Introduction
Como a oferta global de combustíveis não renováveis e os seus associados produtos declínios, os cientistas foram desafiados a criar combustíveis e produtos químicos similares a partir de fontes de origem vegetal 1. Um aspecto importante deste trabalho é determinar que espécies de plantas podem ser adequados para a produção de biocombustíveis e biomateriais 2,3. Tipicamente, estas matérias-primas são avaliadas para a lenhina, celulose, hemicelulose e conteúdo; bem como a sua susceptibilidade à desconstrução (recalcitrante) através de pré-tratamento térmico, mecânico e / ou químico, com ou sem subsequente sacarificação enzimática. Análises mais detalhadas são utilizados para determinar a composição específica das fracções de lignina e hemicelulose, bem como actividades enzimáticas óptimas necessário. Modificações transgênicas de plantas que não intrinsecamente possuem características ideais para a conversão bioquímica ou termoquímica a commodities desejados forneceram os investigadores com uma fonte de grande expansão de maconhacial matérias-primas 4. Os métodos analíticos padrão para quantificar as características químicas de uma planta, ao mesmo tempo bastante útil para pequenos conjuntos de amostras, não são adequadas para a pesquisa rápida de centenas ou milhares de amostras 5-7. Os métodos aqui descritos HTP foram desenvolvidas para avaliar rapidamente e com eficiência um grande número de variantes de biomassa para alterações na parede celular recalcitrante à degradação termoquímico e / ou enzimático.
É fundamental compreender que os testes de rastreio HTP aqui descritos não foram concebidos para maximizar a conversão ou o rendimento. O objetivo é determinar as diferenças relativas na recalcitrância intrínseca de amostras de biomassa. Como resultado, muitas das etapas de análise são diferentes dos "típicos" ensaios de conversão da biomassa, onde o objetivo é obter a taxa de conversão máxima ou extensão. Por exemplo, inferiores gravidades de pré-tratamento e tempos mais curtos de hidrólise enzimática são usadas para maximizar diferemcias entre as amostras. Na maioria dos casos, cargas relativamente elevadas de enzimas são usados para reduzir as diferenças devidas à variação experimental da actividade da enzima, o que poderia distorcer os resultados significativamente.
Técnicas rápidas para determinar a composição de plantas de células-paredes e os açúcares monoméricos libertado seguinte sacarificação enzimática incluem robótica, personalizado, placas de 96 poços termoquimicamente compatíveis, e modificações de métodos laboratoriais padrão 8-11 e protocolos instrumentais, como a espectroscopia vibracional (infravermelho (IV), no infravermelho próximo (NIR), ou de Raman) e de ressonância magnética nuclear (RMN) 12-17. Estas metodologias são a chave para o isolamento de matérias-primas com alta de celulose ou de baixo teor de lignina, ou aqueles esperado para produzir a mais elevada de glicose, xilose, etanol, etc. Estes métodos permitiram análises downscaled que empregam menores quantidades de biomassa e produtos de consumo, levando a reduções nos experimental custa 18 9, álamo 8,10, bagaço de cana 8, e switchgrass 8 foram avaliadas com sucesso usando esses métodos HTP.
Lignina total e composição monomérica lignina também são comumente quantificada traços de biomassa. As reduções no teor de lenhina foram mostrados para aumentar a digestibilidade enzimática de polissacarídeos 19,20. O papel que a razão monomérica lignina (muitas vezes relatadas como siringil / guaiacil (S / G)) desempenha na desconstrução da parede celular da planta ainda está sob investigação. Alguns relatórios indicaram que as reduções no S / Grácio levou a rendimentos aumentados de glicose após hidrólise 21, enquanto outros estudos revelam a tendência oposta 19,22. Métodos de alto rendimento para avaliar a lignina e seus monômeros incluem espectroscopia vibracional (IR, NIR e Raman 23-26) juntamente com a análise multivariada, pirólise e espectrometria de massa de feixe molecular (pyMBMS) 27,28.
Ao desenvolver métodos HTP para o rastreio de biomassa, várias considerações integrais precisam ser mantidos em mente. Um aspecto chave é a complexidade do método. Qual é o nível de habilidade necessária para a técnica? Análises quimiométricas, por exemplo, exigem habilidades específicas para a construção, avaliação e manutenção de modelos preditivos. Os métodos padrão de análise exibem passos preparatórios ou dados indesejáveis ou empregar reagentes tóxicos. Desenvolvimento dos modelos é um processo contínuo em que os novos dados são incorporados no modelo ao longo do tempo para aumentar a robustez do modelo. Outra consideperação é a redução de custos e diminuição do tempo de análise dos métodos experimentais de alto rendimento propostas. Se o método é bastante rápida, mas muito dispendioso, não pode ser uma técnica viável para muitos laboratórios a adoptar. Os métodos ilustrados neste manuscrito são variantes técnicas padronizadas, modificados para amplificar as capacidades de rendimento. Estes protocolos medir quantitativamente os traços de biomassa de interesse sem que seja necessário o desenvolvimento de modelos preditivos. Este é um atributo-chave destas técnicas, uma vez que os métodos preditivos, enquanto exibem fortes correlações com o padrão análises utilizados para desenvolver os modelos, não são tão precisos como realmente medir a quantidade de interesse para as amostras. Considerando que os métodos utilizados são essencialmente reduzida versões de métodos analíticos em escala de bancada padrão, exatidão e precisão são negociadas para a velocidade e taxa de transferência. Na maior parte, este resultado é devido a erros maiores na pequena pipetagem volume e pesagem; bem como o aumento sampla heterogeneidade como tamanho da amostra é reduzida. Enquanto as grandes conjuntos de amostras podem ser rastreados e comparados, muito cuidado deve ser exercitado ao fazer comparações entre campanhas separadas e aos resultados em escala de bancada.
