Introduction
Как мировой поставку невозобновляемых видов топлива и связанных с ними продуктов снижается, ученые были оспорены, чтобы создать аналогичные виды топлива и химических веществ из растительного происхождения источников 1. Ключевым аспектом этой работы является определение, какие виды растений могут быть пригодны для производства биотоплива и биоматериалов 2,3. Как правило, эти исходные материалы оценивают по лигнина, целлюлозы, гемицеллюлозы и содержания; а также их восприимчивости к деконструкции (непокорности) через тепловой, механической и / или химической обработки с или без последующей фермента осахаривания. Более детальный анализ используется для определения конкретного состава лигнина и гемицеллюлозы фракций, а также оптимальные активность ферментов, необходимых. Трансгенные модификации растений, которые не обладают внутренне идеальные черты для биохимического или термохимической конверсии к желаемым товаров обеспечили исследователям значительно расширил источника горшокциальных сырье 4. Стандартные аналитические методы для количественного химические черты завода, в то время как весьма полезным для небольших наборов образцов, не подходят для быстрого скрининга сотен или тысяч образцов 5-7. Методы, описанные здесь, ПВТ были разработаны быстро и эффективно оценить большое количество вариантов биомассы изменений в клеточной стенки непокорности в термохимической и / или ферментативного расщепления.
Очень важно понимать, что ПВТ методы скрининга, описанные выше, не был разработан, чтобы максимально преобразование или выход. Целью является определить относительные различия в сопротивляемости разрушению образцов связанных биомассы. В результате, многие из шагов анализа отличаются от "типичных" конверсии биомассы анализов, где целью является получить максимальную скорость преобразования или степень. Например, более низкие уровни важности предварительной обработки и более короткие времена ферментативного гидролиза используют, чтобы максимизировать отличаютсятывает между образцами. В большинстве случаев, относительно высокие нагрузки ферментов используются для уменьшения различий из-за различий в экспериментальной активности фермента, которые могли бы существенно исказить результаты.
Быстрые методы для определения состава клеточных стенок растений и мономерных сахаров освобождаю- следующие ферментные осахаривания включают робототехнику, индивидуальные, термохимически совместимые 96-луночные планшеты и модификации стандартных лабораторных методов и инструментальных 8-11 протоколы, такие как колебательной спектроскопии (ИК (ИК), ближнем инфракрасном (БИК), или комбинационное) и ядерный магнитный резонанс (ЯМР) 12-17. Эти методики являются ключом к изоляции сырья с высоким целлюлозы или низким содержанием лигнина, или те, ожидается выход высокий глюкозы, ксилозы, этанол и т.д. Эти методы позволили с уменьшенным анализы, которые используют меньшее количество биомассы и расходных материалов, что приводит к снижению экспериментальная Расходы 18 9, тополь 8,10, сахарный тростник жома 8 и просо 8 были успешно оценены с помощью этих методов HTP.
Всего лигнин и лигнин мономерный состав также обычно количественно черты биомассы. Снижение содержания лигнина было показано для повышения ферментативной усвояемость полисахаридов 19,20. Роль, которую лигнин мономерный отношение (часто сообщается в сирингиловых / guaiacyl (S / G) содержание) играет в деконструкции завод клеточной стенки находится в стадии расследования. В некоторых докладах указывается, что сокращение S / GОтношение привело к увеличению урожайности глюкозы следующих гидролиза 21, в то время как другие исследования представит противоположную тенденцию 19,22. Высокие методы оценки пропускной лигнина и его мономеров включают колебательной спектроскопии (ИК, БИК, и комбинационного 23-26) в сочетании с многомерного анализа и пиролиза молекулярно-пучковой масс-спектрометрии (pyMBMS) 27,28.
При разработке методов ПВТ для скрининга биомассы, несколько интегральных соображения должны иметь в виду,. Одним из ключевых аспектов является сложность способа. Что необходимый уровень знаний для техники? Хемометрические анализы, например, требуют специальных навыков для построения, оценки и поддержания прогнозных моделей. Стандартные методы демонстрируют нежелательные действия подготовительного или анализа данных, или использовать токсичные реагенты. Разработка моделей представляет собой непрерывный процесс, где новые данные включены модели с течением времени, чтобы увеличить устойчивость модели. Еще considчества является экономия средств и снижение экспериментальные раз анализ предложенных методов с высокой пропускной. Если метод достаточно быстрый, но очень дорого, она не может быть целесообразным методом для многих лабораторий принять. Методы, представленные в этой рукописи варианты стандартных методов, модифицированных для усиления возможности производительности. Эти протоколы количественного измерения биомассы черты интерес, без необходимости разработки прогнозных моделей. Это является ключевым атрибутом этих методов, так как методы прогнозирования, в то время как выставляется сильные корреляции со стандартной анализ используется для разработки модели, не так точны, как на самом деле измерения количества интерес для образцов. В то время как методы, используемые в основном сократили версии стандартных ходе лабораторных аналитических методов, точность и точность торгуются на скорость и пропускную способность. Главным образом, этот результат за счет более высоких ошибок в малом объеме пипетки и взвешивания; а также увеличение сдостаточно неоднородность как размер выборки уменьшается. В то время как большие наборы образцов могут быть подвергнуты скринингу и по сравнению, большое внимание должно быть осуществлено при сравнении между отдельными кампаниями и в ходе лабораторных результатов.
