kleinen Spatel Abgabe etwa 4 mg (3 bis 5 mg bevorzugt) der aufbereiteten Biomasse in eine 80 & mgr; Edelstahl-Tasse für den Autosampler entwickelt.
- Stellen Sie sicher, dass mindestens 10% der Proben, die analysiert werden Kontrollstandards, wie sie aus dem Nationalen Institut für Standards und Technologie zur Verfügung (Bagasse-8491; Pappel-8492; Pinien 8493 oder Weizenstroh-8494). Der Standard kann auch jede Spezies analog zu den zu analysierenden Proben, die bereits mit Standardmethoden charakterisiert haben.
- Die Proben in den Autosampler Becher mit einer Pinzette, um Verzerrungen zu vermeiden zufällig laden wegen möglicher Spektrometer Drift über die Zeit. Hinweis: Ein typisches Randomisierung der Proben würde die Messung aller Proben ein, gefolgt von einer Re-Randomisierung umfassender Reihenfolge der Proben, eine Zweitmessung. Randomisierung Programme sind online verfügbar.
- Mit einem Standard-Loch manuell Glasfilterscheiben zu produzieren von A / D-Glasfaser-Platten, ohne Bindemittel. Halten Sie die runde Glasfaserfilter mit einer Pinzette, zentrieren sie über den Probenbecher, und drücken Sie in die Probe mit einem 3,5 mm Innensechskantschlüssel, um das Material in jeder Tasse während des Experiments zu beschränken.
- Schleifen und extrahieren Sie die Biomasse unter Verwendung der in den Schritten 1.1.1 und 1.1.6-1.1.8 beschriebenen Methoden. Dazu gehören Mahlen und Extrahieren eines Satzes von Standards als experimentelle Kontrollen zu verwenden.
- Instrumental-Protokoll
- Kalibrieren des Massenspektrometers mit einem bekannten Standard, der Peakintensitäten über den gesamten Bereich von Verbindungen, die für die experimentellen Proben bestehen kann, hat. Für typische Biomasseproben verwenden Perfluortributylamin (PFTBA).
- Gesetzt den Heliumträgergasflussrate von 0,9 L / min mit einem Gasdurchflussmesser.
- Die Auto- sampler Ofen auf eine Pyrolysetemperatur von 500 ° C und die Grenzflächentemperatur auf 350 ° C unter Verwendung der Autosampler Software. Hinweis: Ein 1/8 "aus Edelstahl erwärmtÜbertragungsleitung in Wärmeband, das die Auto-Sampler zum Massenspektrometer verbindet wickelt wird unter Verwendung einer Wärmeregler bei 250 ° C geregelt.
- Beginnen Sie die Datenerfassung auf dem Massenspektrometer und warten Sie mindestens 60 Sekunden, um ausreichend Daten für die Hintergrundspektren Sammlung zu erhalten.
- Starten Sie den automatischen Autosampler-Methode mit den Spezifikationen von 2.2.2. Hinweis: Der Autosampler fällt jede Probe einzeln in den Autosampler Ofen. Die gesamte Datenerfassungszeit beträgt etwa 1,5 min; jedoch Pyrolyse eines typischen 4-mg-Probe nach 30 Sekunden abgeschlossen.
- Nehmen Gesamtionengehalt (TIC) von jeder Probe mit Massenspektrometer-Software mit 0,5 sec Abtastrate. Nehmen Intensitäten zwischen m / z 30 bis 450.
Hinweis: Typische Biomasse Verbindungen verwenden weiche Ionisierung bei 17 eV. Das Instrument kann größeren Abständen von m / z 1 bis 1000 aufzunehmen; jedoch wird Abtastrate von Computerrechenleistung begrenzt werden. - Entfernen Hintergrund aus den Spektren mit der maFeature Jahres zu verbessern in der Software. Anmerkung: Eine 60 abzutastenden Teil der Grundlinie zu Beginn der Datenerfassung verwendet, um eine durchschnittliche Hintergrundwert zu berechnen. Diese durchschnittliche Hintergrundspektren aus dem experimentellen Probenspektren automatisch im Massenspektrometer-Software entfernt.