Os passos mais demoradas envolvem a manipulação física da biomassa. Amostras de moagem pode levar vários minutos por amostra, incluindo a limpeza do moinho entre as amostras. Carregando manualmente, a descarga, e moegas de limpeza e enchimento e esvaziamento sacos de chá e sacos de amostras também é muito trabalhoso. Embora cada etapa pode demorar um minuto ou mais, fazendo milhares de amostras pode demorar várias horas ou mesmo dias. Os robots podem carregar um reactor típico placa com biomassa em cerca de 3 a 4 horas ou 6 a 8 placas dia -1 -1 robô. Esta situação depende dos parâmetros de precisão utilizados, bem como do tipo e quantidade de biomassa a ser testado. Placas de enchimento do reactor com água, ácido diluído, ou enzima é feito rapidamente, utilizando um manuseamento robô líquido. Pretratamento de uma pilha de placas (de 1 a 20 placas de reactores) leva entre 1 e 3 horas, quando a montagem, esfriar e desmontagem está incluído. Hidrólise enzima leva 3 dias e a análise de açúcar requer cerca de 1 hora de tempo de preparação, mais 10 min por placa reactor para completar o ensaio e ler os resultados. A programação semanal de Set de pré-tratamento e de análise dias acomoda um horário de trabalho razoável, minimizando estranho horas e fins de semana os esforços para o componente humano do ensaio e permite o processamento de ~ 800 a 1.000 amostras por semana em uma base contínua. A taxa de transferência máxima depende de vários fatores, principalmente quanto hardware (robôs, reatores placas, etc.) e quanto "software" (ou seja, recursos humanos) estão disponíveis para fazer o trabalho manual. O limite prático superior é 2.500 a 3.000 amostras / semana; no entanto, que a produção exige operação de sete dias por semana e vários estagiários e técnicos dos estudantes. Em comparação, 3.000 amostras por HPLC exigiria cerca de 125 dias de samanálise ple mais o trabalho adicional de pesagem manualmente amostras em reatores e amostras de filtragem antes da análise.
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Protocol
1. alta taxa de transferência de Determinação de Glicose rendimentos e xilose Seguindo enzimática Sacarificação 9,29
- Preparação de Amostras (Grinding, De-starching, extracção, pré-tratamento)
- Moer, pelo menos, 300 mg de cada amostra de biomassa usando um moinho de facas, de modo a que as partículas passam através de uma malha 20 (850 um) de tela. Transferir para sacos zip-top anti-estáticos (normalmente com código de barra) e informações de exemplo registro no banco de dados de código de barras.
- Adicionar cerca de 250 mg ou mais da biomassa aérea do saco anti-estática para uma numerada (com lápis, não use tinta ou marcador) tea-bag, cuidadosamente arregaçar as saquinhos de chá, certificando-se de dobrar as extremidades através da biomassa para evitar perda durante de-starching e extração.
- Enrole o saquinho fechado com fio de cobre revestido de estanho. Registe o número do saquinho de chá para cada amostra de código de barras.
- Preparar a solução de enzima-starching de enzimas comerciais (tipicamente, 0,25% (v / v) de glucoamilase (~ 1.600 AGU / L) e1,5% (v / v) de alfa-amilase (~ 2.900 KNU-S / L) em acetato de sódio 0,1 M (pH 5,0)). Preparar 16 ml por g de biomassa ou volume de 500 ml por 120 amostras do saquinho de chá. Nota: Cargas capazes de remover o amido a partir de biomassa no solo deve ser determinado empiricamente através de testes de amido após a digestão com uma gama de cargas de enzima e rácios.
- Em um recipiente de plástico, adicionar 16 ml de solução de enzima-starching de por 1 g de biomassa chão grandes quantidades. Para um protocolo de-starching lote, adicionar 120 saquinhos para 500 ml da solução tampão de enzima.
- Incubar em um agitador a 55 ° C durante 24 (± 4) horas, a 120 rpm para remover possível amido.
- Após a incubação de-engomar, lavar e aproveitar a biomassa em vários litros de água deionizada por 30 min. Repetir este processo mais duas vezes para remover os sais do tampão que pode causar esbarrar (formação de bolhas de gás na solução que pode resultar em um aumento súbito e violento no nível da solução, fazendo com etanol quente para o líquido em cascatapara fora do vaso de reacção) durante a extracção.
- Após a lavagem exaustiva da biomassa engomado-de, colocar os saquinhos para a coluna de extracção de Soxhlet para. Nenhuma dedal é necessário para este passo.
- Configure o refluxo Soxhlet, utilizando 95% de etanol e extrair as amostras durante 24 horas.
- Remover os saquinhos do reactor de Soxhlet e espalhado em uma única camada sobre um tabuleiro plano.
- Permitir que as amostras para secar durante a noite à temperatura ambiente numa hotte.
- Desenrole os saquinhos de chá e voltar a biomassa seca para originais sacos anti-estáticos com código de barras.
Nota: Os sacos anti-estáticos são eficientes em reduzir a eletricidade estática na biomassa, melhorando as características de manipulação. Se forem utilizadas outras opções de armazenamento, a biomassa adicional pode ser necessário devido ao apego biomassa para o lado do recipiente de armazenamento. - Transferir, pelo menos, 50 mg de biomassa seca para um funil de código de barras (utilizando mais material é melhor para uma distribuição precisa). Spode barcodes de sacos anti-estáticos e da tremonha de recepção para garantir rastreamento amostra precisa.
- Hoppers carga para pesagem sólidos robô, prestando muita atenção à ordem das amostras nos racks. Carregar placas reactor suficiente para conter todas as amostras e seleccionar o protocolo de distribuição com base no número de placas utilizadas.