Самые трудоемкие шаги включают физические манипуляции биомассы. Шлифовальные образцы может занять несколько минут за образец, в том числе очистки из мельницы между пробами. Вручную погрузка, разгрузка, и моющие Дозаторы и наполнения и опорожнения чайные пакетики и примеры сумки тоже очень трудоемкий. Хотя каждый шаг может занять минуту или больше, делая тысячи образцов может занять несколько часов или даже дней. Роботы могут загрузить типичный реактор тарелку с биомассой в 3 до 4 часов или от 6 до 8 пластин день -1 -1 робота. Эта ситуация зависит от параметров, используемых точности, а также от типа и количества биомассы для тестирования. Заполнение реактора пластины водой, разбавленной кислотой, или фермент быстро сделано с использованием жидкого обслуживание робота. РРегенерация стека пластины (от 1 до 20 реакторов пластин) занимает от 1 до 3 ч, когда монтаж, охладить и демонтаж входит в стоимость. Фермент гидролиза занимает 3 дня и анализ сахара требует около 1 часа времени подготовительной плюс 10 мин на пластины реактора для завершения анализа и чтения результатов. Еженедельный график, установленных предварительной обработки и анализа дней вмещает разумный график работы, сводя к минимуму нечетным час и в выходные дни усилия для человеческого компонента анализа и позволяет для обработки ~ 800 до 1000 проб в неделю на постоянной основе. Максимальная пропускная зависит от нескольких факторов, в основном, сколько аппаратных средств (роботы, реакторы плиты и т.д.) и сколько "обеспечение" (т.е., штатное расписание) доступны, чтобы сделать ручной работы. Практическое верхний предел от 2500 до 3000 выборок / неделю; однако, что выход требует 7 дней в неделю операции и несколько студентов-стажеров и технических специалистов. Для сравнения, 3000 образцов по ВЭЖХ потребует примерно 125 дней СэмаPLE анализ плюс дополнительная рабочая вручную весом образцы в реакторах и образцов фильтрующих до анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Определение 1. Высокая пропускная способность глюкозы и ксилозы Доходность следующие ферментные осахаривания 9,29
- Подготовка образцов (шлифовка, Де-крахмальные, Добыча, предварительная обработка)
- Измельчите по крайней мере, 300 мг каждого образца биомассы с использованием мельницы Wiley, так что частицы проходят через 20 меш (850 мкм). Трансфер в антистатические молнии топ сумки (обычно со штрих-кодом) и запись выборочная информация в базе данных штрих-кода.
- Добавьте примерно 250 мг или больше первом биомассы из антистатический пакет для пронумерованной (с карандашом, не использовать чернила или маркера) чай-мешок, тщательно свернуть пакетики, будучи уверенным, чтобы сложить концы на биомассе для предотвращения потери при де-крахмальные и добычи.
- Оберните пакетик закрыт с помощью олова покрытием медного провода. Запишите номер чайного пакетика для каждого Barcoded образца.
- Приготовьте де-крахмаления энзимного раствора с коммерческими ферментов (обычно 0,25% (об / об) глюкоамилазы (~ 1600 AGU / л) и1,5% (об / об) альфа-амилаза (~ 2,900 КНУ-S / L) в 0,1 М ацетата натрия (рН 5,0)). Подготовка 16 мл на г биомассы объемной или 500 мл на 120 выборок пакетик. Примечание: Нагрузки, способные удалять крахмала из подземной биомассы должны быть определены эмпирически путем проверки на крахмале после расщепления с диапазоном ферментных нагрузок и коэффициентов.
- В пластиковом контейнере, добавить 16 мл раствора де-крахмаления фермента на 1 г биомассы объемной земли. Для протокола де-крахмальные пакетном добавить 120 пакетики к 500 мл буферного раствора фермента-.
- Инкубируют в шейкере при 55 ° С в течение 24 (± 4) ч при 120 оборотах в минуту, чтобы удалить возможные крахмал.
- После де-подкрахмаливания инкубации, промыть и замочить биомассы в нескольких литров деионизированной воды в течение 30 мин. Повторите этот процесс еще два раза, чтобы удалить буферные соли, которые могут вызвать натыкаясь (образование пузырьков газа в растворе, которые могут привести к внезапной и жестокой повышением уровня раствора, в результате чего горячая жидкость этанол в каскадиз реакционного сосуда) во время экстракции.
- После исчерпывающего промывания биомассы де-накрахмаленные, разместить пакетики в колонке Сокслета для извлечения. Нет наперсток не требуется для этого шага.
- Настройка рефлюкс Сокслета, используя 95% этанола и извлечь образцы в течение 24 часов.
- Удалить пакетики из реактора Сокслета и распространено в один слой на плоской пластине.
- Разрешить образцы высохнуть в течение ночи при комнатной температуре в вытяжном шкафу.
- Разверните пакетики и вернуться высушенного биомассы с оригинальными со штрих антистатические пакеты.
Примечание: антистатические пакеты работоспособны при снижении статического электричества в биомассе, улучшению характеристики управляемости. При использовании других вариантов хранения, дополнительное биомассы могут быть необходимы в связи с биомассы цепляется за сторону контейнера для хранения. - Передача по меньшей мере, 50 мг высушенного биомассы в бункер Barcoded (с использованием большего количества материала лучше для точного дозирования). Sможет штрих анти-мешках и приемного бункера, чтобы обеспечить точное отслеживание образца.
- Загрузка бункеров на твердые весом робота, обращая особое внимание на порядок образцов в стойках. Загрузите достаточно реакторных пластин содержат все образцы и выбрать протокол для выдачи в зависимости от количества пластин, используемых.
- Робота весят 5 мг высушенных образцов (± 0,3 мг) в нержавеющей стали 96-луночных планшетах кислотостойких. Взвесить 3 повтора каждого образца, распределенных вокруг пластины, чтобы минимизировать любые локальные вариации.
- Включите 8 контрольных образцов биомассы хорошо характеризуется стандартного материала биомассы в целях отслеживания производительности анализа. Для нескольких пластин, использование нескольких стандартных бункеров биомассы позволит свести к минимуму смещение размера частиц, вызванное просеивания в бункерах в течение многократных циклов дозирования.
Примечание: В каждой пластине, должно быть 24 образцов с 3 повторами, 4 заготовок, состоящих из деионизированной воды и фермента, а также 8 ControLs, с использованием ранее характеризуется стандартной биомассы. В 3 угловые скважин каждого из 4-х углов пластины зарезервированы для стандартов сахара. - Проверьте пустые и сахара стандартных скважин для странствующих частиц биомассы и удалить, если присутствует.
- Добавить 250 мкл деионизованной воды в каждую лунку, и запечатать пластины с силиконовый клей покрытием политетрафторэтилен (ПТФЭ) лентой.
- Использование "наконечник 1/8 паяльник, проколоть PTFE ленты в каждом порту пара (117 всего) для каждой пластины. Используйте пустую тарелку друг на закрытой реактора пластины в качестве направляющей и ограничить движение PTFE пленки.