- Importieren Sie die einzelnen Spalte Textdatei, die durch den Massenspektrometer-Software, die die spektralen Daten für jede Probe in ein Datenbankprogramm und vereinen alle Proben in einer Datenbank. In geltendem Metadaten in die Tabellenkalkulation. Importieren Sie die formatierte Daten (Tabellenkalkulationsdatei / CSV) in eine Statistik-Software-Paket und bedeuten Normalisierung der Spektren für die Variation in den pyrolysierten Probe Massen zu berücksichtigen.
- Verwenden Sie eine Statistik-Software-Paket, um eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) mit Hilfe der spektralen Daten zur Gruppierung der replizierten Standardproben in den Messungen verwendet analysieren zuführen sowie zu beurteilen, welche Spitzen integral für die Einstufung chemischer sindVerbindungen in den Ladungsplot 28.
Anmerkung: PCA-Gruppen der Proben auf der Basis der Ähnlichkeit ihrer Spektren, und ermöglicht eine Überprüfung der Normen auf experimentelle Fehler aufgrund von Instrumentendrift während des Laufs zu messen. - Um das Lignin Syringyl (S) / Guaiacyl (G-Verhältnis) zu berechnen, summieren die Bereiche der S Peaks (m / z = 154, 167, 168, 182, 194, 208 und 210) und dividiert durch die Summe von g Peaks bei 124, 137, 138, 150, 164 und 178.
- Um die Gesamt Ligningehalt zu berechnen, summiere die Lignin Peaks mit m / z = 120, 124, 137, 138, 150, 152, 154, 164, 167, 178, 180, 182, 194 und 210.
- Berechnen eines Korrekturfaktors für die Skalierung des pyMBMS Messung einer Standardmethode zur Schätzung der Gesamt Lignin, wie Klason Lignin. Teilen Sie die Klason Lignin Wert der einzelnen Standard durch die Gesamt Ligningehalt für die Standardprobe mit pyMBMS gemessen.
- Wenden Sie diesen Korrekturfaktor für alle Gleich Arten im Datensatz. Wiederholen für jede Art von Biomasse analysiert. NAnmerkung: Der Korrekturfaktor kann wesentlich von der S / G der Biomasse analysiert variieren.
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Representative Results
Der kombinierte Effekt der thermochemischen Vorbehandlung und anschließende Enzym Verzuckerung wird als Funktion der Masse der Glucose und Xylose am Ende des Tests gemessen und errechnet. Die Ergebnisse sind in der Einheit Milligramm von Glucose und Xylose pro Gramm Biomasse frei gemeldet. Dies steht in krassem Gegensatz zu den Daten aus Labormaßstab Assays, die üblicherweise als prozentuale theoretische Ausbeute, bezogen auf die Zusammensetzungs-Analyse des Ausgangsmaterials gemeldet wird, gemeldet. Da es noch nicht praktisch, auf Tausenden von Proben pro Woche durchzuführen Zusammensetzungsanalyse werden die Daten am besten als Umwandlungsniveaus auf Massenbasis ausgewiesen. Dies ermöglicht eine angemessene Probenauswertung solange die Vergleiche zwischen eng verwandten Proben von Biomasse und die Zusammensetzung der Proben, dieses nicht zu stark schwanken.
Das primäre Ziel des Tests ist es, die relativen Unterschiede der Widerstand der Pflanzenzellwand zu kombinieren thermo / enzym evaluierenatic Verzuckerung in einer Reihe von einzelnen Varianten. Es ist erwähnenswert, dass der Test versucht nicht, einen der für die Verzuckerung verwendeten Bedingungen zu optimieren. In der Tat sind die Vorbehandlung Schwere Bedingungen, um die Empfindlichkeit des Assays zu erweitern, zielt auf eine endgültige Umwandlungsausbeute von 50% bis 70% der theoretischen deutlich suboptimal. Vorbehandlungsbedingungen bei oder nahe optimale würden alle Proben eine hohe Umwandlung zu schieben, den dynamischen Bereich des Assays stark verengt. Umgekehrt ist die Enzymbeladung viel größer als die in der Regel für Labormaßstab Verdauungen gemeldet. Wiederum ist es das Ziel des Verfahrens nicht auf die beste Enzym finden oder das Enzym die Kosten zu minimieren, aber die intrinsische recalcitrance der Zellwände, um die Umwandlung zu messen und unter Verwendung von sehr hohen Enzymbeladungen entfernt Variabilität des Assays.