- Roboticamente pesar 5 mg das amostras secas (± 0,3 mg) em aço inoxidável de placas de 96 poços resistentes aos ácidos. Pesar 3 repetições de cada amostra distribuídos em torno da placa para minimizar quaisquer variações localizadas.
- Incluir 8 amostras de biomassa controle de um material padrão de biomassa bem caracterizado, a fim de acompanhar o desempenho do ensaio. Para vários pratos, o uso de múltiplos funis de biomassa padrão irá minimizar o tamanho de partícula deriva causada por peneiração nos funis ao longo de ciclos repetidos de distribuição.
Nota: Em cada placa, deve ser de 24 amostras com 3 repetições, 4 espaços em branco que consistem em água desionizada e a enzima, e 8 controLS, usando o padrão de biomassa previamente caracterizados. Os poços 3 canto de cada um dos 4 cantos da placa são reservados para os padrões de açúcar. - Cheque em branco e açúcar poços de padrão de partículas de biomassa errantes e remover se presente.
- Adicionar 250 ul de água desionizada a cada cavidade, e selar as placas com politetrafluoroetileno adesivo de silicone de encosto (PTFE) de fita.
- Usando um "ponta do ferro de solda 08/01, perfurar a fita de PTFE em cada porto de vapor (117 total) para cada prato. Use um prato vazio empilhados na placa reactor selado como um guia e para restringir PTFE movimento filme.
- Prenda as placas firmemente com 0,031 "juntas de espessura reforçado com vidro de PTFE (pré-perfurados com orifícios para os portos de vapor) entre as placas e placas vazios na parte superior e inferior da pilha. Pretreat as amostras utilizando um reactor de vapor definido para 180 ° C durante 17,5 min, ou outras combinações de temperatura / tempo com base na severidade desejada.
- Placas de reatores Arrefecer até 50 °; C por inundações com água deionizada.
- Enzimática Sacarificação
- Prepara-se uma solução de sacarificação enzimática consistindo em 8% (v / v) de solução de enzima em citrato de sódio 1,0 M, pH 5,0. Prepare 5 ml por placa reactor. Nota: A diluição necessária deve ser determinado com base na actividade e teor de proteínas da solução de estoque de enzima específica.
- Quando as placas são legais, centrifugar-los em um rotor basculante em 1500 xg durante 20 min. Remover vedação filme. Nota: Estas placas são pesados e as especificações de centrifugação deverão ser verificados para compatibilidade.
- Adicionar 40 ul da solução de enzima de 8% a cada poço (70 mg de enzima por g de biomassa).
- Selar novamente com nova fita PTFE. Coloque placa selada em placa de fixação magnética.
- Misturar suavemente as amostras por inversão (pelo menos 15 vezes), e incuba-se a 50 ° C durante 70 h.
- Quando a sacarificação concluiu, misturar por inversão e centrifugar as placas a 1.500 xg durante 20 min.
- Ensaio de Açúcar
- Preparar um conjunto de 6 de glucose e xilose combinado padrões de calibração em tampão de citrato 0,014 (pH 5,0) variando de 0 a 0,750 mg / ml (0, 0,2, 0,3, 0,45, 0,65, e 0,75 mg / ml recomendado) e de 0 a 0,600 mg / ml (0, 0,1, 0,2, 0,35, 0,45, e 0,6 mg / ml recomendado) para a glucose e xilose, respectivamente.
- Preparar a glucose-oxidase / peroxidase (goPod) e xilose desidrogenase (XDH) reagentes de acordo com as instruções do kit.
- Usando uma pipeta, 200 uL de remover líquido dos poços de canto 4 e poços de bordo adjacentes às cavidades de canto (12 cavidades no total) da placa reactor.
- Usando uma pipeta, 180 uL dispensar água desionizada a cada poço de uma placa de diluição de fundo plano de 96 poços de poliestireno. Não adicionar água aos poços de canto padrão e 12 açúcar (remover essas dicas se estiver usando uma cabeça de 96 canais).
- Usando uma pipeta, 180 uL de reagente dispensar goPod a cada poço do ensaio de glucose plcomeu.
- Usando uma pipeta, dispensar reagente XDH 180 ul a cada poço da placa de ensaio de xilose.
- Usando uma pipeta, transferir 20 ul de aliquotas a partir do hidrolisado do reactor placa de 96 cavidades para a placa de diluição. Pipetar a partir da parte superior dos poços para evitar sólidos de biomassa e o líquido residual em poços de canto. Misturar por trituração para pelo menos 10 ciclos.
- Usando uma pipeta, transferir 110 ul de padrões de açúcar, em duplicado, às cavidades de canto da placa de diluição.
- Usando uma pipeta, transferir 20 mL alíquotas a partir da placa de diluição às placas de ensaio de glicose e xilose. Misture por trituração.
- Incubar as placas de ensaio de glicose e xilose à temperatura ambiente durante 30 min. Quebre cuidadosamente quaisquer bolhas de superfície antes de ler. Uma pistola de calor passou rapidamente sobre a superfície da placa funciona bem.
- Usando um de 96 poços leitor de placas ultravioleta / visível, defina o comprimento de onda medido a 510 nm e registre a absorvância contra um branco de reagente.Esta medição monitoriza a formação de quinonimina, que é proporcional à concentração de glicose. A concentração de glicose é calculada a partir da curva de calibração com base em padrões de calibração preparadas no ponto 1.3.1.
- Usando um de 96 poços leitor de placas ultravioleta / visível, defina o comprimento de onda medido a 340 nm e registre a absorção. Esta medição controla a redução do NAD + a NADH, que é proporcional à concentração de xilose. A concentração de xilose é calculada a partir da curva de calibração com base em padrões de calibração preparadas no ponto 1.3.1.