- Зажмите пластины плотно с 0,031 "толстых стеклянных ПТФЭ прокладки (предварительно пробитыми отверстиями для пара портов) между пластинами и пустые тарелки на верхней и нижней части стека. Предварительной обработки образцов с помощью паровой реактор установлен на 180 ° C в течение 17,5 мин, или других комбинаций температуры / времени на основе желаемой степени тяжести.
- Охлаждение реактора пластины до 50 °С наводнением с деионизированной водой.
- Ферментативный Осахаривание
- Подготовка ферментативной осахаривания раствор, состоящий из 8% (об / об) раствора фермента в 1,0 М цитрат натрия, рН 5,0. Подготовка 5 мл на пластину реактора. Примечание: Разбавление необходимо должны быть определены на основе активности и белкового содержимого конкретного решения Stock фермента.
- Когда пластины прохладно, центрифуги их в роторе ковша поворотной в 1500 мкг в течение 20 мин. Удалить уплотнение фильм. Примечание: Эти пластины тяжелые и характеристики центрифуги должны быть проверены на совместимость.
- Добавить 40 мкл 8% раствора фермента в каждую лунку (70 мг фермента на г биомассы).
- Reseal с новым PTFE ленты. Поместите запечатанный пластину в магнитном зажиме пластины.
- Осторожно смешивать образцы от инверсии (по крайней мере, в 15 раз), и инкубируют при 50 ° С в течение 70 ч.
- Когда осахаривания заключил, перемешать инверсии и центрифуги пластины на 1500 хг в течение 20 мин.
- Сахар Анализ
- Подготовка комплекта 6 глюкозы и ксилозы в сочетании калибровочных стандартов в 0,014 М цитратном буфере (рН 5,0) в диапазоне от 0 до 0,750 мг / мл (0, 0,2, 0,3, 0,45, 0,65 и 0,75 мг / мл рекомендуется) и от 0 до 0,600 мг / мл (0, 0,1, 0,2, 0,35, 0,45 и 0,6 мг / мл рекомендуется) для глюкозы и ксилозы, соответственно.
- Подготовка глюкозооксидазного / пероксидазы (GOPOD) и ксилоза дегидрогеназы (XDH) реагенты в соответствии с инструкциями в комплекте.
- С помощью пипетки, удалить 200 мкл жидкости из угловых скважин 4 и краевых скважин, примыкающих к угловых скважин (12 Всего скважины) реактора пластины.
- С помощью пипетки, обойтись 180 мкл деионизированной воды на каждую лунку 96-луночного полистирольного плоским дном разбавления пластины. Не добавляйте воду в 12 сахарных стандартных и угловых скважин (удалить эти советы при использовании голову 96-канальный).
- С помощью пипетки, обойтись 180 мкл реагента GOPOD в каждую лунку анализа глюкозы плел.
- С помощью пипетки, обойтись 180 мкл реагента XDH в каждую лунку в планшете для анализа ксилозы.
- С помощью пипетки, передавать 20 мкл аликвоты гидролизата из реактора 96-луночного планшета в смесительный пластины. Пипеткой с верхнего участка скважин, чтобы избежать твердых частиц биомассы и остаточную жидкость угловых скважин. Смешайте растиранием в течение не менее 10 циклов.
- С помощью пипетки, передавать 110 мкл стандартов сахара, в двух экземплярах, на угловых скважин разбавления пластины.
- С помощью пипетки, передавать 20 мкл аликвоты из разведения пластины к глюкозы и ксилозы анализа пластин. Смешайте растиранием.
- Инкубируйте глюкозы и ксилозы Планшеты при комнатной температуре в течение 30 мин. Осторожно разорвать любые поверхностные пузыри, прежде чем читать. Тепловой пистолет кратко прошел по поверхности пластины хорошо работает.
- Использование ультрафиолетового / видимый 96-а планшетов, установите измеренное волны 510 нм, чтобы записать и абсорбцию против холостой пробы.Это измерение контролирует образование quinonimine, которое пропорционально концентрации глюкозы. Концентрацию глюкозы рассчитывается по калибровочной кривой, основанной на стандартах калибровки, полученных в 1.3.1.
- Использование ультрафиолетового / видимый 96-луночный планшет-ридер, установить измеренную длину волны 340 нм и записать поглощение. Это измерение контролирует снижение NAD + к NADH, которое пропорционально концентрации ксилозы. Концентрация ксилозы рассчитывают по калибровочной кривой на основе калибровочных стандартов, подготовленных в 1.3.1.
Определение 2. Высокая пропускная способность Общая лигнина и лигнина мономерных звеньев, используя pyMBMS 28
- Базовые приготовления
- Измельчить и извлечь биомассы, используя методы, описанные в шагах 1.1.1, 1.1.6-1.1.8 и. Это включает в себя измельчение и извлечение из набора стандартов для использования в качестве экспериментальных управления.
Примечание: pyMBMS измЗЛЫ не размера частиц зависит, так что если только с помощью протокола pyMBMS, подготовка биомассы должны проводиться, чтобы образец, чтобы соответствовать в держатель образца, <4 мм. - С помощью небольшой лопаточки Отказаться примерно 4 мг (3 до 5 мг предпочтительнее) подготовленной биомассы в 80 мкл чашки из нержавеющей стали предназначен для автоматического пробоотборника.
- Убедитесь, что по крайней мере 10% из анализируемых образцов стандарты управления, такие как те, которые доступны из Национального института стандартов и технологий (сахарного тростника жома-8491; тополя 8492; сосна 8493, или пшеничной соломы, 8494). Стандарт также может быть любой вид, аналогичные анализируемых образцов, которые уже были охарактеризованы с помощью стандартных методов.
- Случайно загрузить образцы в авто-сэмплер чашках, с использованием пинцет, чтобы избежать ошибок, связанных с возможным спектрометра дрейфа с течением времени. Примечание: Типичный рандомизации проб будет включать измерение всех образцов один раз, а затем повторного рандомизациипорядка образцов для измерения дубликата. Рандомизации программы доступны в Интернете.
- Используя стандартный перфорации, вручную производят диски стеклянный фильтр с типа А / Д стекловолокна листов, без связующего. Держите круглый стекловолокна фильтр с помощью пинцета, центр его на чашку для образца, и нажмите на образце с помощью 3.5 мм Allen ключ, чтобы ограничить материал в каждой чашке во время эксперимента.