Schließlich ist es wichtig zu verstehen, dass die Variabilität in der Gesamt Assay ist erheblich höher als die für benc gemeldeth angelegte Arbeit. Typische Standardfehler sind rund 8%, obwohl die Palette ist viel breiter. Das ist einfach die Art von kleinen, HTP Forschung. Pipettieren und mit einem Gewicht von Fehler sind an der ul und mg Skala proportional höher, ebenso wie Verdampfungsverluste und Kondensation. Biomasse Heterogenität wird eine sehr große Variable bei der Bestimmung von mehreren Größenordnungen weniger Teilchen in jeder Probe, dh 5 mg vs. multiple g. Die kolorimetrische Assays verwendet werden, um festzustellen, Glucose und Xylose korrelieren gut mit HPLC-Ergebnisse; Während jedoch enzymgekoppelte Tests zur Zuckeranalyse schnell und kann parallel durchgeführt werden, sind sie nicht so präzise wie analytische Methoden wie HPLC, Einführen einer anderen Schicht der Ungenauigkeit (Abbildung 1).
Aufgrund all dieser Erwägungen sollten Ergebnisse nur interpretiert und innerhalb bestimmter Grenzen zu melden. Die Daten sind in ganze Sätze, nicht als Einzelproben untersucht werden. Wiederholungen sind für mea erforderlichkräftige Ergebnisse. Trends und Ausreißer sind sinnvoll, aber Einzelergebnisse nicht. Vergleiche werden am besten im Einzelexperimentierkästen gefertigt. Vergleiche über zeitlich oder räumlich getrennte Kampagnen erfordern extrem strenge Kontrollen und sorgfältige Prüfung sinnvoll zu sein. HTP-Daten nicht direkt vergleichbar Benchmarks oder andere angelegten Daten. Trends verfolgen zwischen HTP und andere Skalen, aber direkte Probenvergleiche nicht identische Ergebnisse.
Datendarstellung fällt typischerweise in Trends, Ausreißer oder Subpopulation / Variantenvergleiche. Ein Beispiel für Trends ist eine Befragung der Widerspenstigkeit von 755 natürlichen Varianten von Pappeln über einen weiten Bereich im pazifischen Nordwesten der Vereinigten Staaten 19 abgetastet. Die recalcitrance dieser Proben wurde gegen ihren Ligningehalt und Syringyl / Guaiacyl Verhältnis aufgetragen, wie durch pyMBMS bestimmt. Die Ergebnisse zeigen, dass S / G ansteigt, bis ein S / G-Verhältnis von etwa 2, wobei das recalcitrance impr abnimmt recalcitranceovement stark an (Figur 2). Ausreißer ist deutlich in 3 gezeigt, wo die Pt4CL1 Gen wurde aus Pappelherunterreguliert gesehen werden. Mehrere hundert Sorten wurden gesiebt, und mehrere sind klar in recalcitrance erhöht, wie durch die verringerte Zuckerfreisetzung zeigt. 4 zeigt eine Untersuchung, bei der verschiedene Weizenstroh Sorten wurden auf mehrere Sehenswürdigkeiten über zwei Jahren und Ernte nach verschiedenen Variationen in den Wachstumsbedingungen gewachsen , was in 20 unterschiedliche Populationen basierend auf Kombinationen der obigen Variablen. Diese Probensätze sind leicht zu unterscheiden und angeben, positiven und negativen Variablen für Widerspenstigkeit. 5 zeigt, wie pyMBMS kann verwendet werden, um Veränderungen in der Zellwandzusammensetzung zu bewerten. Massenspektraldaten Fragmente in verschiedenen Lignin-Monomeren (Tabelle 1) zugeordnet. Beim Vergleich einer Probe mit hohem Ligningehalt vs. hohen Kohlenhydratanteil, sind die Unterschiede in den spektralen Daten ersichtlich. Ter pyMBMS Daten, gekoppelt mit einer Hauptkomponentenanalyse (PCA) ist in 6 dargestellt zu verwenden. In diesem Beispiel werden die Proben entsprechend niedriger oder hoher Stickstoffdüngung eingestuft. Lignin und Kohlenhydrat-Inhalt ausrichten umgekehrt entlang PC1. Die Verwendung der Hauptkomponentenladungen Grundstück kann bei der Identifizierung, welche chemischen Merkmale werden in den Partituren Klassifizierung Grundstück sowie erhellenden die Merkmale ändern sich zwischen den Proben Clustern erklärt unterstützen.