2. alta taxa de transferência de Determinação de lignina total e lignina Monomérico Conteúdo Usando pyMBMS 28
- Preparação de amostra
- Moer e extrai-se a biomassa utilizando os métodos descritos nos passos 1.1.1, e 1.1.6-1.1.8. Isso inclui moagem e extração de um conjunto de normas de usar controles como experimentais.
Nota: O MEASUR pyMBMSements são não-dependente do tamanho da partícula, de modo que apenas utilizando o protocolo pyMBMS, a preparação de biomassa devem ser realizados para permitir que a amostra se encaixar no suporte da amostra, <4 mm. - Utilizando uma pequena espátula de distribuição a cerca de 4 mg de (3 a 5 mg de preferência) da biomassa preparada num copo de aço inoxidável de 80 ul concebido para o amostrador automático.
- Certifique-se de que pelo menos 10% das amostras sendo analisadas são normas de controlo, tais como os disponíveis do Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia (bagaço de cana-8491; choupo-8492; pinho-8493; ou palha de trigo-8494). O padrão pode também ser quaisquer espécies análogas para as amostras a serem analisadas, que já foram caracterizados utilizando métodos convencionais.
- Aleatoriamente carregar as amostras para os copos auto-amostrador usando uma pinça para evitar viés devido a uma possível deriva espectrômetro ao longo do tempo. Nota: Uma aleatorização típica das amostras que incluem a medição de todas as amostras de uma vez, seguido por uma re-randomizaçãoda ordem das amostras para uma medição duplicado. Programas de randomização estão disponíveis online.
- Usando um furador padrão, produzir manualmente discos de filtro de vidro a partir de folhas de fibra de vidro A / D tipo, sem aglutinante. Segure o filtro de fibra de vidro redondo com uma pinça, centralizá-lo sobre o copo de amostra, e empurrar para a amostra usando uma chave Allen de 3,5 milímetros para confinar o material em cada copo durante o experimento.
- Moer e extrai-se a biomassa utilizando os métodos descritos nos passos 1.1.1, e 1.1.6-1.1.8. Isso inclui moagem e extração de um conjunto de normas de usar controles como experimentais.
- Protocolo Instrumental
- Calibra-se o espectrómetro de massa usando um padrão conhecido que tem as intensidades dos picos mais de toda a gama de compostos que podem existir para as amostras experimentais. Para amostras de biomassa típicos, usar perfluorotributilamina (PFTBA).
- Definir a taxa de fluxo de gás de transporte de hélio para 0,9 L / min, utilizando um medidor de fluxo de gás.
- Definir o forno de auto-amostrador a uma temperatura de pirólise de 500 ° C e a temperatura de interface a 350 ° C, utilizando o software de auto-amostrador. Nota: A "de aço inoxidável 1/8 aquecidaA linha de transferência de calor envolvido na fita que liga o amostrador automático para o espectrómetro de massa é controlada usando um controlador térmico a 250 ° C.
- Comece a aquisição de dados sobre a espectrômetro de massa e aguarde pelo menos 60 segundos para obter dados suficientes para a recolha de espectros de fundo.
- Comece o método de auto-amostrador automático com as especificações de 2.2.2. Nota: O amostrador automático gotas cada amostra individual para dentro do forno de auto-amostrador. O tempo total de aquisição de dados é de aproximadamente 1,5 min; No entanto, a pirólise de um típico 4 mg de amostra é completa após 30 seg.
- Conteúdo recorde total de iões (TIC) de cada amostra utilizando software espectrômetro de massa em 0,5 seg velocidade de varredura. Intensidades recorde entre m / z 30-450.
Nota: compostos de biomassa típicas utilizam ionização suave em 17 eV. O instrumento pode gravar intervalos maiores a partir de m / z de 1 a 1000; no entanto, a taxa de varredura será limitado pela potência da CPU do computador. - Remover fundo a partir dos espectros usando o manual aprimorar recurso do software. Nota: Uma porção de 60 varrimento de linha de base no início da recolha de dados é usada para calcular um valor médio de fundo. Este espectros média de fundo é removido a partir dos espectros da amostra experimental automaticamente no software espectrómetro de massa.
- Importar o ficheiro de texto coluna único criado pelo software espectrómetro de massa que contém os dados espectrais para cada amostra, em um programa de base de dados e combinar todas as amostras numa base de dados. Adicionar quaisquer metadados aplicável à planilha. Importe os dados formatados (planilha de arquivos / CSV) em um pacote de software estatístico e significa normalizar o espectro para explicar a variação nas massas de amostra pyrolyzed.
- Usar um pacote de software estatístico para realizar uma análise de componentes principais (PCA), usando os dados espectrais para analisar agrupamento das amostras padrão replicados utilizados nas medições, bem como para avaliar os picos que são integrais com a classificação de químicacompostos nas cargas plotar 28.
Nota: grupos PCA as amostras com base na similaridade de seus espectros, e permite uma verificação das normas para medir erro experimental devido à deriva instrumento durante a corrida. - Para calcular a lenhina siringil (S) / guaiacilo (L) índice, soma das áreas dos picos S (m / z = 154, 167, 168, 182, 194, 208, e 210) e dividir pela soma de G picos em 124, 137, 138, 150, 164, e 178.
- Para calcular o teor de lignina total, soma dos picos de lignina com m / z = 120, 124, 137, 138, 150, 152, 154, 164, 167, 178, 180, 182, 194, e 210.
- Calcular um fator de correção para escalar a medição pyMBMS com um método padrão para a estimativa total de lignina, como Klason lignina. Divida o valor lignina Klason da norma individual pelo teor de lignina total medido para essa amostra padrão usando pyMBMS.