- Измельчить и извлечь биомассы, используя методы, описанные в шагах 1.1.1, 1.1.6-1.1.8 и. Это включает в себя измельчение и извлечение из набора стандартов для использования в качестве экспериментальных управления.
- Инструментальная протокол
- Калибровка масс-спектрометра с использованием известного стандарт, интенсивности пиков во всем диапазоне соединений, которые могут существовать для экспериментальных образцов. Для типичных образцов биомассы, использовать перфтортрибутиламин (PFTBA).
- Установите расход газа гелия несущей к 0,9 л / мин, используя газовый расходомер.
- Установка автоматического пробоотборника печи до температуры пиролиза 500 ° С и температурой интерфейса до 350 ° С с использованием программного обеспечения автоматического пробоотборника. Примечание: 1/8 "из нержавеющей стали нагревалилинии передачи, завернутые в нагревательной ленты, которая соединяет автоматической пипетки на масс-спектрометре управляется с помощью контроллера тепла при 250 ° С.
- Начните сбор данных на масс-спектрометре и подождите не менее 60 секунд, чтобы получить достаточные данные для сбора фоне спектров.
- Начните автоматизированный метод автоматического сэмплера с спецификациями 2.2.2. Примечание: На авто-сэмплер падает каждый образец индивидуально в авто-сэмплер печи. Общее время сбора данных примерно 1,5 мин; Однако, пиролиз типичного 4 мг образца завершается через 30 сек.
- Запись общее содержание ионов (TIC) каждого образца с использованием средств массовой программное обеспечение спектрометра при скорости сканирования 0,5 сек. Запись интенсивности между м / г от 30 до 450.
Примечание: Типичные соединения биомассы использовать мягкую ионизацию на 17 эВ. Прибор может записывать большие интервалы из м / г от 1 до 1000; Однако, скорость сканирования будет ограничена мощностью процессора компьютера. - Удалить фон из спектров с помощью маNual повышения функцию в программном обеспечении. Примечание: Часть 60 сканирование базовой в начале сбора данных используется для расчета среднего значения фона. Это среднее спектры фон удаляется из экспериментальных спектров образца автоматически программным обеспечением масс-спектрометра.
- Импорт единый текстовый файл, созданный столбец массовой программного обеспечения спектрометра, содержащей спектральные данные для каждого образца, в базе данных программы и объединить все образцы в одной базе данных. Добавить применимое метаданные таблицы. Импорт данных в формате с (таблица / CSV-файл) в статистическом пакете программного обеспечения и означает нормализации спектров для учета изменения в пиролизованного массы образцов.
- Использование статистического пакета программного обеспечения для выполнения анализа главных компонент (РСА) с использованием спектральных данных для анализа группировку реплицированных стандартных образцов, используемых при измерениях, а также оценить какие пики являются неотъемлемой частью классификации химическихсоединения в нагрузках участок 28.
Примечание: PCA группы образцов, основанных на сходстве их спектров, и позволяет проверка стандартов для оценки погрешности эксперимента из-за приборной дрейфа во время бега. - Для расчета лигнина сирингиловых (S) / guaiacyl (G) отношение, суммировать районах S пиков (м / Z = 154, 167, 168, 182, 194, 208 и 210) и разделить на сумму G пиков при 124, 137, 138, 150, 164, 178 и.
- Чтобы вычислить общее содержание лигнина, сумма лигнина пики с м / Z = 120, 124, 137, 138, 150, 152, 154, 164, 167, 178, 180, 182, 194, 210 и.
- Рассчитать поправочный коэффициент для масштабирования измерения pyMBMS стандартному способу для оценки общего лигнин, таких как Класона лигнина. Разделите значение лигнина Класона индивидуального стандарта на общее содержание лигнина, измеренного для этого стандартного образца с использованием pyMBMS.
- Примените этот поправочный коэффициент для всех видов как-в наборе данных. Повторите для каждого вида биомассы анализируемого. NOTE: Поправочный коэффициент может существенно различаться в зависимости от S / G биомассы анализируемого.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Комбинированный эффект термохимической предварительной обработки и последующего ферментативного осахаривания измеряется как функция массы глюкозы и ксилозы, опубликованном в конце анализа. Результаты представлены в терминах мг глюкозы и ксилозы, опубликованным на грамм биомассы. Это резко контрастирует с данными из ходе лабораторных анализов, которые, как правило, сообщается как процент теоретического на основе анализа состава исходного материала. Как это еще не практично, чтобы провести анализ состава на тысячи образцов в неделю, данные представлены как лучше уровнях конверсии по массе. Это позволяет разумной оценки образца тех пор, пока сравнения между близкородственных образцов биомассы и состава образцов не изменяется слишком много.
Основная цель анализа заключается в оценке относительной разницы в сопротивлении завод клеточной стенки в сочетании термохимической / ЭнзимATIC осахаривания по целому ряду отдельных вариантов. Стоит отметить, что анализ не пытаться оптимизировать любое из условий, используемых для осахаривания. В самом деле, для предварительной обработки серьезности условий значительно неоптимальным для того, чтобы расширить спектр чувствительность анализа, ориентации конечного конверсионного выхода 50% до 70% от теоретической. Условия предварительной обработки на или вблизи оптимального подтолкнет все образцы высокой конверсии, значительно сокращается динамический диапазон анализа. И наоборот, фермент нагрузка значительно больше, чем обычно сообщалось ходе лабораторных варок. Опять же, цель метода не найти лучший фермент или свести к минимуму затраты фермента, но для измерения сопротивляемости разрушению клеточных стенок конвертации и использования очень высокие нагрузки ферментов удаляет изменчивость из анализа.
И наконец, важно понимать, что изменчивость в общем анализе значительно выше, чем сообщалось в BENCч широкомасштабная работа. Типичные ошибки стандартные около 8%, хотя диапазон гораздо шире. Это просто природа малого, ПВТ исследований. Пипетирование и весом ошибки пропорционально выше в мкл и мг масштабе, в виде испарений и конденсации потери. Биомасса неоднородность становится очень большой переменной, когда анализируя несколько порядков меньше частиц в каждом образце, т.е. 5 мг против многократного г. В колориметрические анализы используются для определения глюкозы и ксилозы хорошо коррелируют с результатами ВЭЖХ; Однако, в то время как связанный с ферментом анализы для анализа сахара быстро и может быть осуществлена параллельно, они не так точно, как аналитических методов, таких как ВЭЖХ, вводя еще один слой неточности (рисунок 1).