Figur 1: Vergleich von Glucose und Xylose Quantifizierung mittels Hochdurchsatz-kolorimetrische Assays vs. HPLC 9. Vergleich von Glucose und Xylose Detektion erfolgte mit Xylose-Dehydrogenase (XDH, oberes Feld) und Glucoseoxidase / Peroxidase (GOPOD, unteres Feld) mit hohem Durchsatz kolorimetrische Enzym-gekoppelten Assays und Hochleistungs l durchBeläge auf LCD-Chromatographie.
Figur 2: recalcitrance Pappelzellwände in Abhängigkeit von Syringyl zu Guaiacyl (S / G) -Gehalt im Lignin 9 Erhöhung der recalcitrance Pappelzellwände in Abhängigkeit von Syringyl zu Guaiacyl (S / G) -Gehalt im Ligninfraktion hat. wurde beobachtet und berichtet werden. 755 Pappel Kernproben aus dem gleichen Pappel Sorte wurden über mehrere hundert Meilen des Waldes in der nordamerikanischen Pacific Northwest übernommen und für Glucose und Xylose Freisetzung nach thermochemische Vorbehandlung gescreent und Enzym Verzuckerung. Die Ergebnisse wurden mit den S / G-Verhältnis in der Zellwand Lignin aufgetragen, wie durch pyMBMS bestimmt. Recalcitrance nimmt mit zunehmendem S / G bis etwa 2, wo es bei höheren S / G konstant bleibt. Theoretische Ausbeute Werte werden auf der BESC "standard" Pappel und werden als referen bereitgestelltce zum Vergleich.
Abb. 3: Widerspenstigkeit in herunterreguliert Pt4CL1 Ausdruck in Pappelherunterregulierung des Pt4CL1 Gens in Pappel führte zu wenig Variation in der Zellwand Widerspenstigkeit zwischen Klonen jedoch mehrere drastisch erhöht Widerspenstigkeit Varianten sind leicht zu erkennen. Bitte klicken Sie hier ein, um zu vergrößern Version dieser Figur.
Abbildung 4: Widerspenstigkeit in verschiedenen Populationen Wheat Die Auswirkungen des Sortentyp, Ort der Anbau, Düngung, Bewässerung und Rate ergeben sich deutlich Widerspenstigkeit Ebenen.. Verschiedene Symbole differe vertretennt experimentellen Wachstumsbedingungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abb. 5: Die Anwendung der pyMBMS für die Analyse von chemischen Veränderungen in der Pflanzenzellwänden 28. Die mit Pfeilen bezeichneten Peaks sind Ligninfragmente und wurden verwendet, um (a) Hoch Lignin (b) mittel Lignin oder (c) niedriger Ligningehalt zu bewerten.
Abb. 6: Hauptkomponentenanalyse Wertediagramm von Unterschieden in der Zellwand Chemie der bevölkerungsreichen Bäumen mit höheren und niedrigeren Befruchtungsraten 28 gewachsen (Top) HauptkomponentenanalyseWertediagramm, welches eine eindeutige Klassifizierung und daher Unterschiede in der Zellwand Chemie der bevölkerungsreichen Bäumen mit höheren und niedrigeren Befruchtungsraten gewachsen. Hauptkomponente 1 verteilt die Proben auf Basis von höheren Lignin (negativ) oder höher Kohlenhydrat (positiv) Inhalte. (Seitenende) Die Hauptkomponentenladungen aufzuklären, welche chemischen Komponenten zwischen den beiden Gruppen von Proben in der Wertediagramm ändern. Die positiven Belastungen korrelieren mit der positiven Ergebnisse, die Vertreter der höheren Kohlenhydrat Inhalt, während negativ korreliert Belastungen auszurichten mit negativen Punktzahlen und daher höheren Ligningehalt.