- Aplicar esse fator de correção para todos os-espécies, como no conjunto de dados. Repita o procedimento para cada tipo de biomassa analisada. Nota: O factor de correcção pode variar significativamente com base no S / L de biomassa analisados.
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Representative Results
O efeito combinado do pré-tratamento termoquímico e subsequente sacarificação enzimática é medida como uma função da massa de glicose e xilose libertada no final do ensaio. Os resultados são relatados em termos de miligramas de glicose e xilose libertada por grama de biomassa. Isto está em contraste gritante com dados reportados a partir de ensaios em escala de bancada, que normalmente é avaliado como por cento de rendimento teórico com base em análise da composição do material de partida. Como ele ainda não é prático para realizar análise da composição em milhares de amostras por semana, os dados são melhor classificado como níveis de conversão em uma base de massa. Isto permite a avaliação da amostra razoável contanto que as comparações entre as amostras são feitas estreitamente relacionados de biomassa e a composição das amostras não varia muito.
O principal objetivo do ensaio é avaliar as diferenças relativas de resistência da parede celular da planta para termoquímico / enzym combinadosacarificação atic toda uma gama de variantes individuais. Vale a pena notar que o ensaio não tenta otimizar qualquer das condições utilizadas para sacarificação. Na verdade, as condições de pré-tratamento de severidade são significativamente sub-óptima, a fim de alargar a gama de sensibilidade do ensaio, tendo como alvo um rendimento de 50% a 70% do valor teórico conversão final. Condições de pré-tratamento em ou perto óptima seria empurrar para todas as amostras de conversão elevada, reduzindo consideravelmente a gama dinâmica do ensaio. Por outro lado, a carga de enzima é muito maior do que o relatado para digestões normalmente em escala de bancada. Mais uma vez, o objectivo do método não é para encontrar o melhor enzima ou minimizar o custo da enzima, mas para medir a recalcitrante intrínseca das paredes das células e a conversão usando cargas muito elevadas da enzima remove variabilidade do ensaio.
Por fim, é importante compreender que a variabilidade no ensaio total é significativamente mais elevada do que a relatada para BenCtrabalho h escala. Erros padrão típicas são cerca de 8%, embora a gama é muito mais ampla. Isto é simplesmente a natureza de pequena escala, a pesquisa HTP. Pipetting e erros de ponderação são proporcionalmente mais elevado na escala ul e mg, assim como as perdas por evaporação e condensação. Biomassa heterogeneidade torna-se uma variável muito grande quando ensaiando várias ordens de grandeza menos partículas em cada amostra, ou seja, 5 mg contra múltiplos g. Os ensaios colorimétricos para determinar a glicose e xilose correlacionam-se bem com os resultados da HPLC; No entanto, embora os ensaios ligados a enzima para a análise de açúcar são rápidos e podem ser realizados em paralelo, eles não são tão precisos como os métodos de análise, tais como HPLC, introduzindo uma outra camada de imprecisão (Figura 1).
Devido a todas as considerações acima, os resultados só devem ser interpretadas e publicadas dentro de certas limitações. Os dados devem ser examinados em conjuntos inteiros, amostras não como individuais. As réplicas são necessários para MEAningful resultados. Tendências e valores atípicos são significativos, mas os resultados individuais não são. As comparações são os melhores feitos dentro de conjuntos experimentais individuais. Comparações entre campanhas temporalmente ou separadas espacialmente exigem controles extremamente apertados e uma análise cuidadosa para ser significativo. Dados HTP não é directamente comparável com avaliação comparativa de dados ou outra escala. Tendências rastrear entre o HTP e outras escalas, mas as comparações diretas de amostra não produzem resultados idênticos.
Representação de dados normalmente cai em comparações tendências, casos desviantes, ou sub-população / variantes. Um exemplo de tendências é um levantamento de recalcitrância de 755 variantes naturais de álamo amostrados em uma ampla faixa no noroeste do Pacífico dos Estados Unidos 19. O recalcitrante destas amostras foi representada graficamente contra a sua relação de teor de lenhina siringil e / guaiacil como determinado por pyMBMS. Os resultados indicam que como S / G aumenta, diminui até um recalcitrante relação S / G de cerca de 2, onde o impr recalcitranteníveis ovement off (Figura 2). Outliers pode ser claramente visto na Figura 3, onde o gene Pt4CL1 foi regulada para baixo em choupo. Várias centenas de cultivares foram rastreados e vários são claramente aumentada em recalcitrante, como evidenciado pela libertação de açúcar diminuído. A Figura 4 descreve um estudo no qual diversas variedades de trigo de palha diferentes foram cultivadas em vários pontos ao longo de dois anos e colheita após várias variações nas condições de crescimento , resultando em populações distintas com base 20 em combinações das variáveis acima. Estes conjuntos de amostras são facilmente distinguidas e indicam variáveis positivos e negativos para recalcitrante. A Figura 5 mostra como pyMBMS pode ser utilizado para avaliar as mudanças na composição da parede celular. Fragmentos de espectro de massa são atribuídos a diferentes monómeros de lenhina (Tabela 1). Ao comparar a amostra com alta de lignina vs. alto teor de carboidratos, as disparidades nos dados espectrais são aparentes. Tele usar de dados pyMBMS juntamente com uma análise de componentes principais (PCA), está ilustrada na Figura 6. Neste exemplo, as amostras são classificadas de acordo com a fertilização baixo ou alto de azoto. Lignina e teores de carboidratos alinhar inversamente ao longo PC1. O uso de cargas de componentes do principal trama pode auxiliar na identificação de características químicas que estão a ser explicada na trama classificação contagens, bem como traços elucidativa que estão a mudar entre os grupos de amostra.