В связи с все выше соображений, результаты следует интерпретировать и сообщил в определенных пределах только. Данные должны быть рассмотрены в целых наборов, а не как отдельных образцов. Реплики требуются для MEAningful результаты. Тенденции и выбросы являются значимыми, но единичные результаты не являются. Сравнения лучше всего сделать в одиночных экспериментальных наборов. Сравнения по всей временно или пространственно разделенных кампаний требуют чрезвычайно жесткий контроль и тщательного изучения, чтобы быть значимым. ПВТ данные не сопоставимы с верстака или другой масштабные данных. Тенденции отслеживать между ПВТ и других масштабах, но прямые сравнения образец не дают одинаковые результаты.
Представление данных, как правило, попадает в сравнении тенденции, выбросы, или суб-популяций / вариант. Примером тенденций обследование непокорности 755 природных вариантов тополя отобранных в широком диапазоне в Тихоокеанском Северо-Западе США 19. Упорство этих образцов рассчитывают относительно их относительным содержанием лигнина и сирингиловых / guaiacyl как определено pyMBMS. Результаты показывают, что в S / G поднимается, неподатливость уменьшается, пока не отношением S / G приблизительно 2, где неподатливость Improvement выравнивается (рисунок 2). Выбросы могут быть четко видно на рисунке 3, где ген Pt4CL1 был вниз регулируется в тополь. Несколько сотен сортов были обследованы и некоторые из них явно увеличился в непокорности, о чем свидетельствует снизилась выпуска сахара. Рисунок 4 изображает исследование, в котором выращивали несколько различных сортов пшеницы соломы на нескольких достопримечательностей в течение двух лет и урожай после нескольких изменений в условиях роста , в результате чего 20 различных популяций на основе комбинаций указанных выше переменных. Эти образцы множества легко отличить и указать положительные и отрицательные переменные для непокорности. На рисунке 5 показан как pyMBMS может быть использован для оценки изменений в составе клеточной стенки. Масс-спектральный фрагменты отнесены к различным мономеров лигнина (таблица 1). При сравнении образца с высокой лигнина против высоким содержанием углеводов, различия в спектральных данных очевидны. Тон использует данные pyMBMS связанных с анализа главных компонент (PCA), показан на рисунке 6. В этом примере, образцы классифицируются в соответствии с низкой или высокой азотных удобрений. Лигнин и углеводов содержание выровнять обратно вдоль PC1. Использование основного компонента нагрузок участка может помочь в выявлении которых химические черты того объяснено в десятки классификации участка, а также с разъяснением какие черты меняются между образцом кластеров.
Рисунок 1: Сравнение глюкозы и ксилозы количественного использованием высокой пропускной колориметрические анализы против ВЭЖХ 9. Сравнение глюкозы и ксилозы обнаружения проводили с использованием ксилозы дегидрогеназы (XDH, верхняя панель) и глюкозоксидазный / пероксидазы (GOPOD, нижняя панель) с высокой пропускной колориметрические ферментативные связаны анализы и высокопроизводительные лiquid хроматографии.
Рисунок 2: Упорство тополя клеточных стенок в зависимости от сирингиловых чтобы guaiacyl (S / G) содержание лигнина 9 увеличения сопротивления, когда тополя клеточных стенок в зависимости от сирингиловых чтобы guaiacyl (S / G) содержание в фракции лигнина имеет. наблюдается и сообщается. 755 тополя образцы той же тополя сорта были приняты в течение нескольких сотен миль леса в Северной Америке Тихоокеанском Северо-Западе и скрининг на глюкозы и ксилозы выпуска после термохимической предварительной и ферментов осахаривания. Результаты в виде зависимости от отношения сигнал / G в клеточной стенке лигнина как определено pyMBMS. Упорство уменьшается с увеличением не S / G примерно до 2, где она остается постоянной при более высокой S / G. Теоретические значения выхода основаны на BESC "стандартной" тополя и предоставляются в справочниксе для сравнения.
Рисунок 3:. Непокорности в вниз регулируется Pt4CL1 выражения в тополиный пух-регулирование гена Pt4CL1 в тополя в результате небольшим изменением в непокорности клеточной стенки между клонами, однако несколько резко увеличились варианты непокорности легко идентифицируются. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть больше Версия этой фигуры.
Рисунок 4: упрямство в различных wheatstraw населения Последствия типа сорта, сайт выращивания, удобрений и полив результате скорость в четко различимых уровней непокорности.. Различные символы представляют differeнт экспериментальные условия роста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5:. Применение pyMBMS для анализа химических изменений в клеточных стенок растений 28 Пики, обозначенные стрелками являются лигнин фрагменты, и были использованы для оценки (а) высокая лигнина (б) средних лигнина или (C) низкое содержание лигнина.
Рисунок 6:. Основного компонента оценки анализа участок различий в клеточной стенки химии густонаселенных деревьев, выращенных при более высоких и более низких ставок по удобрению 28 (Top) анализ основных компонентоценки график, иллюстрирующий отличный классификацию, и, следовательно, различия в клеточной стенки химии густонаселенных деревьев выросли с более высокими и более низким ставкам оплодотворения. Основной компонент 1 распределяют образцы на базе высшего лигнина (отрицательной) или выше углеводов (положительных) содержание. (Внизу) Основные нагрузки комплектующих выяснить которые изменяют химические компоненты между двумя кластерами образцов в сюжете рекордов. Положительные нагрузки коррелирует с положительными баллов, которые представитель более высоким содержанием углеводов, в то время как отрицательно коррелировали нагрузки выравнивания с негативными оценками и, следовательно, более высоким содержанием лигнина.