| m / z | Molekulare Belegung 30 | S / G / H Zuordnung |
| 94 | Phenol | S / G / H |
| 120 | Vinylphenol | H |
| 124 | Guajakol | G |
| 137 | Ethylguaiacol, homovanillin, Coniferylalkohol | G |
| 138 | Methylguajacol | G |
| 150 | Vinylguajacol | G |
| 154 | Syringol | S |
| 164 | Allyl- + propenyl Guajakol | G |
| 167 | Ethylsyringol, syringylacetone, propiosyringone | S |
| 168 | 4-Methyl-2,6-dimethoxyphenol | S |
| 178 | Coniferylaldehyd | G |
| 180 | Coniferylalkohol, syringylethene | S, G |
| 182 | Syringaldehyd | S |
| 194 | S | |
| 208 | Sinapylaldehyde | S |
| 210 | Sinapylalcohol | S |
Tabelle 1:. Haupt m / z und Zuweisungen für Lignin abgeleitete Pyrolyse Fragmente durch Massenspektrometrie detektiert Liste von typischen Verbindungen, die durch pyMBMS detektiert. Molekularzuweisungen auf der Grundlage Evans, RJ und TA Milne (1987). Molekulare Charakterisierung der Pyrolyse von Biomasse Energie und Kraftstoffe 1 (2):. 123-137.
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Discussion
Die wichtigsten Schritte der Probenvorbereitung für den Erhalt von genauen und reproduzierbaren Daten bei der Durchführung von Hochdurchsatz-Screening-Versuche sind wie folgt:
Zucker Release Assay:
Im Allgemeinen werden die Proben in Lose von wenigen Dutzend bis zu mehreren Tausend zu einem Zeitpunkt hergestellt. Jedem Hauptschritt wird typischerweise für alle Proben vor, um Schwankungen in der Zubereitung zwischen Proben zu minimieren Vorwärtsbewegung durchgeführt. De-starching ursprünglich nicht Teil des Protokolls und kann in bestimmten Fällen verzichtet werden. Holzkernproben und alterten krautige Materialien sind in Stärke konstant niedrig und daher benötigen keine De-Stärke, um die Variabilität zu reduzieren. Stärke ist ein wichtiges Anliegen; jedoch in Sample-Sets von grünen Gewebe Pflanzen, vor allem für große Probenmengen, wo Ernte über mehrere Stunden stattfindet. Wie Stärke Spiegel steigen während der Tagesstunden und werden bei Dunkelheit aufgebraucht ist, können Stärkepegel deutlich über s variierenehrere h und Glucose aus Stärke ist nicht von Glucose aus Cellulose, also hohen Stärkepegel können zu verzerrt niedrigen Widerspenstigkeit Messungen führen. Die eigentliche Enzymbeladung in der Stärkeentfernungsschritt eine geringere Sorge, solange es genügend überschüssige Aktivität, um alle zugänglichen Stärke innerhalb des Zeitrahmens der Stärkehydrolyse Schritt zu entfernen. Variationen in den spezifischen Enzymen verwendet, Zeit, Temperatur, Volumen und Bewegungsgeschwindigkeit des Stärkeentfernungsschritt kann sicherlich auf Unterschiede in Stärkeentfernungsstufen und Preise führen und sollte, wenn möglich, empirisch bestimmt werden. Schließlich, wenn das Einwickeln der Teebeutel für die Extraktion verwenden verzinnten Kupferdraht. Blanken Kupferdraht können unerwünschte chemische Reaktionen mit der Enzymlösung verursachen, Falschzuckerwerte. Verzinnten Kupfer behoben dieses Problem während Edelstahldraht nicht formbar genug, um die Teebeutel dicht geschlossen halten.
