Introduction
Olmayan yenilenebilir yakıtlar ve bunlarla ilgili ürünlerin düşüşler küresel kaynağı olarak, bilim adamları bitki kökenli kaynaklardan 1 benzer yakıtlar ve kimyasallar oluşturmak için meydan oylandı. Bu çalışmanın önemli bir yönü, bitki türleri biyoyakıt ve biyomalzeme 2,3 üretilmesi için uygun olabilecek belirlemektir. Tipik olarak, bu besleme stokları lignin, selüloz ve hemiselüloz içeriği için değerlendirilir; ile de veya sonradan enzim sakarifikasyon olmadan, termal, mekanik ve / veya kimyasal ön yoluyla yapısızlaştırma (rekalsitrantların) kendi duyarlılık olarak. Daha detaylı bir analizi gerekiyordu lignin ve yarı selüloz parçacığına spesifik bileşim olarak uygun enzim aktivitelerini belirlemek için kullanılır. Özünde istenilen emtia biyokimyasal veya termokimyasal dönüşüm için ideal özelliklere sahip olmayan bitkilerin transgenik değişiklikler pot bir ölçüde genişletilmiş kaynağı ile araştırmacıların sağladıential hammaddeler 4. Küçük bir numune kümesi için oldukça yararlı ise, bir bitkinin kimyasal özelliklerini ölçülmesi için standart analitik metotlar, örnekler 5-7 yüzlerce ya da binlerce süratle taranması için uygun değildir. Burada tarif edilen yöntemler, HTP hızlı ve verimli bir termokimyasal ve / veya enzimatik degradasyona hücre duvarı rekalsitrantların değişiklikler için biyokütle varyantlarının çok sayıda değerlendirmek için geliştirilmiştir.
Bu HTP tarama deneyleri burada tarif edilen dönüşüm ya da verim en üst düzeye çıkarmak için tasarlanmış değil anlamak için önemlidir. Amaç, ilgili biyokütle örneklerinin içsel rekalsitrantların nispi farklılıkları belirlemektir. Bunun bir sonucu olarak, analiz adımları birçok amacı, maksimum dönüşüm hızını veya derecesini elde etmek için bir "tipik" biyokütle dönüşüm deneylerinde, farklıdır. Örneğin, daha düşük ön-muamele şiddeti ve daha kısa enzim hidrolizinden kat farklılık en üst düzeye çıkarmak için kullanılırörnekler arasında daha olgun. Pek çok durumda, nispeten yüksek enzim yükler önemli ölçüde sonuçlan saptıracaktır olabilir enzim etkinliği deneysel varyasyon, bağlı farkları azaltmak için kullanılır.
Bitki hücre duvarlarına ve monomerik şekerlerin bileşimin belirlenmesi için hızlı teknikler enzimatik sakarifikasyon kızıl ötesi gibi titreşim spektroskopisi gibi robotik, özel, termo kimyasal uyumludur, 96 gözlü levhalar, ve standart laboratuar yöntemleri 8-11 arasında modifikasyon ve enstrümantal protokolleri (şunlardır açığa çıkan (IR), yakın kızıl ötesi (NIR) ya da Raman) ve nükleer manyetik rezonans (NMR), 12-17. Bu metodolojiler, deneysel azalmalara neden yüksek selüloz veya düşük lignin içeriğinin, ya da en yüksek glikoz, ksiloz, etanol vermesi beklenen olanlar, vb Bu yöntemler biyokütle ve sarf küçük miktarlarda istihdam downscaled analizler sağlamıştır ile hammaddeleri izole anahtarıdır Gider 18 9, kavak 8,10, şeker kamışı küspe 8 ve switchgrass 8 gibi popüler besleme stokları, başarılı bir şekilde, bu HTP yöntemler kullanılarak değerlendirilmiştir.
Toplam lignin ve lignin monomerik kompozisyon da yaygın biyokütle özellikleri ölçülür. Lignin içeriğindeki azalmalar polisakkaritler 19,20 enzimatik sindirilme artırmak için gösterilmiştir. Lignin monomerik oranı (genellikle syringly / guaiacyl (S / G) içerik olarak rapor) bu rolü soruşturma altında hala bitki hücre duvarının yıkılmasında oynar. Bazı raporlar belirttiler S / G azalmalardiğer çalışmalar zıt eğilim 19,22 açıklayacak ederken oranı hidroliz 21 aşağıdaki artan glikoz verimi yol açtı. Lignin ve monomerleri değerlendirmek için yüksek kapasiteli yöntemleri titreşim çok değişkenli analiz ile birleştiğinde spektroskopisi (IR, NIR ve Raman 23-26) ve piroliz moleküler ışın kütle spektrometresi (pyMBMS) 27,28 sayılabilir.
Biyokütle taranması için HTP yöntemleri geliştirirken, birkaç ayrılmaz hususlar göz önünde tutulması gerekir. Bir önemli yönü yönteminin karmaşıklığı olduğunu. Teknik için gerekli beceri düzeyi nedir? Kemometrik analizler, örneğin, inşa değerlendirilmesi ve tahmini modeller korumak için özel beceriler gerektirir. Standart yöntemler istenmeyen hazırlayıcı veya veri analiz adımları sergilemek veya zehirli reaktifler kullanır. Modellerin geliştirilmesi, yeni veri modelin sağlamlığı artırmak için zamanla modele dahil edilmiştir devam eden bir süreçtir. Başka bir consideration maliyet tasarrufu ve önerilen yüksek verimlilik yöntemlerinin deneysel analiz sürelerini azalmıştır. Yöntem oldukça hızlı, ancak oldukça maliyetli ise, çok sayıda laboratuar kabul etmek için uygulanabilir bir teknik olabilir. Bu yazıda gösterildiği yöntemler verim özelliklerini güçlendirmek için modifiye standart teknikler türevleridir. Bu protokoller nicel öngörü modellerinin geliştirilmesi gerektirmeden ilgi biyokütle özelliklerini ölçmek. Standart modelleri geliştirmek için kullanılan analizleri ile güçlü bir korelasyon sergilerken Bu öngörü yöntemleri beri bu tekniklerin önemli bir nitelik olduğunu, aslında numunelerde ilgi miktarını ölçmek gibi doğru değildir. Esasen standart tezgah ölçekli analitik yöntemlerin sürümleri küçülttüm Kullanılan yöntemler ise doğruluk ve hassasiyet hız ve performans için işlem görmektedir. Çoğunlukla, bu sonucun küçük hacimli pipetleme ve tartı yüksek hatalar nedeniyle; ve artan sörneklem büyüklüğü olarak geniş heterojenite azalır. Büyük örnek setleri ekranlı ve mukayese edilebilir olsa ayrı kampanyalar arasında ve tezgah ölçekli sonuçlarına karşılaştırmalar yaparken, büyük bir özenle olunmalıdır.