| м / г | Молекулярная назначение 30 | S / G / H назначение |
| 94 | фенол | S / G / H |
| 120 | Винилфенол | Н |
| 124 | Гваякол | г |
| 137 | Ethylguaiacol, homovanillin, конифериловый алкоголь | г |
| 138 | Methylguaiacol | г |
| 150 | Vinylguaiacol | г |
| 154 | Syringol | S |
| 164 | Аллил + пропенил гваякол | г |
| 167 | Ethylsyringol, syringylacetone, propiosyringone | S |
| 168 | 4-метил-2,6-диметоксифенола | S |
| 178 | Кониферилового альдегид | г |
| 180 | Кониферилового спирта, syringylethene | S, G |
| 182 | Сиреневый | S |
| 194 | S | |
| 208 | Sinapylaldehyde | S |
| 210 | Sinapylalcohol | S |
Таблица 1:. Пик м / г и задания для лигнина, полученных фрагментов пиролиза, как обнаружено масс-спектрометрии Список типичных соединений, обнаруженных pyMBMS. Молекулярные задания, основанные на Эванса, RJ и TA Милн (1987). Молекулярная характеристика пиролиза биомассы энергетики и топлива 1 (2): 123-137..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ключевые шаги пробоподготовки для получения точной и воспроизводимых данных при проведении высокой пропускной скрининг экспериментов таковы:
Сахар-релиз анализа:
В общем, Образцы готовят в большом диапазоне от нескольких десятков до нескольких тысяч одновременно. Каждый крупный шаг, как правило, осуществляется для всех образцов перед движется вперед с целью минимизации вариаций в подготовке между образцами. Де-крахмальные изначально не было частью протокола и могут быть опущены в некоторых случаях. Дерево образцы керна и senesced травянистые материалы стабильно низким содержанием крахмала и, следовательно, не требуют де-подкрахмаливания, чтобы уменьшить изменчивость. Крахмал является основной проблемой; Однако, в наборами зеленой ткани растений, особенно для больших наборов выборок, где урожай происходит в течение нескольких часов. По мере повышения уровня крахмала в светлое время суток и истощены в темное время суток, уровни крахмала могут значительно варьироваться в секeveral ч и глюкоза из крахмала неотличима от глюкозы из целлюлозы, поэтому, высокий уровень крахмала может привести к измерениям искаженно низких непокорности. Фактическое загрузки фермента на стадии destarching имеет меньшее беспокойство, до тех пор, пока существует достаточно избыточная активность, чтобы удалить всю доступную крахмал в сроки шага гидролиза крахмала. Вариации в конкретных используемых ферментов, время, температура, объемный и перемешивание на стадии удаления крахмала, безусловно, может привести к различиям в уровнях удаления крахмала и ставок и должна быть определена эмпирически, когда это возможно. Наконец, когда упаковка пакетики для извлечения, используйте луженые медные провода. Голые медные провода может вызвать нежелательные химические реакции с раствором фермента, давая ложные ценности сахара. Медные луженые решен этот вопрос в то время как проволока из нержавеющей стали, не было достаточно податливый, чтобы сохранить пакетики плотно закрытым.
В соответствии сокращения размера биомассы имеет решающее значение для AccuДанные ставки по двум причинам: 1) Мелко измельченный биомассы, в то время как более легко и последовательно отказаться, также легче усваивается, чем крупнозернистого материала. 2) Биомасса, которая является слишком грубой может засорить бункеры, в результате чего недостаточной материала или, если помеха лишь частично блокирует отверстие, он может действовать как сито и только позволяют мелкие частицы через, уменьшая наблюдаемую Упорство образца. Если слишком мало биомассы содержится в бункерах, оно может покрывать стороны бункера, вызывая робота взять на себя бункер пуст, и образец будет пропущен в процессе выдачи. Кроме того, низкие уровни биомассы может способствовать преувеличенным образца неоднородности, особенно в более плотные частицы (например, кожуры), как правило, сито в нижней части конуса и получить обойтись в первую очередь. При менее 50 мг материала доступна, анализ еще может быть проведена; Однако образцы должны быть ручной взвешивали. Тем не менее, результаты ручной весом более разнообразны, чем те, от ограбленияушные взвешивания.
Фактическое количество биомассы требуется для подготовительных этапов не четко определены. Мы предложили 250 мг в качестве разумной отправной точкой, однако, каждый образец биомассы имеет различные характеристики относительно потерь из-за обработки, шлифовки и извлечения, а также проводится в бункерах или дозируется воспроизводимо. Неоднородность биомассы для разных типов и даже в пределах одного типа исключает более определенный протокол. Желающим реализовать эти методы анализа просто нужно определить многие из этих переменных для себя, хотя опыт делает его легче.
Еще один шаг, который можно ввести ошибку, смешивая в микротитрационных планшетах, которые, как известно, трудно и имеет решающее значение в этих анализах по нескольким причинам. Раствор фермента использовали концентрируют и расслаивается при добавлении в лунки, фермента, лимитирующего доступности биомассы. Как осахаривания доходов, то SuGARS выпущен также может наслаиваться и сосредоточиться вблизи биомассы и в зависимости от глубины отбора проб, сахар анализы могут быть искусственно высокой или низкой. Вот почему важно, чтобы смешать образцы после добавления фермента и фермента осахаривания, позволяя тщательное смешивание ферментов с биомассой для осахаривания даже и равномерным распределением полученных сахаров для обеспечения последовательного анализа сахара. В пластинах, которые не содержат биомассы, таких как разбавление или планшеты для анализа, смешивания повторным пипетированием (тритурационного) оказалась гораздо выше, чем трястись. Однако, как решения в этом протоколе есть переменные плотности и уровней частиц, скорость пипетирования и по вертикали расположение кончика в столб жидкости имеет решающее значение. Если скорость слишком быстро, низкую точность из-за кавитации (аспирации) и задержки жидкости в наконечнике (дозирования) может произойти. Если наконечник слишком глубоко в скважине, биомасса может засорить наконечник или наконечник может быть прижата к нижней, предотвращая точную стремление, иболее внешняя поверхность для жидкости зацепиться и перенос к следующему шагу. Последний вопрос может быть несколько смягчены контроля скорости вывода наконечник, а медленнее удаления наконечник позволяет жидкости быть удалены с объемной раствора поверхностного натяжения. Если кончик вывод является слишком медленным, пипеткой жидкость может ползать назад в объеме раствора, а также. Частицы биомассы также имеют тенденцию цепляться за советы и становятся переданы для разведения пластины, где они могут закупорить наконечник во время смешивания или передачи в планшеты для анализа, создания неточности в объемах анализируемой пробе. Эти частицы также могут влиять на спектроскопического анализа планшеты для анализа, если они закрывают световой луч в течение чтения.