Konsequente Zerkleinerung von Biomasse ist entscheidend für den AkkuFrequenzdaten aus zwei Gründen: 1) fein gemahlene Biomasse, während leichter und konsequent verzichtet wird, ist es leichter verdaulich als gröberes Material. 2) Biomasse, die zu grob ist können die Trichter verstopfen, was zu einer unzureichenden Stoffe oder, wenn die Verstopfung nur teilweise die Öffnung blockiert, kann es als ein Sieb Feinteilchen durch wirken und nur zu erlauben, Senkung der beobachteten recalcitrance der Probe. Wenn zu wenig Biomasse wird in den Vorratsbehältern enthalten sind, beschichten sie die Seiten des Trichters, wodurch der Roboter in den Trichter nehmen leer ist und die Probe in dem Abgabevorgang übersprungen werden. Zusätzlich können geringe Mengen an Biomasse trieben Probe Heterogenität beitragen, zumal dichteren Teilchen (wie Schwarten) dazu neigen, auf den Boden des Konus und dem ersten Sieb abgegeben zu werden. Wenn sie weniger als 50 mg an Material zur Verfügung steht, kann der Assay noch durchgeführt werden kann; jedoch sollten die Proben von Hand wiegen. Allerdings sind die Ergebnisse der Hand mit einem Gewicht von variabler als solche aus robOhr Wiegen.
Die tatsächliche Menge an Biomasse für den vorbereitenden Schritten erforderlich ist nicht gut definiert. Wir haben 250 mg als eine vernünftige Ausgangspunkt vorgeschlagen, weist jedoch jede Biomasse Probe unterschiedliche Eigenschaften in Bezug auf Verluste aufgrund von Handling, Schleifen, und Extrahieren sowie als oben in den Trichter gehalten oder wird reproduzierbar dosiert. Die Heterogenität der Biomasse über Arten und sogar innerhalb der gleichen Art schließt ein definiertes Protokoll. Diejenigen, die diese Testverfahren zu implementieren müssen einfach viele dieser Variablen selbst zu bestimmen, auch wenn Erfahrung macht es leichter machen.
Ein weiterer Schritt, der Fehler einführen kann, wird das Mischen in Mikrotiterplatten, die bekanntermaßen schwierig ist, und ist entscheidend für diese Assays aus mehreren Gründen. Die verwendete Enzymlösung wird eingeengt und kann nach Zugabe zu den Vertiefungen geschichtet, bestimmende Enzym Zugänglichkeit zur Biomasse. Wie Verzuckerung Erlöse, die sugars Freigabe kann auch zu schichten und konzentrieren sich in der Nähe der Biomasse und in Abhängigkeit von der Probentiefe kann Zucker Assays künstlich hoch oder niedrig sein. Deshalb ist es wichtig, Proben nach der Enzymzugabe und Enzym Verzuckerung zu mischen, so dass ein gründliches Mischen der Enzyme mit der Biomasse sogar Verzuckerung und gleichmäßige Verteilung der resultierenden Zucker zu konsistente Zuckeranalyse ermöglichen. In Platten, die Biomasse enthalten, wie Verdünnung oder Testplatten, Misch durch wiederholtes Pipettieren (Verreibung) hat sich als weit überlegen, als schüttelte sein. Aber als Lösungen in diesem Protokoll unterschiedlicher Dichte und Partikelgehalt, Pipettiergeschwindigkeit und vertikalen Lage Spitze der Flüssigkeitssäule ist kritisch. Wenn die Geschwindigkeit zu schnell ist, schlechte Genauigkeit durch Kavitation (Aspiration) und Flüssigkeitsretention in der Spitze (Abgabe) kommen. Wenn die Spitze zu tief in der gut ist, kann Biomasse die Spitze verstopfen oder die Spitze kann nach unten gedrückt werden, verhindert genaue Aspiration, und esmehr äußere Oberfläche für Flüssigkeit, die Verschleppung und zum nächsten Schritt zu klammern. Das letztere Problem kann etwas durch Steuer die Spitze Abzugsgeschwindigkeit verringert werden, da langsamer Spitzenentfernung kann Flüssigkeit in die Gesamtlösung durch die Oberflächenspannung entfernt werden. Wenn Spitze Rückzug zu langsam ist, kann pipettiert Flüssigkeit zurück in die Hauptlösung als auch kriechen. Biomassepartikel haben auch eine Tendenz, sich an den Spitzen zu klammern und sich auf der Verdünnungsplatte, wo sie während des Mischens oder Übertragung an den Testplatten der Spitze verstopfen übertragen, wodurch Ungenauigkeiten in Probenvolumen analysiert. Diese Partikel können auch mit der spektroskopischen Analyse der Assayplatten behindern, falls sie den Lichtstrahl während des Lesens zu verschließen.