En zaman alıcı adımlar biyokütle fiziksel manipülasyon içerir. Taşlama örnekler örnekler arasındaki değirmen temizleme dahil numune başına birkaç dakika sürebilir. Elle, boşaltma ve temizleme bunker yükleme ve doldurma ve çay poşetleri ve örnek çanta boşaltma da çok emek yoğundur. Her adım bir dakika veya daha fazla sürebilir iken, numunelerin yapıyor binlerce birçok saatler hatta günler sürebilir. Robotlar yaklaşık 3 ila 4 saat veya 6 -1 tabak gün 8 robot biyokütle ile tipik bir reaktör plakasını yükleyebilirsiniz -1. Bu durum, aynı zamanda, test edilecek Çeşidi ve biyokütle miktarı olarak kullanılan hassas parametrelere bağlıdır. Reaktörü su plakaları Benzin, seyreltik asit veya enzim hızlı bir sıvı kotarma robotu kullanılarak yapılır. PBir plaka yığıtı (1 20 reaktör plakalar) için yeniden tedavi tertibatı, soğuma sırasında 1 ila 3 saat sürer, ve demontaj dahildir. Enzim hidroliz 3 gün sürer ve şeker analiz sonuçları tahlil tamamlamak ve okumak için hazırlık süresi yaklaşık 1 saat artı reaktör plaka başına 10 dakika gerektirir. Set Tedavi öncesi ve analiz gün bir haftalık program sürekli olarak haftada ~ 800 1000 örnekleri tahlil insan bileşeni için tek saat ve hafta sonu çabalarını en aza indirerek, makul bir çalışma programı barındırır ve işlenmesi için izin verir. Maksimum verim çok donanım (robotlar, reaktörler tabak, vb) ve ne kadar "yazılım" (yani, personel) el işi yapmak için kullanılabilir başta nasıl birçok faktöre bağlıdır. Pratik üst sınır 2500 3.000 örnekleri / hafta; Ancak, çıkış 7 gün-bir hafta çalışma ve çok sayıda öğrenci stajyerleri ve teknisyenleri gerektirir. Buna karşılık, HPLC ile 3000 örnekleri sam yaklaşık 125 gün gerektirecektirple analizi artı elle analizden önce reaktörler ve filtreleme numuneleri içine örnekleri tartı ek emek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Glikoz ve Ksiloz Verimi 1. Yüksek verim tayini enzimatik sakarifikasyon 9,29 takiben
- Numune Hazırlama (De-Tutkal, Taşlama, Ekstraksiyon, Ön İşlem)
- Wiley değirmen, bu parçacıklar, bir 20 ağ üzerinden geçmesi (850 um) elek kullanılarak her bir biyokütle, örneğin, en az 300 mg öğütün. Anti-statik fermuarlı üst torba transfer (tipik bar kodlu) ve barkod veritabanına kayıt örneği bilgileri.
- Dikkatle, çay-bag (mürekkep veya işaretleyici kullanmayın, kalemle) önlemek için biyokütle üzerinde uçlarını katlamak için emin olmak, Sallama çaylar sıvayıp bir numaralı yaklaşık 250 mg ya da anti-statik torbasından zemin biyokütle daha ekleyin de-starching ve ekstraksiyon sırasında kayıp.
- Kalay kaplı bakır tel kullanılarak kapalı teabag sarın. Her barkodlu numune için teabag numarasını kaydedin.
- Ticari enzimlerin (tipik haliyle,% 0.25 (v / v) glukoamilazını (~ 1600 AGU / L) 'den de-kolalama enzim çözeltisi hazırlayın% 1.5 (v / v) alfa-amilaz, 0.1 M sodyum asetat (~ 2900 KNU-S / L) (pH 5,0)). Toplu biyokütle gramı başına 16 ml veya 120 çay poşeti örnekleri başına 500 ml hazırlayın. Not: Zemin biyokütleden nişasta çıkarma yeteneğine sahip bir enzim yüklemeler yüklemeleri ve oranlar bir dizi ile sindirmeden sonra nişasta için test ampirik bir şekilde tespit edilmelidir.
- Plastik bir kap içinde, dökme zemin biyokütle 1 gramı başına de-kolalama enzim çözeltisi 16 ml ekleyin. Bir parti de-Tutkal protokolü için, tampon, enzim çözeltisi, 500 ml 120 teabags ekleyin.
- Mümkün olan nişastayı atmak üzere 120 rpm'de, 24 (± 4) saat 55 ° C'de bir çalkalayıcı içinde inkübe edin.
- De-kolalama inkübasyondan sonra, durulama ve 30 dakika için deiyonize su birkaç litre biyokütle ıslatın. Kaskad Sıcak sıvı etanol neden çözelti seviyesinde bir ani ve şiddetli bir artışa neden olabilir çözelti içinde gaz kabarcıklarının darbeleme (oluşumuna neden olabilir buffer tuzlarını yok etmek bu işlemi iki kez daha tekrarlayınekstraksiyon sırasında reaksiyona damar) üzerinden.
- De-kolalı biyokütle ayrıntılı durulama ardından, çıkarılması için Soxhlet sütuna teabags yerleştirin. Resim yüksük Bu aşama için gereklidir.
- % 95 etanol kullanılarak, Soxhlet reflü kurmak ve 24 saat için örnekler ayıklayın.
- Soxhlet reaktörden Sallama çaylar çıkarın ve düz tepsi üzerinde tek kat olarak yayılır.
- Numuneler, bir çeker ocak içinde, bir gece boyunca oda sıcaklığında kurumaya bırakın.
- Sallama çaylar önüne sermek ve orijinal barkodlu anti-statik poşetler kurutulmuş biyokütle dönün.
Not: anti-statik poşetler kullanım özellikleri, biyokütle statik elektriği azaltarak geliştirmeyi etkilidir. Diğer depolama seçeneği kullanıldığı, ek biyokütle nedeniyle depolama kabı kenarına biyokütle yapışan için gerekli olabilir. - Barkodlu hazneye kurutulmuş biyokütle en az 50 mg aktarın (daha fazla malzeme kullanarak doğru karışması için iyidir). Santi-statik çanta ve alıcı huninin barkod doğru örnek izleme sağlamak için olabilir.
- Katı rafları örneklerin sipariş yakından ilgilenerek, robot tartı üzerine yük hazneleri. Kullanılan plakaların sayısına dayalı dağıtım protokolü, tüm örnekleri içeren ve seçmek için yeterli reaktör plakaları yükleyin.
- Robotik aside dayanıklı paslanmaz çelik 96 oyuklu plakalar içerisine (± 0.3 mg) kurutulmuş örneklerin 5 mg ağırlığında. Herhangi bir yerelleştirilmiş varyasyonları en aza indirmek için plaka etrafında dağıtılan her numunenin 3 çoğaltır tartın.
- Tahlil performansını izlemek için iyi karakterize biyokütle standart malzeme 8 kontrol biyokütle örnekleri ekleyin. Birden plakalar için, birden fazla standart biyokütle silosu kullanılması tekrarlanan dağıtım döngüleri boyunca haznede eleme kaynaklanan partikül büyüklüğü kayması en aza indirecektir.
Not: her bir plaka olarak, 3 kez tekrarlanmış, iyonu giderilmiş su ve enzim içeren 4 boşlukları ve 8 contro 24 numune olmalıdırls, daha önce karakterize standart biyokütle kullanarak. Plaka 4 köşe, her 3 köşe kuyuları şeker standartları için ayrılmıştır. - Serseri biyokütle parçacıkları için boş ve şeker standart kuyu kontrol edin ve varsa çıkartın.
- Her bir oyuğa iyonu giderilmiş su, 250 ul ekleyin ve silikon yapışkan sırtlı, politetrafloroetilen (PTFE) bant ile plakaları mühür.