В соответствии сроки разработки цвета имеет решающее значение для GOPOD и XDH анализов. Цвет-развитие должно быть разрешено идти к завершению; Однако цвет GOPOD анализа, как правило, будет продолжать расти после завершения и NADH, генерируемого XDH анализа медленноуменьшается из-за спонтанного окисления NADH. В результате синхронизации изменчивость может привести к несогласованным сопоставление данных между отдельными пластинами. Шаги анализа должны быть тщательно контролироваться, так как перебои из-за проблем аппаратного или программного обеспечения может привести к большим различиям в разы анализа. Использование стандартов сахара и стандартных скважин управления биомасса в каждой пластине может помочь уменьшить это в некоторой степени.
PyMBMS:
Стандарты должны быть тщательно рассмотрены для pyMBMS экспериментов для сравнения стандартных влажных химических методов. В силу различий в составе лигнина (S / G коэффициентов) видов биомассы, поправочный коэффициент должен быть определен с использованием репрезентативного стандарта, который того же вида, в экспериментальном образце. Если нет соответствующего стандарта доступны, различия в концентрации лигнина можно сравнить с использованием интенсивности предшественников лигнина непосредственно. Высокая S / G соотношение (более ~ 3.5) может привести к завышению лСодержание ignin по pyMBMS. Это вызвано склонностью к S лигнина быть преимущественно выпущен в стандартных условиях, используемых в этом способе. Кроме того, количество образца, необходимое для измерения pyMBMS зависит от типа биомассы, используемой. ЛИГНИНА и лигнин модельных соединений требует меньше материала (0,1 мг), а с использованием больших аликвот образца может насытить детектор.
Еще одним важным шагом в процессе PyMBMS осторожны настройка инструмента с известным стандартом, таким как перфтортрибутиламин (PFTBA) перед каждым экспериментом. PFTBA содержит молекулярные пики по всему спектру типичной биомассы и, следовательно, позволяет равномерное тюнинг инструмент между опытов. Средняя часть спектров PFTBA настроен таким образом, что м / г и 131 м / г 219 примерно 50% от интенсивности м / Z 69. Эта настройка используется, чтобы подчеркнуть типичные пики видны под мягкой ионизации (17 эВ) используется чтобы свести к минимуму фрагментации ионов низких масс, что с ANNOT быть легко идентифицированы.
Следует отметить, что эти методы не аналитические методы точного количественного определения аналитов. Скорее всего, эти методы с высокой пропускной предназначены для скрининг большого биомассы устанавливает для выявления тех, кто обладает желаемых химических черты. Эти методы должны быть использованы только для скрининга, рейтинг, и корреляции образцов в наборе данных. Наборы данных не могут быть непосредственно по сравнению, когда собираются на разные дни в связи с источников вариации, такие как инструментального дрейфа, изменения в активности фермента, содержание влаги окружающей среды в биомассе в связи с изменением влажности, колебаний температуры, и различия в советы и поглощения плит большим , Кроме того, предварительная обработка используется в протоколе пробоподготовки не является оптимизированной предварительной обработки стратегии, а был специально разработан, чтобы быть неоптимальным. Это позволяет тонкие различия между растениями, которые будут более эффективно выяснены.
jove_content "> Основное преимущество принятия методов высокой пропускной том, что многие больше образцов могут быть измерены в тот же период времени 18. Например, общий метод анализа углеводов, произведенные во время кислотного или ферментативного осахаривания является использование высокопроизводительных жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Селиг и др., утверждают, что повсеместно гидролиз двухступенчатый кислота, хотя и довольно полезным и первостепенное значение для количественной оценки структурных углеводов, ограничивает исследователей, чтобы быть в состоянии оценить примерно 25 образцов в неделю 9. В то время как аналитическая приборы используются в высокой пропускной методологий не может обеспечить чувствительность стандартной методике, как ВЭЖХ, быстрый анализ дает исследователям роскошь быть в состоянии оценить большое количество образцов. Кроме того, методы высокой пропускной часто разукрупненных экспериментальных протоколов, сокращение использования расходных, и поэтому уменьшение затрат и экспериментальные отходов.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biomek FX Automated Workstation | Beckman Coulter | Biomek FX | Automated Liquid Handler |
| Wiley mill | Thomas Scientific | 3375E15 (Model 4), or 3383L20 (Mini-mill) | |
| anti-static bags | Minigrip* | MGST4P02503 | 2.5x3", multiple suppliers available |
| tin-coated copper wire | McMaster-Carr | 8871K84 | 0.016" diameter, bend-and-stay wire |
| tea-bags | Herbco | press n' brew teabags | 3.5x5 inches |
| gluco-amylase | Novozymes | Spirizyme Fuel | |
| alpha-amylase | Novozymes | Liquozyme SC DS | |
| sodium acetate trihydrate | any chemical supplier | reagent grade | |
| acetic acid | any chemical supplier | reagent grade | |
| 190 proof (95%) ethanol | any chemical supplier | reagent grade | |
| hoppers | Freeslate | ||
| 96-well C-276 Hastelloy plates | Aspen Machining (Lafayette, Colorado) | N/A (custom built) | |
| 1/8” soldering iron tip | Sears | ||
| silicone-adhesive backed Teflon tape | 3M | 5180 | 3" wide (36-yard rolls) |
| enzyme solution | Novozymes | Cellic CTec2 | |
| citric acid monohydrate | any chemical supplier | ||
| trisodium citrate dihydrate | any chemical supplier | ||
| disposable, polystyrene 96-well plates | Greiner Bio-One | 655101 | or equivalent; multiple suppliers available |
| glucose oxidase/peroxidase | Megazyme | K-Gluc | Megazyme D-glucose assay kit |
| xylose dehydrogenase | Megazyme | K-Xylose | Megazyme D-xylose assay kit |
| glucose standard solution | Megazyme | K-Gluc | Megazyme D-glucose assay kit |
| xylose standard solution | Megazyme | K-Xylose | Megazyme D-xylose assay kit |
| stainless steel sample cups | Frontier Laboratories | PY1-EC80F | |
| glass fiber sheets | Pall | 66227 | 8x10" sheets; circles punched with standard hole punch |
| Sugarcane Bagasse Whole Biomass Feedstock | NIST | 8491 | |
| Eastern Cottonwood (poplar) Whole Biomass Feedstock | NIST | 8492 | |
| Monterey Pine Whole Biomass Feedstock | NIST | 8493 | |
| Wheat Straw Whole Biomass Feedstock | NIST | 8494 |
References
- U.S. Billion-Ton Update: Biomass Supply for a Bioenergy and Bioproducts Industry. Perlack, R. D., Stokes, B. J. , Oak Ridge National Laboratory. Oak Ridge, TN. (2011).