Konsistente Farbentwicklung Timing ist entscheidend für GOPOD und XDH-Assays. Die Farbentwicklung muss bis zur Vollendung zu gehen; Allerdings neigt der GOPOD Assay Farb weiter steigen nach der Fertigstellung und dem von der XDH Assay erzeugten NADH langsamabnimmt aufgrund einer spontanen Oxidation des NADH. Als Ergebnis Zeitvariabilität kann zu inkonsistenten Vergleiche von Daten zwischen getrennten Platten führen. Die Assay-Schritte sollten sorgfältig überwacht werden, da Stillstände aufgrund von Hardware- oder Software-Probleme können zu großen Unterschieden bei den Testzeiten führen. Die Verwendung von Zucker Standards und Standard Biomasse Kontrollvertiefungen in jeder Platte kann helfen, zu lindern diese zu einem gewissen Grad.
PyMBMS:
Standards müssen sorgfältig für pyMBMS Experimente betrachtet werden zum Vergleich mit Standard-nasschemischen Verfahren. Aufgrund der unterschiedlichen Ligninzusammensetzung (S / G-Verhältnisse) von Biomassearten, ist der Korrekturfaktor anhand einer repräsentativen Standard, der gleichen Spezies wie der experimentellen Probe bestimmt werden. Wenn es keine entsprechende Norm verfügbar ist, können Unterschiede in der Ligninkonzentration mit den Intensitäten der Lignin-Vorläufer direkt miteinander verglichen werden. Hohe S / G-Verhältnisse (über ~ 3,5) kann zu einer Überschätzung der l führenignin Gehalt von pyMBMS. Dies wird durch die Neigung hervorgerufen Lignin S um bevorzugt unter Standardbedingungen in diesem Verfahren verwendet wird freigegeben. Darüber hinaus ist die Menge an Probe für pyMBMS Messungen erforderlich ist, hängt von der Art der eingesetzten Biomasse. Isolated Lignin und Lignin-Modellverbindungen benötigen weniger Material (0,1 mg), wie mit größeren Aliquots der Probe kann der Detektor sättigen.
Ein weiterer wichtiger Schritt in der PyMBMS Prozess ist eine sorgfältige Abstimmung des Instruments mit einem bekannten Standard, wie Perfluortributylamin (PFTBA) vor jedem Experiment. PFTBA enthält Molekülpeaks über das gesamte Spektrum der typischen Biomasse und ermöglicht daher einheitliche Instrument Abstimmung zwischen Versuchsdurchläufe. Der mittlere Bereich des PFTBA Spektren so abgestimmt ist, dass m / z 131 und m / z 219 sind ungefähr 50% der Intensität von m / z 69. Diese Abstimmung wird zur typischen Peaks unter weiche Ionisation gesehen betonen (17 eV) verwendet, um die Fragmentierung von Ionen niedriger Masse zu minimieren, dass c annot leicht identifiziert werden.
Es sollte beachtet werden, dass diese Methoden nicht Analysenmethoden zur genauen Quantifizierung von interessierenden Analyten ist. Vielmehr sind diese High-Throughput-Techniken für das Screening von großen Biomasse setzt, um solche, die über die gewünschten chemischen Merkmale zu identifizieren. Diese Methoden nur für Screening, ordnen, und die Korrelation der Abtastwerte innerhalb eines Datensatzes verwendet werden. Datensätze können nicht direkt miteinander verglichen, wenn an verschiedenen Tagen durch Variationsquellen wie Instrumentendrift, Veränderungen in der Enzymaktivität, der Umgebungsfeuchte in der Biomasse gesammelt werden aufgrund von Änderungen der Feuchtigkeit, Temperaturschwankungen und Differenzen in den Spitzen und die Absorption Platte Lose . Zusätzlich wird die Vorbehandlung in dem Probenvorbereitungsprotokoll verwendet wird, nicht eine optimierte Vorbehandlungsstrategie, sondern wurde speziell entwickelt, um suboptimal. Dies ermöglicht es feine Unterschiede zwischen den Pflanzen, effizienter erläutert.