- 1/8 "havya ucu kullanarak, her plaka için her buhar portu (117 toplam) PTFE bandı delmek. Bir kılavuz olarak kapalı reaktör plaka üzerinde yığılmış boş bir levha kullanın ve PTFE filmi hareketini kısıtlamak için.
- Sıkıca üst ve yığının altındaki plaka ve boş levha arasına 0.031 "kalınlığında cam takviyeli PTFE contaları (buhar portlar için delikli önceden delinmiş) ile plakaları Kelepçe. 17.5 dakikada, veya arzu edilen şiddetine bağlı olarak diğer sıcaklık / zaman kombinasyonları için 180 ° C olarak ayarlandı buhar reaktörü kullanılarak numuneleri önceden işleme.
- 50 ° 'ye serin reaktör plakalarıC deiyonize su ile sel.
- Enzimatik Saccharification
- 1.0 M sodyum sitrat, pH 5.0,% 8 (h / h) bir enzim çözeltisi içeren bir enzimatik sakarifikasyon çözelti hazırlayın. Reaktör plaka başına 5 ml hazırlayın. Not: belirli bir stok enzim çözeltisinin etkinliği ve protein içeriğine göre belirlenmelidir gerekli seyreltme.
- Plakalar serin olduğunda, 20 dakika boyunca 1500 xg sallanan bir kova rotor onları santrifüj. Filmi sızdırmazlık çıkarın. Not: Bu plakalar ağır ve santrifüj özellikleri uyumluluk için kontrol edilmelidir.
- Her bir oyuğa (g biyokütle başına 70 mg enzim)% 8 enzim stok çözeltisi, 40 ul ekle.
- Yeni PTFE bandı ile kapatın. Manyetik plaka kelepçe içine kapalı plaka koyun.
- Yavaşça ters çevirerek örnekleri (en az 15 kez) karıştırın ve 70 saat süre ile 50 ° C'de inkübe edin.
- Sakarifikasyon sonucuna zaman çevirerek karıştırın ve 1500 x plakaları santrifüj20 dakika boyunca örn.
- Şeker Deneyi
- 6 glikoz ve 0,014 M sitrat tampon maddesi içinde ksiloz Birleştirilen kalibrasyon standartları 0 ila 0,750 mg / ml arasında değişen (pH 5.0) 'in bir dizi hazırlanması (0, 0.2, 0.3, 0.45, 0.65 ve 0.75 mg / ml tavsiye edilir) ve 0-0,600 mg / ml (0, 0.1, 0.2, 0.35, mi önerilen 0,45 ve 0,6 mg /), sırasıyla glukoz ve ksiloz için.
- Kit talimatlara göre glikoz oksidaz / peroksidaz (Gopod) ve ksiloz dehidrogenaz (XDH) reaktifler hazırlayın.
- Bir pipet kullanarak, reaktör levhanın köşe oyuklara (12, toplam kuyu) bitişik 4 köşe kuyuları ve kenar kuyulardan sıvının 200 ul çıkarın.
- Bir pipet kullanarak, 96 çukurlu bir polistiren düz tabanlı seyreltme plakası, her sıra için deiyonize su, 180 ul dağıtmak. 12 şeker standart ve köşe kuyu suyu katmayın (96 kanal kafasını kullanıyorsanız bu ipuçlarını kaldırın).
- Bir pipet kullanarak, pl glükoz tahlil her oyuğuna 180 ul Gopod reaktif dağıtımyedi.
- Bir pipet kullanarak, ksiloz deney plakasının her oyuğuna 180 ul XDH reaktif dağıtın.
- Bir pipet kullanarak, seyreltme plaka 96 oyuklu plaka reaktörü 20 ul alikotları hidrolizat aktarın. Kuyular üst bölümünden Pipet biyokütle katı ve köşe kuyularda kalan sıvıyı önlemek için. En az 10 döngü ezilerek karıştırılır.
- Bir pipet kullanarak, Seyreltme levhası köşe gözlere, iki kopya halinde, şeker standartları 110 ul transfer.
- Bir pipet kullanarak, glikoz ve iksiloz gibi deney plakası seyreltme plakasından 20 ul alikotları aktarın. Ezilerek karıştırılır.
- 30 dakika için oda sıcaklığında glukoz ve ksiloz deney inkübe edin. Dikkatle okumadan önce herhangi bir yüzey kabarcıkları kırmak. Kısaca plaka yüzeyinden devamlı olarak geçirilmesi bir ısı tabancası ile iyi çalışır.
- Bir morötesi / görünen 96 oyuklu bir plaka okuyucusu kullanılarak, 510 nm'lik dalga boyunda ölçülen ayarlamak ve reaktif boşluğa karşı absorbans kaydedin.Bu ölçüm, glükoz konsantrasyonuna orantılıdır quinonimine oluşumunu takip eder. Glukoz konsantrasyonu 1.3.1 hazırlanan kalibrasyon standartları göre kalibrasyon eğrisinden hesaplanmıştır.
- Bir morötesi / görünen 96 oyuklu bir plaka okuyucusu kullanılarak, 340 nm'lik bir dalga boyuna ayarlanır ölçülen absorbansı kaydedin. Bu ölçüm, ksiloz konsantrasyonu ile orantılıdır NADH NAD + 'azalma izler. Ksiloz konsantrasyonu, 1.3.1 hazırlanan kalibrasyon standartları göre kalibrasyon eğrisinden hesaplanmıştır.
PyMBMS 28 Kullanma Toplam Lignin ve Lignin Monomerik İçeriğin 2. Yüksek verim tayini
- Örnek hazırlama
- Öğütün ve adımları 1.1.1 ve 1.1.6-1.1.8 tarif edilen metotlar kullanılarak biyokütle ekstrakte edin. Bu taşlama ve deney denetimlerini kullanmak için standartların bir dizi ayıklanan içerir.
Not: pyMBMS kuvEMENTS olmayan partikül boyutu bağlıdır, bu yüzden sadece pyMBMS protokolü kullanılarak, eğer, biyokütle hazırlama örneği <, numune tutucuya 4 mm uyacak izin vermek üzere yürütülmelidir. - Yaklaşık 4 mg, küçük bir spatula bir dağıtıcı kullanılarak otomatik numune için tasarlanmış bir 80 ul paslanmaz çelik kabına hazırlanmış biyokütle (3 ila 5 mg tercih).
- Analiz edilen örneklerin en az% 10 gibi Standartlar ve Teknoloji Ulusal Enstitüsü edinilebilir gibi kontrol standartları olduğundan emin olun (şeker kamışı küspe-8491; kavak-8492; çam-8493; ya buğday samanı-8494). Standart, daha önce, standart yöntemler kullanılarak karakterize edilmiştir Analiz edilecek numuneler benzer olan herhangi bir tür olabilir.
- Rasgele nedeniyle zamanla olası spektrometre sürüklenme önyargıyı engellemek için cımbız kullanarak otomatik numune bardak içine numuneleri yükleyin. Not: Örneklerin Tipik randomizasyon yeniden rasgele ardından bir kez tüm örneklerde ölçümünü içerirYinelenen bir ölçüm için numune düzenin. Randomizasyon programları online olarak mevcuttur.
- Standart bir delik yumruk kullanarak, el hiçbir bağlayıcı, Tip A / D cam elyaf levhalar cam filtre diskleri üretirler. , Cımbız ile yuvarlak cam elyaf filtre tutun numune kabının üzerine ortalamak ve deney süresince her fincan malzemeyi sınırlandırmak için 3,5 mm'lik Allen anahtarı kullanarak numune içine itin.