- Henry, R.
- Henry, R. J. Evaluation of plant biomass resources available for replacement of fossil oil. Plant Biotechnol. J. 8 (3), 288-293 (2010).
- Furtado, A., et al. Modifying plants for biofuel and biomaterial production. Plant Biotechnol. J. 12 (9), 1246-1258 (2014).
- Sluiter, J. B., Ruiz, R. O., Scarlata, C. J., Sluiter, A. D., Templeton, D. W. Compositional analysis of lignocellulosic feedstocks. 1. Review and description of methods. J. Agric. Food Chem. 58 (16), 9043-9053 (2010).
- Lupoi, J. S., Singh, S., Simmons, B. A., Henry, R. J. Assessment of Lignocellulosic Biomass Using Analytical Spectroscopy: an Evolution to High-Throughput Techniques. Bioenerg. Res. 7 (1), 1-23 (2014).
- Lapierre, C., Monties, B., Rolando, C. Thioacidolysis of lignin: comparison with acidolysis. J. Wood Chem. Technol. 5 (2), 277-292 (1985).
- DeMartini, J. D., Studer, M. H., Wyman, C. E. Small-scale and automatable high-throughput compositional analysis of biomass. Biotechnol. Bioeng. 108 (2), 306-312 (2010).
- Selig, M. J., et al. High throughput determination of glucan and xylan fractions in lignocelluloses. Biotechnol. Lett. 33 (5), 961-967 (2011).
- Selig, M. J., et al. Lignocellulose recalcitrance screening by integrated high-throughput hydrothermal pretreatment and enzymatic saccharification. Ind. Biotechnol. 6 (2), 104-111 (2010).
- Studer, M. H., De Martini, J. D., Brethauer, S., McKenzie, H. L., Wyman, C. E. Engineering of a high-throughput screening system to identify cellulosic biomass, pretreatments, and enzyme formulations that enhance sugar release. Biotechnol. Bioeng. 105 (2), 231-238 (2009).
- Gjersing, E., Happs, R. M., Sykes, R. W., Doeppke, C., Davis, M. F. Rapid determination of sugar content in biomass hydrolysates using nuclear magnetic resonance spectroscopy. Biotechnol. Bioeng. 110 (3), 721-728 (2013).
- Templeton, D. W., Sluiter, A. D., Hayward, T. K., Hames, B. R., Thomas, S. R. Assessing corn stover composition and sources of variability via NIRS. Cellulose (Dordrecht, Netherlands). 16 (4), 621-639 (2009).
- Tucker, M. P., et al. Fourier transform infrared quantification of sugars in pretreated biomass liquors. Appl. Biochem. Biotechnol. 84-86, 39-50 (2000).
- Wolfrum, E. J., Sluiter, A. D. Improved multivariate calibration models for corn stover feedstock and dilute-acid pretreated corn stover. Cellulose (Dordrecht, Netherlands). 16 (4), 567-576 (2009).
- Ona, T., et al. Non-destructive determination of wood constituents by Fourier-transform Raman spectroscopy. J. Wood Chem. Technol. 17 (4), 399-417 (1997).
- Ona, T., Sonoda, T., Ohshima, J., Yokota, S., Yoshizawa, N. A rapid quantitative method to assess eucalyptus wood properties for kraft pulp production by FT-Raman spectroscopy. J. Pulp Pap. Sci. 29 (1), 6-10 (2003).
- Hames, B. R., Thomas, S. R., Sluiter, A. D., Roth, C. J., Templeton, D. W. Rapid biomass analysis. New tools for compositional analysis of corn stover feedstocks and process intermediates from ethanol production. Appl. Biochem. Biotechnol. 105-108, 5-16 (2003).
- Studer, M. H., et al. Lignin content in natural Populus variants affects sugar release. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (15), 6300-6305 (2011).
- Chen, M., Zhao, J., Xia, L. Comparison of four different chemical pretreatments of corn stover for enhancing enzymatic digestibility. Biomass Bioenergy. 33 (10), 1381-1385 (2009).
- Davison, B. H., Drescher, S. R., Tuskan, G. A., Davis, M. F., Nghiem, N. P. Variation of S/G ratio and lignin content in a Populus. family influences the release of xylose by dilute acid hydrolysis. Appl. Biochem. Biotechnol. 129-132, 427-435 (2006).
- Li, X., et al. Lignin monomer composition affects Arabidopsis cell-wall degradability after liquid hot water pretreatment. Biotechnol. Biofuels. 3, 27-33 (2010).
- Lupoi, J. S., et al. High-throughput prediction of eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using multivariate analysis: a comparison between mid-infrared, near-infrared, and Raman spectroscopies for model development. Biotechnol. Biofuels. 7, 93 (2014).
- Lupoi, J. S., Smith, E. A. Characterization of woody and herbaceous biomasses lignin composition with 1064 nm dispersive multichannel Raman spectroscopy. Appl. Spectro. 66 (8), 903-910 (2012).
- Sun, L., et al. Rapid determination of syringyl:guaiacyl ratios using FT-Raman spectroscopy. Biotechnol. Bioeng. 109 (3), 647-656 (2012).
- Lupoi, J. S., et al. High-throughput prediction of Acacia and eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using FT-Raman spectroscopy and partial least squares modeling. Bioenerg. Res. in press, (2015).
- Sykes, R., Kodrzycki, B., Tuskan, G., Foutz, K., Davis, M.
- Sykes, R., et al. Ch. 12. High-Throughput Screening of Plant Cell-Wall Composition Using Pyrolysis Molecular Beam Mass Spectroscopy. Biofuels: Methods and Protocols. Mielenz, J. R. 581, 169-183 (2009).
- Decker, S., et al. Ch. 17. Reducing the effect of variable starch levels in biomass recalcitrance screening). Biomass Conversion. Himmel, M. E. 908, Humana Press. 181-195 (2012).
- Evans, R. J., Milne, T. A.