jove_content "> Der Hauptvorteil der Annahme Hochdurchsatzverfahren ist, dass viele weitere Proben in der gleichen Zeit 18 gemessen werden. Zum Beispiel kann ein übliches Verfahren zur Analyse von Kohlenhydraten während eines sauren oder enzymatischen Verzuckerung Produkten ist der Einsatz von Hochleistungs Flüssigkeitschromatographie (HPLC). Selig et al., Zustand, dass das ubiquitäre zweistufige Säurehydrolyse, obgleich sehr nützlich und ausschlaggebend für die Quantifizierung von Struktur Kohlenhydrate, begrenzt die Forscher in der Lage, etwa 25 Proben pro Woche 9 bewerten. Während der analytischen Instrumentierung in Hochdurchsatz-Methoden verwendet möglicherweise nicht die Empfindlichkeit eines Standardtechnik wie HPLC, bietet die schnelle Analyse Forscher den Luxus, in der Lage, große Mengen an Proben zu bewerten. Darüber hinaus sind die Hochdurchsatzmethoden haben oft experimentelle Protokolle heruntergerechnet, Reduzierung der Verwendung von Verbrauchsmaterialien, und daher abnehmende experimentelle Kosten und Abfall.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biomek FX Automated Workstation | Beckman Coulter | Biomek FX | Automated Liquid Handler |
| Wiley mill | Thomas Scientific | 3375E15 (Model 4), or 3383L20 (Mini-mill) | |
| anti-static bags | Minigrip* | MGST4P02503 | 2.5x3", multiple suppliers available |
| tin-coated copper wire | McMaster-Carr | 8871K84 | 0.016" diameter, bend-and-stay wire |
| tea-bags | Herbco | press n' brew teabags | 3.5x5 inches |
| gluco-amylase | Novozymes | Spirizyme Fuel | |
| alpha-amylase | Novozymes | Liquozyme SC DS | |
| sodium acetate trihydrate | any chemical supplier | reagent grade | |
| acetic acid | any chemical supplier | reagent grade | |
| 190 proof (95%) ethanol | any chemical supplier | reagent grade | |
| hoppers | Freeslate | ||
| 96-well C-276 Hastelloy plates | Aspen Machining (Lafayette, Colorado) | N/A (custom built) | |
| 1/8” soldering iron tip | Sears | ||
| silicone-adhesive backed Teflon tape | 3M | 5180 | 3" wide (36-yard rolls) |
| enzyme solution | Novozymes | Cellic CTec2 | |
| citric acid monohydrate | any chemical supplier | ||
| trisodium citrate dihydrate | any chemical supplier | ||
| disposable, polystyrene 96-well plates | Greiner Bio-One | 655101 | or equivalent; multiple suppliers available |
| glucose oxidase/peroxidase | Megazyme | K-Gluc | Megazyme D-glucose assay kit |
| xylose dehydrogenase | Megazyme | K-Xylose | Megazyme D-xylose assay kit |
| glucose standard solution | Megazyme | K-Gluc | Megazyme D-glucose assay kit |
| xylose standard solution | Megazyme | K-Xylose | Megazyme D-xylose assay kit |
| stainless steel sample cups | Frontier Laboratories | PY1-EC80F | |
| glass fiber sheets | Pall | 66227 | 8x10" sheets; circles punched with standard hole punch |
| Sugarcane Bagasse Whole Biomass Feedstock | NIST | 8491 | |
| Eastern Cottonwood (poplar) Whole Biomass Feedstock | NIST | 8492 | |
| Monterey Pine Whole Biomass Feedstock | NIST | 8493 | |
| Wheat Straw Whole Biomass Feedstock | NIST | 8494 |
References
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