- Öğütün ve adımları 1.1.1 ve 1.1.6-1.1.8 tarif edilen metotlar kullanılarak biyokütle ekstrakte edin. Bu taşlama ve deney denetimlerini kullanmak için standartların bir dizi ayıklanan içerir.
- Enstrümantal Protokol
- Deney örnekleri için mevcut olabilir bileşiklerin bütün aralığı boyunca en yüksek yoğunluklarına sahip bilinen bir standart kullanılarak kütle spektrometresi kalibre edin. Tipik biyokütle örnekleri için, perflorotirbütilamin (PptBA) kullanın.
- Bir gaz akış ölçer kullanılarak 0.9 L / dk helyum taşıyıcı gaz akış hızını ayarlayın.
- 500 ° C'lik bir piroliz sıcaklığı ve oto-ömekleyici yazılımı kullanılarak 350 ° C'ye kadar bir arayüz sıcaklığına kadar otomatik numune fırın ayarlayın. Not: Bir 1/8 "paslanmaz çelik ısıtmalıkütle spektrometresi otomatik örnekleyiciyi bağlayan ısı bant sarılmış transfer hattı 250 ° C'de ısı kontrolörü kullanarak kontrol edilir.
- Kütle spektrometresi veri toplama başlayın ve arka plan spektrumları koleksiyonu için yeterli veri elde etmek en az 60 saniye bekleyin.
- 2.2.2 özellikleri ile otomatik otomatik örnekleyici yöntemini başlatın. Not: Otomatik örnekleyici otomatik örnekleyici fırına tek tek her bir örnek düşer. Toplam veri toplama süresi yaklaşık 1.5 dakika olduğu; Bununla birlikte, tipik bir 4 mg numunenin piroliz 30 saniye sonra tamamlanır.
- 0,5 sn tarama hızında kütle spektrometresi yazılımı kullanarak her numunenin Tutanak toplam iyon içeriği (TIC). M / z 30 ile 450 arasındaki Kayıt yoğunlukları.
Not: Tipik biyokütle bileşikleri 17 eV yumuşak iyonizasyon kullanın. Alet 1.000 m / z 1 büyük aralıklarla kaydedebilirsiniz; Ancak, tarama hızı bilgisayar CPU gücü ile sınırlı olacaktır. - Ma kullanarak spektrumları arka planı kaldırmaknual yazılımında özelliğini geliştirmek. Not: Veri toplama başında bazal 60 tarama kısmı ortalama bir arka plan değerini hesaplamak için kullanılır. Bu ortalama arka plan spektrumu kütle spektrometresi yazılım otomatik deney numune spektrumdan çıkarılır.
- Bir veritabanı programı içine her bir numune için spektral verileri içeren kütle spektrometresi yazılımı tarafından oluşturulan tek sütun metin dosyası, ithalat ve tek bir veritabanında tüm örnekleri birleştirir. E-tabloya herhangi bir geçerli meta veriler ekleyin. Istatistiksel yazılım paketi içine biçimlendirilmiş verileri (tablo / CSV dosyası) İthalat ve pirolize örnek kitleler varyasyon için hesap spektrumları normalleştirmek anlamına gelir.
- Ölçümlerde kullanılan çoğaltılmış standart numunelerin gruplandırma analiz etmek spektral verileri kullanarak bir ana bileşen analizi (PCA) gerçekleştirmek için bir istatistiksel yazılım paketi kullanımı yanı sıra, kimyasal sınıflandırılması ayrılmaz hangi doruklarına değerlendirmekyüklemelerinde bileşikler 28 arsa.
PCA gruplar spektrumları benzerliği dayalı örnekler ve standartlar bir çek nedeniyle çalışma sırasında enstrüman sürüklenme deneysel hatayı ölçmek için izin verir: Not. - Lignin syringly (S) / guaiasil (G) oranının hesaplanması için, S maksimum alanları toplamı (m / z = 154, 167, 168, 182, 194, 208 ve 210) G doruklarının toplamı ile ve bölme 124, 137, 138, 150, 164, ve 178 de.
- Toplam linyin içeriğini hesaplamak, m / z = 120, 124, 137, 138, 150, 152, 154, 164, 167, 178, 180, 182, 194 ve 210 ile birlikte lignin zirveleri Özetle.
- Örneğin Klason lignin gibi toplam lignin tahmin edilmesi için standart bir yönteme pyMBMS ölçüm ölçekleme için, bir düzeltme faktörü hesaplanır. PyMBMS kullanarak standart numune için ölçülen toplam lignin içeriği ile bireysel standardın Klason lignin değerini bölün.
- Veri kümesinde gibi tüm türler bu düzeltme faktörü uygulayın. Analiz biyokütle her türü için tekrarlayın. NOT: düzeltme faktörü önemli ölçüde analiz biyokütle S / G göre değişebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kimyasal ve termal ön ve daha sonra enzim sakarifikasyon birleşik etkisi, deney sonunda serbest glukoz ve ksiloz kütlesinin bir fonksiyonu olarak ölçülür. Sonuçlar biyokütle gramı başına serbest glukoz ve ksiloz miligram cinsinden rapor edilir. Bu genellikle, başlangıç malzemesinin kompozisyon analizi dayanan yüzde teorik verimin olarak rapor edilir laboratuvar ölçekli deneyler, bildirilen verilerin taban tabana zıttır. Henüz haftada örneklerin binlerce kompozisyon analizi yürütmek için pratik değildir, veri en kütle bazında dönüşüm seviyeleri olarak bildirilmektedir. Karşılaştırmalar çok farklılık yok yakından ilişkili biyokütle örneklerinin ve örneklerin kompozisyonu arasında yapılır sürece bu makul numune değerlendirme için izin verir.
Tahlilinde birincil amacı, bir araya termokimyasal / enzim bitki hücre duvarının direnci görece farkları değerlendirmektirBireysel varyantları bir dizi genelinde atic sakarifikasyon. Bu tahlil sakarifikasyon için kullanılan koşullardan herhangi optimize etmeye çalışmaz fazlalaştı. Aslında, ön-muamele koşulları şiddeti, teorik% 50 ila% 70 bir son dönüşüm verimi hedef analizin duyarlılığı yelpazesini genişletmek amacıyla önemli ölçüde optimal bulunmaktadır. Veya optimum yakınındaki Tedavi öncesi koşulları büyük ölçüde tahlil dinamik aralığını daraltarak, yüksek dönüşüm tüm örnekleri itmek istiyorsunuz. Bunun aksine olarak, enzim yükleme, tipik olarak, tezgah sindirimler için bildirilen çok daha büyüktür. Yine, yöntemin amacı, iyi enzim arayan ya da enzim maliyetini en aza indirmek, onun yerine, hücre duvarlarının iç rekalsitrantların ölçülmesi ve çok yüksek enzim yüklemeleri ile tahlilinden değişkenlik kaldırır değildir.