Figura 1: Comparação de glicose e xilose quantificação usando alto throughput ensaios colorimétricos vs. HPLC 9. Comparação de detecção de glicose e xilose foi levada a cabo usando Xilose desidrogenase (XDH, painel superior) e glucose-oxidase / peroxidase (goPod, painel inferior) ensaios ligados a enzima colorimétricos de alto rendimento e de alto desempenho lcromatografia iquid.
Figura 2: Recalcitrance de paredes celulares de choupo como uma função de siringil para guaiacil conteúdo (S / L) em lignina 9 Aumento da recalcitrante de paredes celulares de choupo como uma função de siringil para guaiacil conteúdo (S / L) na fracção de lenhina tem. foram observados e relatados. 755 amostras de núcleo de álamo da mesma cultivar álamo foram tomadas várias centenas de milhas de florestas no Noroeste do Pacífico da América do Norte e rastreados para a glicose e xilose liberação após pré-tratamento termoquímico a sacarificação enzimática e. Os resultados foram representados em função da razão S / L na lignina da parede celular, tal como determinado por pyMBMS. Recalcitrance diminui com o aumento S / L até cerca de 2, onde permanece constante em maior S / L. Valores de rendimento teórico são baseadas no BESC "padrão" choupo e são fornecidos como uma referenCE para comparação.
Figura 3:. Recalcitrance na expressão Pt4CL1 regulada-down em choupo Down-regulação do gene Pt4CL1 em choupo resultou em pouca variação na célula recalcitrância parede entre clones, no entanto diversas variantes recalcitrância aumentaram drasticamente são facilmente identificados. Por favor clique aqui para ver um maior versão desta figura.
Figura 4: Recalcitrance em várias populações Wheatstraw Os efeitos do tipo de cultivar, local de cultivo, aplicação de fertilizantes, e resultado taxa de regar nos níveis de recalcitrância claramente distinguíveis.. Diferentes símbolos representam different condições de crescimento experimentais. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5:. A aplicação de pyMBMS para a análise das modificações químicas em paredes de células de plantas 28 Os picos indicados com setas são fragmentos de lenhina, e foram utilizados para avaliar (a) alta lignina (b) a lignina forma ou (c) de baixo conteúdo de lignina.
Figura 6:. Componentes principais escores de análise trama de diferenças na química da parede celular de árvores populosos cultivadas com taxas de fertilização superiores e inferiores 28 (Superior) Análise de componentes principaispontuações traçar ilustrando uma classificação distinta, e por conseguinte, as diferenças na química da parede celular de plantas cultivadas populosas com taxas de fertilização mais elevadas e mais baixas. Principal componente um particionado as amostras com base no maior lignina (negativo) ou carboidratos conteúdo (positivas) mais elevados. (Parte inferior) As principais cargas de componentes elucidar quais componentes químicos mudar entre os dois conjuntos de amostras na trama pontuações. As cargas positivas correlação com os escores positivos, que são representativos do conteúdo de hidratos de carbono mais elevados, enquanto cargas correlacionados negativamente alinhar com pontuação negativa e, portanto, maior teor de lignina.
| m / z | Atribuição Molecular 30 | S / G / H atribuição |
| 94 | fenol | S / G / H |
| 120 | Vinilfenol | H |
| 124 | Guaiacol | G |
| 137 | Ethylguaiacol, homovanillin, álcool coniferílico | G |
| 138 | Methylguaiacol | G |
| 150 | Vinilguaiacol | G |
| 154 | Siringol | S |
| 164 | Alil- + propenil guaiacol | G |
| 167 | Ethylsyringol, syringylacetone, propiosyringone | S |
| 168 | 4-Metil-2,6-dimetoxifenol | S |
| 178 | Aldeído coniferílico | G |
| 180 | Álcool coniferílico, syringylethene | S, L |
| 182 | Siringaldeído | S |
| 194 | S | |
| 208 | Sinapylaldehyde | S |
| 210 | Sinapylalcohol | S |
Tabela 1:. Pico m / z e para atribuições de fragmentos de pirólise derivado de lignina tal como detectado por espectrometria de massa Lista de compostos típicos detectados por pyMBMS. Atribuições moleculares baseados em Evans, RJ e Milne TA (1987). Caracterização molecular da pirólise de biomassa Energia e Combustíveis 1 (2):. 123-137.
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Discussion
As principais etapas de preparação de amostras para a obtenção de dados precisos e reprodutíveis quando conduzindo experimentos de rastreio de alto rendimento são as seguintes:
Ensaio de Libertação de açúcar:
Em geral, as amostras são preparadas em lotes que vão desde algumas dezenas a milhares de cada vez. Cada passo importante é tipicamente levada a cabo em todas as amostras antes de se mudar para a frente, a fim de minimizar as variações na preparação entre amostras. De-starching não era originalmente parte do protocolo e pode ser omitido em alguns casos. Amostras de núcleo de madeira e materiais de herbáceas senescentes são consistentemente baixa em amido e, portanto, não necessitam de-starching para reduzir a variabilidade. O amido é uma grande preocupação; No entanto, em conjuntos de amostras de tecidos de plantas verdes, especialmente para grandes conjuntos de amostras onde a colheita ocorre ao longo de várias horas. Como os níveis de amido subir durante o dia e estão esgotados durante a escuridão, os níveis de amido podem variar significativamente ao longo sh árias e glucose a partir do amido é indistinguível da glicose a partir de celulose, por conseguinte, maiores níveis de amido pode conduzir a medições Recalcitrance distorcidamente baixos. A carga real de enzima no passo destarching é de preocupação menor, contanto que não é suficiente para remover o excesso de actividade de todo o amido acessível no interior da estrutura de tempo do passo de hidrólise do amido. As variações nas enzimas específicas usadas, tempo, temperatura, taxa de volume e agitação da etapa de amido de remoção pode certamente levar a diferenças nos níveis de remoção de amido e taxas e deve ser determinada empiricamente, quando possível. Por último, quando o invólucro os saquinhos de chá para a extração, use fio de cobre revestido de estanho. Nua fio de cobre pode causar reações químicas indesejadas com a solução de enzima, dando valores de açúcar falsos. Cobre Tin revestido resolvida esta questão, enquanto fio de aço inoxidável não era maleável o suficiente para manter os saquinhos de chá bem fechado.