Son olarak, genel deneyde değişkenlik bank için rapor göre anlamlı derecede yüksek olduğunu anlamak önemlidirh ölçekli iş. Aralık çok daha geniş olmasına rağmen tipik standart hatalar,% 8 civarındadır. Bu sadece küçük ölçekli, HTP Araştırma doğasıdır. Evaporatif ve yoğunlaşma kayıpları gibi pipetlenmesi ve tartım hataları, ul ve mg ölçekte orantılı yüksektir. Yani 5 mg vs birden g, her bir örnek olarak büyüklüğü daha az parçacıkların birkaç emir tahlil yaparken Biyokütle heterojenite çok büyük bir değişkendir olur. Kolorimetrik analizler glikoz ve ksiloz HPLC sonuçları ile iyi bir korelasyon belirlemek için kullanılan; şeker analizine enzim bağlantılı analizler hızlı ve paralel gerçekleştirilebilir ise, ancak, bunlar, HPLC gibi analitik yöntemler, tutarsızlığın bir kat oluşması (Şekil 1) kadar kesin değildir.
Nedeniyle yukarıdaki hususlar tüm sonuçlar sadece yorumlanması gerektiğini ve belirli sınırlamalar dahilinde bildirildi. Veriler tüm setleri, bireysel değil numunelerde muayene edilmelidir. Çoğaltır mea için gerekli olanningful sonuçlanır. Eğilimler ve aykırı anlamlı, ancak tek sonuç değildir. Karşılaştırmalar iyi tek deneysel setleri içinde yapılır. Zamansal ya da ayrılmış kampanyalarda Karşılaştırmalar anlamlı olması için son derece sıkı kontroller ve titiz bir incelemeye gerektirir. HTP verileri mengene veya diğer ölçekli veri doğrudan karşılaştırılabilir değildir. Trendler HTP ve diğer ölçekler arasında parça, ancak doğrudan örnek karşılaştırmalar aynı sonuçlar yoktur.
Veri gösterimi genellikle eğilimleri, aykırı ya da alt-nüfus / varyant karşılaştırmalar düşüyor. Eğilimlerin bir örneği Amerika Birleşik Devletleri'nde 19 Pacific Northwest geniş bir aralıkta örneklenen kavak 755 doğal varyantlarının rekalsitrantların bir ankettir. PyMBMS ile belirlendiği gibi, bu örneklerin dinlemezlik kendi lignin içeriği ve syringly / guaiasil oranına karşı çizilmiştir. Sonuçlar S / G arttıkça, inatçılık etrafında 2 S / G oranı, inatçılık impr kadar azaldığını gösteriyorovement seviyeleri kapalı (Şekil 2). Uç açık Pt4CL1 geni kavak aşağı-regüle, Şekil 3 içinde görülmektedir. Yüzlerce çeşidi tarandı ve azalmış şeker salınımı ile kanıtlandığı gibi birçok açıkça rekalsitrantların artar. Şekil 4 farklı buğday-saman çeşitleri büyüme koşullarında çeşitli varyasyonları sonra iki yıl ve hasat boyunca çeşitli mekanlara yetiştirilen edildiği bir çalışma gösteriyor Yukarıda değişkenlerin kombinasyonlarına dayanan 20 popülasyonun elde edilir. Bu örnek setleri kolaylıkla ayırt edilirler ve rekalsitrantların pozitif ve negatif değişkenleri göstermektedir. PyMBMS hücre duvarı bileşimi değişiklikleri değerlendirmek için nasıl kullanılabileceğini 5 göstermektedir. Kütle spektrum fragmanları farklı linyin monomerlerinin (Tablo 1) atanır. Yüksek karbonhidrat içeriği vs yüksek lignin içeren bir örneği karşılaştırırken, spektral verilerin farklılıklar görülür. TO, Şekil 6'da gösterilen, bir ana bileşen analizi (PCA) ile birlikte pyMBMS verileri kullanır. Bu örnekte, numuneler, düşük ya da yüksek nitrojen gübreleme göre sınıflandırılır. Lignin ve karbonhidrat içeriği PC1'de boyunca ters hizalayın. Temel bileşen yükleri arsa kullanımı, kimyasal özellikleri özellikleri örnek kümeler arasında değişiyor puanlar sınıflandırma arsa, yanı sıra durulaştırmada açıklandığı edildiği belirlemede yardımcı olabilir.
Şekil 1: HPLC 9 vs yüksek verimli kolorimetrik testler kullanılarak glikoz ve ksiloz kantitatif karşılaştırılması. Glukoz ve ksiloz algılama karşılaştırması ksiloz dehidrojenaz (XDH, üst panel) ve glikoz oksidaz / peroksidaz (Gopod, alt panel) yüksek verimli kolorimetrik enzim-bağlantılı analizler ve yüksek performanslı l kullanılarak gerçekleştirilmiştirJK kromatografisi.
Şekil 2:. Lignin fraksiyonundaki (S / G) içeriği guaiasil için syringly bir fonksiyonu olarak kavak hücre duvarlarının artan rekalsitrantların lignin 9 (S / G) içeriği guaiasil için syringly bir fonksiyonu olarak kavak hücre duvarlarının rekalsitrantların sahip gözlenen ve rapor edilmiştir. Aynı kavak çeşidinde 755 kavak karot numuneleri Kuzey Amerika Pasifik Kuzeybatı orman birkaç yüz mil devralmış ve termokimyasal ön sonrası glikoz ve ksiloz serbest bırakılması için tarama ve sakarifikasyon enzim bulundu. PyMBMS ile belirlenen sonuçları hücre duvarı lignin S / G oranına karşı çizilmiştir. Rekalsitrantların yaklaşık 2, daha yüksek G / G de sabit kaldığı kadar S / G artması ile azalmaktadır. Teorik verim değerleri BESC "standart" kavak dayanmaktadır ve bir referen olarak verilmektedirKarşılaştırma için ce.
Şekil 3:. Rekalsitrantların kavak aşağı-regüle Pt4CL1 ifadede kavak içinde Pt4CL1 geninin Aşağı düzenleme ancak birkaç büyük ölçüde artmış dinlemezlik varyantları kolayca tespit edilir, klonlar arasında hücre duvarı rekalsitrantların küçük varyasyon sonuçlandı. Bir büyük görmek için tıklayınız Bu rakamın sürümü.
Şekil 4: Çeşitli wheatstraw toplumlarda rekalsitrantların açıkça ayırt dinlemezlik seviyelerinde çeşidi tipi, yetiştirme sitede, gübre uygulaması ve sulama oranı sonucu etkileri.. Farklı semboller differe temsilDeneysel büyüme koşullarını nt. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5:., Bitki hücre duvarlarının 28 kimyasal değişikliklerin analizi için pyMBMS Uygulama oklarla gösterilen tepe linyin fragmanları, ve (a), yüksek lignin (b) Orta lignin ya da (c), düşük lignin içeriğini değerlendirmek için kullanıldı.
Şekil 6:. Yüksek ve düşük fertilizasyon oranları 28 ile yetiştirilen kalabalık ağaçların hücre duvarı kimyasında farklılıklar Temel bileşenler analizi skorları arsa (Üst) Temel bileşenler analiziSkorlar ayrı bir sınıflandırma gösteren arsa ve bu nedenle, kalabalık ağaçların hücre duvarı kimyasında fark daha yüksek ve daha düşük döllenme oranları ile büyütülür. Ana bileşen 1 (negatif) yüksek lignin veya daha yüksek karbonhidrat (pozitif) içeriğine göre örnekler bölümlenmiş. (Alt) ana bileşeni yüklemeleri kimyasal bileşenleri puanları arsa örneklerin iki kümeler arasında değişiklik hangi aydınlatmak. Pozitif yükler negatif korelasyon yükleri dolayısıyla negatif puanları ve yüksek lignin içeriği ile uyum ederken, yüksek karbonhidrat içeriği temsil eden olumlu puanları ile ilişkilidir.
| m / z | Moleküler atama 30 | S / G / H atama |
| 94 | fenol | S / G / H |
| 120 | Vinilfenol | H |
| 124 | Guaiakol | G |
| 137 | Ethylguaiacol, homovanillin, koniferil alkol | G |
| 138 | Methylguaiacol | G |
| 150 | Vinilguaiacol | G |
| 154 | Syringol | S |
| 164 | Allil- + propenil guaiakol | G |
| 167 | Ethylsyringol, syringylacetone, propiosyringone | S |
| 168 | 4-Metil-2,6-dimetoksifenol | S |
| 178 | Koniferil aldehit | G |
| 180 | Koniferil alkol, syringylethene | S, G, |
| 182 | Siringaldehit | S |
| 194 | S | |
| 208 | Sinapylaldehyde | S |
| 210 | Sinapylalcohol | S |
Tablo 1:. PyMBMS ile tespit tipik bileşiklerin kütle spektrometrisi ile tespit edildiği üzere, lignin-türevi piroliz parçaları için tepe m / z ve atamalar listesi. Evans, RJ ve TA Milne (1987) dayalı moleküler atamaları. . 123-137: Biyokütle Enerji ve Yakıtlar 1 (2) pirolizi moleküler karakterizasyonu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aşağıdaki gibi yüksek verimli tarama deneyleri yaparken doğru ve tekrarlanabilir verilerini elde etmek için temel örnek hazırlama adımları şunlardır:
Şeker Salma Deneyi:
Genel olarak numuneler, birkaç düzine bir kerede birkaç bin arasında değişen sayıda hazırlanır. Her önemli bir adım, tipik olarak örnekler arasında hazırlanmasında değişimleri en aza indirmek için ileri doğru hareket önce, bütün numuneler için gerçekleştirilmiştir. De-Tutkal başlangıçta protokolünün bir parçası değildir ve bazı durumlarda, ihmal edilebilir. Ahşap çekirdek örnekleri ve senesced otsu malzemeler nedenle değişkenliği azaltmak için de-starching gerekmez, nişasta sürekli olarak düşük ve. Nişasta önemli bir husustur; Ancak, özellikle hasat birkaç saat boyunca meydana büyük örnek setleri için yeşil doku bitkilerin örnek setleri, içinde. Nişasta seviyeleri gündüz saatlerinde yükselmeye ve karanlık sırasında tükenmiş gibi, nişasta seviyeleri s üzerinde önemli ölçüde değişebilirnişastadan everal h glukoz selüloz glukoz ayırt edilemez, bu nedenle yüksek nişasta seviyeleri distortedly düşük dinlemezlik ölçümlerine neden olabilir. Destarching adımında gerçek enzim yükleme sürece nişasta hidroliz adımının zaman dilimi içinde tüm erişilebilir nişastayı çıkarmak için yeterli fazla aktivite var gibi, daha az endişe vericidir. Kullanılan spesifik enzimler varyasyonlar, zaman, sıcaklık, nişasta kaldırma adım hacmi ve ajitasyon oranı kesinlikle nişasta çıkarma seviyeleri ve oranlarındaki farklılıklara yol açabilir ve olası zaman ampirik olarak tespit edilmelidir. Çıkarılması için teabags zaman kaydırması Son, kalay kaplı bakır tel kullanıyoruz. Çıplak bakır tel sahte şeker değerlerini vererek, enzim çözeltisi ile istenmeyen kimyasal reaksiyonlara neden olabilir. Paslanmaz çelik tel sıkıca kapalı teabags tutmak için yeterli dövülebilir değil iken kalay kaplı bakır bu sorunu çözüldü.
Biyokütlenin tutarlı boyut küçültme Accu için kritik1) İnce daha kolay ve daha tutarlı bir şekilde dağıtılacak ise, biyokütle öğütülür, daha kalın malzemeden daha sindirimi daha kolay olan: iki nedenden dolayı hızlı veri. 2) Çok iri taneli kum yetersiz malzeme ile sonuçlanan, Besleyici yapışmasına neden olabilir veya yapışmasına neden sadece kısmen açılmasını engelliyor, eğer örnek gözlenen rekalsitrantların azaltarak yoluyla ince parçacıklar bir elek görevi ve sadece izin verebilir Biyokütle. Çok az biyokütle silosu bulunan ise, ceket olabilir hunisi üstlenmeye robot neden huninin yanları, boş ve örnek dağıtma sürecinde atlanır. Buna ek olarak, biyo-kütlenin düşük seviyelerde (örneğin kabuklu gibi) yoğun parçacıklar koninin altına elekten geçirilmesi ve birinci tevzi olsun eğilimi, özellikle de abartılı bir örnek heterojenliği katkıda bulunabilir. Malzemenin en az 50 mg mevcut olduğunda, deney de gerçekleştirilebilir; Bununla birlikte, örnekler elle tartılır olmalıdır. Ancak, el-tartım sonuçları soymaya gelenler daha değişkendirotik tartı.
Hazırlık aşamaları için gerekli biyokütle gerçek miktarı iyi tanımlanmış değildir. Biz makul bir başlangıç noktası olarak 250 mg önerdi, ancak her biyokütle örneği nedeniyle, taşıma, taşlama ve ayıklanması yanı sıra haznede kadar tutulan veya tekrarlanabilir dağıtılan olmanın zararları konusunda farklı özellikler sergiliyor. Türleri arasında ve hatta aynı tür içinde biyokütle heterojen bir daha tanımlı protokol engellemektedir. Deneyim kolaylaştırmak yok ama bu deney yöntemleri uygulamak isteyenler sadece kendileri için bu değişkenlerin çoğu belirlemek gerekir.
Hata tanıtmak bir adım daha çok zordur ve çeşitli nedenlerle bu tahlillerde kritik mikro ölçüm levhaları içinde karıştırma. Enzim çözeltisi konsantre edilir ve biyokütlenin enzim ulaşmak sınırlamaktadır oyuklara ilave edilmesi üzerine tabakalı olabilir. Sakarifikasyon ilerledikçe, sugars da tabakalandırmak ve biyokütle yakın konsantre ve örnekleme derinliğine bağlı olarak, şeker tahlilleri yapay yüksek ya da düşük olabilir olabilir yayınladı. Bu önemli bir tutarlı bir şeker analizine imkan vermek için sakarifikasyon ve elde edilen şekerlerin düzgün dağılımı biyokütle enzimlerin tamamen karışmasını sağlayan, enzim ve enzim ilave sakarifikasyon sonra numune karıştırma nedeni budur. Bu tür seyreltme veya tahlil plakaları gibi biyokütle içermeyen plakalar olarak, tekrar pipetleme (toz haline getirme) karıştırma çalkalama daha üstün olduğu kanıtlanmıştır. Bu protokolde çözümleri sıvı sütunda değişken yoğunluklar ve partiküler düzeyleri, pipetleme hızını ve dikey uç konuma sahip Ancak, kritik öneme sahiptir. Hız ucu nedeniyle kavitasyon (aspirasyon) çok hızlı, kötü doğruluk ve sıvı tutma ise oluşabilir (dağıtıcı). İpucu kuyuda çok derin ise, biyokütle ucu tıkayabilir ya da ipucu doğru aspirasyon engelleyen, alt bastırdı ve orada olabilirSıvı bir sonraki aşamada için ve bulaşma sarılmak için daha dış yüzey alanıdır. Yavaş uç çıkarma sıvı yüzey gerilimi ile toplu çözüm kaldırılacak izin verdiği ikinci konu biraz kontrol ucu çekme hızı ile hafifletilebilir. Ucu çekilmesi çok yavaş ise, pipetle sıvı hem de geri dökme çözeltisi içine sürünme olabilir. Biyokütle parçacıkları ayrıca bir eğilim ipuçları sarılmak ve analiz edilen örnek hacimlerindeki yanlışlıklar yaratarak, onlar tahlil plakalarına karıştırma veya nakil sırasında ucu yapışmasına neden olabilir seyreltme plaka, transfer hale var. Onlar okuma sırasında ışık demeti tıkayan varsa, bu parçacıklar da tahlil plakaları spektroskopik analizi ile etkileşebilir.