Redução de tamanho consistente de biomassa é fundamental para accudados de taxa por duas razões: 1) finamente moído biomassa, enquanto mais facilmente e de forma consistente dispensado, é também mais fácil de digerir do que o material mais grosseiro. 2) A biomassa que é demasiado grossa pode entupir as tremonhas, resultando em material insuficiente ou, se a obstrução é somente bloqueando parcialmente a abertura, que pode actuar como um crivo e apenas permitir que as partículas finas por meio, diminuindo o recalcitrante observados da amostra. Se for muito pouca biomassa está contido nas tremonhas, pode revestir os lados do funil, fazendo com que o robô para assumir a tremonha está vazio e a amostra irá ser ignorado no processo de distribuição. Além disso, baixos níveis de biomassa pode contribuir para a heterogeneidade da amostra exagerada, especialmente na forma de partículas mais densas (tais como casca) tendem a peneira para o fundo do cone e se primeiro dispensada. Quando menos do que 50 mg de material está disponível, o ensaio pode ainda ser levada a cabo; no entanto, as amostras devem ser pesadas à mão. No entanto, os resultados da mão-de pesagem são mais variáveis do que os de roubarpesando ótica.
A quantidade real de biomassa necessária para as etapas preparatórias não está bem definida. Sugerimos 250 mg como um ponto de partida razoável, no entanto, cada amostra de biomassa apresenta características diferentes em matéria de perdas devido à manipulação, moagem e extração, assim como está sendo sustentado nos funis ou ser dispensada de forma reprodutível. A heterogeneidade da biomassa em todos os tipos e até mesmo dentro do mesmo tipo se opõe a um protocolo mais definido. Aqueles que desejam implementar esses métodos de ensaio simplesmente precisa determinar muitas destas variáveis para si mesmos, embora a experiência faz com que seja mais fácil.
Uma outra etapa, que pode introduzir um erro se a mistura em placas de microtitulação, o que é notoriamente difícil e é crítica nestes ensaios, por várias razões. A solução de enzima é concentrada e utilizada pode ser estratificada após adição às cavidades, o que limita a acessibilidade da enzima para a biomassa. Como sacarificação prossegue, o sugARS libertado pode também concentrar-se estratificar e perto da biomassa e, dependendo da profundidade de amostragem, ensaios de açúcar pode ser artificialmente elevado ou baixo. É por isso essencial para misturar amostras e, após a adição da enzima de sacarificação enzima, permitindo que a mistura completa das enzimas com a biomassa para o mesmo sacarificação e distribuição uniforme dos açúcares resultantes para permitir a análise de açúcar consistente. Em placas que não contenham biomassa, tais como placas de diluição ou de ensaio, misturando por pipetagem repetida (trituração) tem provado ser muito superior do que agitação. No entanto, como soluções neste protocolo têm densidades variáveis e os níveis de partículas, velocidade de pipetagem e localização ponta vertical na coluna de líquido é crítica. Se a velocidade é muito rápido, pouca precisão devido à cavitação (aspiração) e retenção de líquido na ponta (dispensação) pode ocorrer. Se a ponta é demasiado profunda no poço, a biomassa pode entupir a ponta, ou a ponta pode ser pressionado para a parte inferior, a prevenir a aspiração precisas, e háé mais área de superfície externa para o líquido e de se agarrar à transição para o próximo passo. Este último problema pode ser ligeiramente atenuado por controlo da velocidade de retirada da ponta, como remoção ponta mais lento permite que o líquido a ser removido com a solução a granel pela tensão superficial. Se a retirada da ponta é demasiado lenta, podem rastejar pipetados líquido de volta para a solução a granel bem. Partículas de biomassa também têm uma tendência a se apegar às pontas e tornar-se transferido para a placa de diluição, onde eles podem obstruir a ponta durante a mistura ou transferência para as placas de ensaio, criando imprecisões em volumes de amostra a ser analisada. Estas partículas também podem interferir com a análise espectroscópica das placas de ensaio se ocluir o feixe de luz durante a leitura.
Consistente tempo o desenvolvimento da cor é fundamental para goPod e ensaios XDH. A cor-de desenvolvimento devem ser autorizados a ir até o fim; No entanto, a cor do ensaio goPod tende a continuar a aumentar depois da conclusão e do NADH gerado pelo ensaio XDH lentamentediminui devido à oxidação espontânea do NADH. Como resultado, a variabilidade de temporização pode levar a comparações de dados inconsistentes entre placas separadas. As etapas do ensaio devem ser cuidadosamente monitorizados, como paralisações devido a problemas de hardware ou software pode levar a grandes diferenças nos tempos de ensaio. O uso de padrões de açúcar e poços de controlo biomassa padrão em cada placa pode ajudar a atenuar isso de alguma maneira.