Tutarlı renk gelişimi, zamanlama Gopod ve XDH deneyleri için kritik önem taşır. Renk geliştirme tamamlanması gitmek için izin verilmelidir; Bununla birlikte, Gopod tahlili, renk tamamlama ve XDH deneyi ile oluşturulan NADH sonra artmaya devam edeceği eğilimi yavaşnedeniyle NADH'nin kendiliğinden oksidasyonu azalır. Bunun bir sonucu olarak, değişkenlik zamanlama ayrı levhalar arasındaki veri tutarsız karşılaştırmalar yol açabilir. Nedeniyle donanım veya yazılım sorunları durmaları tahlil zamanlarda büyük farklılıklara yol açabilir olarak tahlil adımlar dikkatle izlenmelidir. Her plaka şeker standartları ve standart biyokütle kontrol kuyuları kullanımı bir ölçüde bu azaltmaya yardımcı olabilir.
PyMBMS:
Standartlar dikkatli bir şekilde, standart ıslak kimyasal yöntemler ile karşılaştırma yapmak için pyMBMS deneyler için göz önüne alınmalıdır. Nedeniyle biyokütle türlerinin farklı lignin bileşiminin (S / G oranı) için düzeltme faktörü deney örneği aynı türde bir temsili standart kullanılarak saptanması gerekmektedir. Hiçbir uygun standart varsa, lignin konsantrasyon farklılıkları doğrudan lignin öncülerinin yoğunlukları kullanılarak karşılaştırılabilir. (Over ~ 3.5) Yüksek S / G oranları l abartılması yol açabilirpyMBMS tarafından ignin içeriği. S, lignin tercihen, bu yöntemde kullanılan standart koşullar altında serbest olması için, bu eğilim kaynaklanır. Buna ek olarak, pyMBMS ölçümleri için gerekli olan örnek miktarı, kullanılan biyokütle türüne bağlıdır. İzole lignin ve lignin modeli bileşikleri dedektörü doyurabilecek örnek daha alikotları kullanılarak, daha az malzeme (0.1 mg) gerektirir.
PyMBMS sürecindeki bir diğer kritik adım, her deneyden önce böyle perflorotirbütilamin (PptBA) olarak bilinen bir standarda enstrümanın dikkatli ayar olduğunu. PptBA tipik biyokütle tüm yelpazesinde moleküler doruklarına içerir ve bu nedenle, deneysel çalışmalar arasında muntazam enstrüman akort verir. Bu, m / z 131, m / z 219, yaklaşık olarak m / z 69. yoğunluğunun% 50'si bu ayarlama, yumuşak iyonizasyonu altında görülen tipik tepe noktaları vurgulamak için kullanılır vardır (17 eV) kullanılır, böylece PptBA spektrumları orta bölgesi ayarlanmıştır alt kitlelere Buna iyonların parçalanma en aza indirmek için c Annot kolayca tespit edilebilir.
Bu yöntemler, söz konusu analit tam bir kantifikasyonu için analitik yöntemler olmadıklarını belirtmek gerekir. Bunun yerine, bu yüksek verimli teknikleri Büyük biyokütle tarama istenilen kimyasal özellikleri sahip olanlar tespit etmek ayarlar içindir. Bu yöntemler, sadece bir veri kümesi içindeki tarama, sıralama ve numune korelasyon için kullanılmalıdır. Böyle enstrümantal sürüklenme, enzim aktivitesindeki değişiklikler, biyokütle ortam nem içeriğinin olarak varyasyon kaynakları nedeniyle farklı günlerde tahsil edildikleri veri setleri doğrudan bağlı nem değişiklikleri, sıcaklık dalgalanmaları ve ipuçları farklılıklar ve absorbans plaka sürü mukayese edilemez . Buna ek olarak, örnek hazırlama protokolde kullanılan ön-muamele, optimize edilmiş bir ön-muamele strateji değildir, daha ziyade, özellikle alt-optimal şekilde tasarlanmıştır. Bu bitkiler arasındaki ince farklar daha verimli aydınlatılamamıştır mümkün kılar.
jove_content "> yüksek verimlilik yöntemlerini benimseyerek ana parası daha birçok örnekler aynı zaman diliminde 18 ölçülebilir olmasıdır. Örneğin, bir asit ya da enzimatik sakarifikasyon sırasında üretilen karbonhidrat analiz için ortak bir yöntem yüksek performanslı kullanımı sıvı kromatografisi (HPLC). Selig ve diğ., yapısal karbonhidrat miktarının oldukça kullanışlı ve fevkalade rağmen her yerde iki aşamalı asit hidrolizi,. haftada 9 başına yaklaşık 25 örnekleri değerlendirmek için güçlü olmak için araştırmacılara sınırlar devlet analitik iken yüksek verimli metodolojileri istihdam enstrümantasyon HPLC gibi standart bir tekniğin duyarlılık, hızlı analiz araştırmacılar örneklerin büyük miktarlarda değerlendirmek için güçlü olmak lüksüm sağlamayabilir. Buna ek olarak, yüksek verimli yöntemleri sıklıkla deneysel protokolleri downscaled var, sarf kullanımının azaltılması ve bu yüzden, deney maliyetleri ve atık miktarını azaltmak.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biomek FX Automated Workstation | Beckman Coulter | Biomek FX | Automated Liquid Handler |
| Wiley mill | Thomas Scientific | 3375E15 (Model 4), or 3383L20 (Mini-mill) | |
| anti-static bags | Minigrip* | MGST4P02503 | 2.5x3", multiple suppliers available |
| tin-coated copper wire | McMaster-Carr | 8871K84 | 0.016" diameter, bend-and-stay wire |
| tea-bags | Herbco | press n' brew teabags | 3.5x5 inches |
| gluco-amylase | Novozymes | Spirizyme Fuel | |
| alpha-amylase | Novozymes | Liquozyme SC DS | |
| sodium acetate trihydrate | any chemical supplier | reagent grade | |
| acetic acid | any chemical supplier | reagent grade | |
| 190 proof (95%) ethanol | any chemical supplier | reagent grade | |
| hoppers | Freeslate | ||
| 96-well C-276 Hastelloy plates | Aspen Machining (Lafayette, Colorado) | N/A (custom built) | |
| 1/8” soldering iron tip | Sears | ||
| silicone-adhesive backed Teflon tape | 3M | 5180 | 3" wide (36-yard rolls) |
| enzyme solution | Novozymes | Cellic CTec2 | |
| citric acid monohydrate | any chemical supplier | ||
| trisodium citrate dihydrate | any chemical supplier | ||
| disposable, polystyrene 96-well plates | Greiner Bio-One | 655101 | or equivalent; multiple suppliers available |
| glucose oxidase/peroxidase | Megazyme | K-Gluc | Megazyme D-glucose assay kit |
| xylose dehydrogenase | Megazyme | K-Xylose | Megazyme D-xylose assay kit |
| glucose standard solution | Megazyme | K-Gluc | Megazyme D-glucose assay kit |
| xylose standard solution | Megazyme | K-Xylose | Megazyme D-xylose assay kit |
| stainless steel sample cups | Frontier Laboratories | PY1-EC80F | |
| glass fiber sheets | Pall | 66227 | 8x10" sheets; circles punched with standard hole punch |
| Sugarcane Bagasse Whole Biomass Feedstock | NIST | 8491 | |
| Eastern Cottonwood (poplar) Whole Biomass Feedstock | NIST | 8492 | |
| Monterey Pine Whole Biomass Feedstock | NIST | 8493 | |
| Wheat Straw Whole Biomass Feedstock | NIST | 8494 |
References
- U.S. Billion-Ton Update: Biomass Supply for a Bioenergy and Bioproducts Industry. Perlack, R. D., Stokes, B. J. , Oak Ridge National Laboratory. Oak Ridge, TN. (2011).