PyMBMS:
Os padrões devem ser cuidadosamente considerados para pyMBMS experiências para comparação com os métodos químicos por via húmida convencionais. Devido à composição da lenhina diferindo (S / L rácios) de espécies de biomassa, o factor de correcção deve ser determinada utilizando um padrão representativo que é da mesma espécie que a amostra experimental. Se não houver nenhum padrão adequado disponível, as diferenças na concentração de lignina podem ser comparados utilizando as intensidades dos precursores de lignina directamente. Altas taxas de S / G (mais de ~ 3,5) pode levar à superestimação da lconteúdo ignin por pyMBMS. Isto é provocado pela tendência para S lignina a ser libertado, preferencialmente, sob as condições convencionais utilizadas neste método. Além disso, a quantidade de amostra necessária para as medições pyMBMS depende do tipo de biomassa utilizada. Lignina e compostos modelo de lenhina Isolado exigem menos material (0,1 mg), como a utilização de maiores alíquotas de amostra pode saturar o detector.
Outro passo crítico no processo de PyMBMS é cuidadoso ajuste do instrumento com um padrão conhecido como perfluorotributilamina (PFTBA) antes de cada experiência. PFTBA contém picos moleculares em todo o espectro de biomassa típica e, portanto, permite a sintonia instrumento uniforme entre ensaios experimentais. A região média do espectro PFTBA é ajustado de modo que a m / z 131 e m / z 219 são aproximadamente 50% da intensidade de m / z 69, o ajuste é usado para enfatizar picos típicos observados sob ionização macio (17 eV) utilizada para minimizar a fragmentação de iões para massas inferiores que c annot ser facilmente identificados.
Deve notar-se que esses métodos não são métodos analíticos para a quantificação exacta de analitos de interesse. Em vez disso, estas técnicas são de alto rendimento para o rastreio de grandes conjuntos de biomassa para identificar aqueles que possuem as características químicas desejadas. Esses métodos só deve ser utilizado para a triagem, classificação, e relação entre as amostras dentro de um conjunto de dados. Conjuntos de dados não podem ser comparados diretamente quando coletadas em diferentes dias devido a fontes de variação, tais como os desvios instrumentais, as mudanças na atividade da enzima, teor de umidade ambiente na biomassa devido a mudanças na umidade, variações de temperatura e diferenças de dicas e lotes placa absorvância . Além disso, o pré-tratamento usado no protocolo de preparação da amostra não é um pré-tratamento optimizado estratégia, mas foi especificamente concebida para ser sub-óptima. Isto permite que as diferenças subtis entre as plantas a ser elucidada de forma mais eficiente.
jove_content "> O principal benefício da adopção de métodos de alto rendimento é que muitos mais amostras pode ser medido no mesmo período de tempo 18. Por exemplo, um método comum para a análise de hidratos de carbono produzidos durante um sacarificação ácida ou enzimática é o uso de alto desempenho cromatografia líquida (HPLC). Selig et ai., referem que a hidrólise ubíqua do ácido em duas fases, embora bastante útil e fundamental para a quantificação de hidratos de carbono estruturais, limita investigadores para ser capaz de avaliar aproximadamente a 25 amostras por semana 9. Enquanto o analítica instrumentação empregue em metodologias de alto rendimento podem não proporcionar a sensibilidade de uma técnica padrão, como por HPLC, a análise rápida proporciona pesquisadores o luxo de ser capaz de avaliar de grandes quantidades de amostras. Além disso, os métodos de alto rendimento, muitas vezes têm downscaled protocolos experimentais, a redução do uso de materiais de consumo e, portanto, diminuir os custos experimentais e resíduos.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biomek FX Automated Workstation | Beckman Coulter | Biomek FX | Automated Liquid Handler |
| Wiley mill | Thomas Scientific | 3375E15 (Model 4), or 3383L20 (Mini-mill) | |
| anti-static bags | Minigrip* | MGST4P02503 | 2.5x3", multiple suppliers available |
| tin-coated copper wire | McMaster-Carr | 8871K84 | 0.016" diameter, bend-and-stay wire |
| tea-bags | Herbco | press n' brew teabags | 3.5x5 inches |
| gluco-amylase | Novozymes | Spirizyme Fuel | |
| alpha-amylase | Novozymes | Liquozyme SC DS | |
| sodium acetate trihydrate | any chemical supplier | reagent grade | |
| acetic acid | any chemical supplier | reagent grade | |
| 190 proof (95%) ethanol | any chemical supplier | reagent grade | |
| hoppers | Freeslate | ||
| 96-well C-276 Hastelloy plates | Aspen Machining (Lafayette, Colorado) | N/A (custom built) | |
| 1/8” soldering iron tip | Sears | ||
| silicone-adhesive backed Teflon tape | 3M | 5180 | 3" wide (36-yard rolls) |
| enzyme solution | Novozymes | Cellic CTec2 | |
| citric acid monohydrate | any chemical supplier | ||
| trisodium citrate dihydrate | any chemical supplier | ||
| disposable, polystyrene 96-well plates | Greiner Bio-One | 655101 | or equivalent; multiple suppliers available |
| glucose oxidase/peroxidase | Megazyme | K-Gluc | Megazyme D-glucose assay kit |
| xylose dehydrogenase | Megazyme | K-Xylose | Megazyme D-xylose assay kit |
| glucose standard solution | Megazyme | K-Gluc | Megazyme D-glucose assay kit |
| xylose standard solution | Megazyme | K-Xylose | Megazyme D-xylose assay kit |
| stainless steel sample cups | Frontier Laboratories | PY1-EC80F | |
| glass fiber sheets | Pall | 66227 | 8x10" sheets; circles punched with standard hole punch |
| Sugarcane Bagasse Whole Biomass Feedstock | NIST | 8491 | |
| Eastern Cottonwood (poplar) Whole Biomass Feedstock | NIST | 8492 | |
| Monterey Pine Whole Biomass Feedstock | NIST | 8493 | |
| Wheat Straw Whole Biomass Feedstock | NIST | 8494 |
References
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