- Henry, R.
- Henry, R. J. Evaluation of plant biomass resources available for replacement of fossil oil. Plant Biotechnol. J. 8 (3), 288-293 (2010).
- Furtado, A., et al. Modifying plants for biofuel and biomaterial production. Plant Biotechnol. J. 12 (9), 1246-1258 (2014).
- Sluiter, J. B., Ruiz, R. O., Scarlata, C. J., Sluiter, A. D., Templeton, D. W. Compositional analysis of lignocellulosic feedstocks. 1. Review and description of methods. J. Agric. Food Chem. 58 (16), 9043-9053 (2010).
- Lupoi, J. S., Singh, S., Simmons, B. A., Henry, R. J. Assessment of Lignocellulosic Biomass Using Analytical Spectroscopy: an Evolution to High-Throughput Techniques. Bioenerg. Res. 7 (1), 1-23 (2014).
- Lapierre, C., Monties, B., Rolando, C. Thioacidolysis of lignin: comparison with acidolysis. J. Wood Chem. Technol. 5 (2), 277-292 (1985).
- DeMartini, J. D., Studer, M. H., Wyman, C. E. Small-scale and automatable high-throughput compositional analysis of biomass. Biotechnol. Bioeng. 108 (2), 306-312 (2010).
- Selig, M. J., et al. High throughput determination of glucan and xylan fractions in lignocelluloses. Biotechnol. Lett. 33 (5), 961-967 (2011).
- Selig, M. J., et al. Lignocellulose recalcitrance screening by integrated high-throughput hydrothermal pretreatment and enzymatic saccharification. Ind. Biotechnol. 6 (2), 104-111 (2010).
- Studer, M. H., De Martini, J. D., Brethauer, S., McKenzie, H. L., Wyman, C. E. Engineering of a high-throughput screening system to identify cellulosic biomass, pretreatments, and enzyme formulations that enhance sugar release. Biotechnol. Bioeng. 105 (2), 231-238 (2009).
- Gjersing, E., Happs, R. M., Sykes, R. W., Doeppke, C., Davis, M. F. Rapid determination of sugar content in biomass hydrolysates using nuclear magnetic resonance spectroscopy. Biotechnol. Bioeng. 110 (3), 721-728 (2013).
- Templeton, D. W., Sluiter, A. D., Hayward, T. K., Hames, B. R., Thomas, S. R. Assessing corn stover composition and sources of variability via NIRS. Cellulose (Dordrecht, Netherlands). 16 (4), 621-639 (2009).
- Tucker, M. P., et al. Fourier transform infrared quantification of sugars in pretreated biomass liquors. Appl. Biochem. Biotechnol. 84-86, 39-50 (2000).
- Wolfrum, E. J., Sluiter, A. D. Improved multivariate calibration models for corn stover feedstock and dilute-acid pretreated corn stover. Cellulose (Dordrecht, Netherlands). 16 (4), 567-576 (2009).
- Ona, T., et al. Non-destructive determination of wood constituents by Fourier-transform Raman spectroscopy. J. Wood Chem. Technol. 17 (4), 399-417 (1997).
- Ona, T., Sonoda, T., Ohshima, J., Yokota, S., Yoshizawa, N. A rapid quantitative method to assess eucalyptus wood properties for kraft pulp production by FT-Raman spectroscopy. J. Pulp Pap. Sci. 29 (1), 6-10 (2003).
- Hames, B. R., Thomas, S. R., Sluiter, A. D., Roth, C. J., Templeton, D. W. Rapid biomass analysis. New tools for compositional analysis of corn stover feedstocks and process intermediates from ethanol production. Appl. Biochem. Biotechnol. 105-108, 5-16 (2003).
- Studer, M. H., et al. Lignin content in natural Populus variants affects sugar release. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (15), 6300-6305 (2011).
- Chen, M., Zhao, J., Xia, L. Comparison of four different chemical pretreatments of corn stover for enhancing enzymatic digestibility. Biomass Bioenergy. 33 (10), 1381-1385 (2009).
- Davison, B. H., Drescher, S. R., Tuskan, G. A., Davis, M. F., Nghiem, N. P. Variation of S/G ratio and lignin content in a Populus. family influences the release of xylose by dilute acid hydrolysis. Appl. Biochem. Biotechnol. 129-132, 427-435 (2006).
- Li, X., et al. Lignin monomer composition affects Arabidopsis cell-wall degradability after liquid hot water pretreatment. Biotechnol. Biofuels. 3, 27-33 (2010).
- Lupoi, J. S., et al. High-throughput prediction of eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using multivariate analysis: a comparison between mid-infrared, near-infrared, and Raman spectroscopies for model development. Biotechnol. Biofuels. 7, 93 (2014).
- Lupoi, J. S., Smith, E. A. Characterization of woody and herbaceous biomasses lignin composition with 1064 nm dispersive multichannel Raman spectroscopy. Appl. Spectro. 66 (8), 903-910 (2012).
- Sun, L., et al. Rapid determination of syringyl:guaiacyl ratios using FT-Raman spectroscopy. Biotechnol. Bioeng. 109 (3), 647-656 (2012).
- Lupoi, J. S., et al. High-throughput prediction of Acacia and eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using FT-Raman spectroscopy and partial least squares modeling. Bioenerg. Res. in press, (2015).
- Sykes, R., Kodrzycki, B., Tuskan, G., Foutz, K., Davis, M.
- Sykes, R., et al. Ch. 12. High-Throughput Screening of Plant Cell-Wall Composition Using Pyrolysis Molecular Beam Mass Spectroscopy. Biofuels: Methods and Protocols. Mielenz, J. R. 581, 169-183 (2009).
- Decker, S., et al. Ch. 17. Reducing the effect of variable starch levels in biomass recalcitrance screening). Biomass Conversion. Himmel, M. E. 908, Humana Press. 181-195 (2012).
- Evans, R. J., Milne, T. A.
