Introduction
Som den globala tillgången på icke-förnybara bränslen och tillhörande produkter minskar, har forskare ifrågasatts för att skapa likartade bränslen och kemikalier från vegetabiliska källor 1. En viktig del i detta arbete är att bestämma vilka arter av växter kan vara lämpliga för produktion av biobränslen och biomaterial 2,3. Normalt är dessa utgångsmaterial utvärderades beträffande lignin, cellulosa och hemicellulosa; liksom deras känslighet för dekonstruktion (motsträvighet) genom termisk, mekanisk och / eller kemisk förbehandling med eller utan efterföljande enzym försockring. Mer detaljerade analyser används för att bestämma den specifika sammansättningen av ligninet och hemicellulosan fraktioner samt optimala enzymaktiviteter behövs. Transgena modifieringar av växter som inte i sig besitter ideala egenskaper för biokemisk eller termokemisk omvandling till önskade råvaror har gett forskare med en kraftigt utökad källa av pottenrential- matarmaterial 4. De analytiska standardmetoder för att kvantifiera de kemiska egenskaper hos en växt, medan ganska användbart för små provmängder, är olämpliga för snabb screening av hundratals eller tusentals prover 5-7. De HTP metoderna beskrivna häri har utvecklats för att snabbt och effektivt utvärdera ett stort antal varianter biomassa för förändringar i cellväggen motsträvighet till termokemisk och / eller enzymatisk nedbrytning.
Det är viktigt att förstå att de HTP screeningsanalyser beskrivna häri har inte utformats för att maximera omvandling eller utbyte. Målet är att bestämma relativa skillnader i inneboende motsträvighet av relaterade prover biomassa. Som ett resultat, många av analysstegen skiljer sig från de "typiska" konvertering biomassa analyser, där målet är att få maximal omräkningskurs eller omfattning. Till exempel är lägre förbehandlingssträng och kortare enzym hydrolystider används för att maximera skiljerderna mellan prover. I de flesta fall är relativt höga enzymbelastningar som används för att minska skillnaderna på grund av experimentell variation i enzymaktivitet, vilket skulle kunna förvränga resultaten avsevärt.
Snabba metoder för att bestämma sammansättningen av växtcellväggar och de monomera socker frigörs efter enzymatisk försockring inkluderar robotik, skräddarsy, termo kompatibla 96-brunnsplattor, och modifieringar av standardlaboratoriemetoder 8-11 och instrumentprotokoll, såsom vibrationsspektroskopi (IR (IR), nära-infraröd (NIR) eller Raman) och kärnmagnetisk resonans (NMR) 12-17. Dessa metoder är nyckeln till att isolera råvaror med hög cellulosa eller låg lignininnehåll, eller de förväntas ge den högsta glukos, xylos, etanol, etc. Dessa metoder har gjort det möjligt nedskalade analyser som använder mindre mängder biomassa och förbrukningsartiklar, vilket leder till en minskning i experimentell bekostnad 18 9, poppel 8,10, sockerrör bagass 8, och switch 8 har framgångsrikt utvärderats med användning av dessa HTP metoder.
Total lignin och lignin monomersammansättning är också vanligt kvantifieras drag biomassa. Minskningar i ligninhalt har visat sig öka den enzymatiska smältbarhet polysackarider 19,20. Den roll som ligninet mono förhållandet (ofta rapporteras som syringyl / guaiacyl (S / G) innehåll) spelar i dekonstruktion av växtcellväggen är fortfarande under utredning. Vissa rapporter har visat att minskningar i S / GFörhållandet ledde till ökade glukos ger efter hydrolys 21, medan andra studier avslöja en motsatt utveckling 19,22. Hög genomströmning metoder för utvärdering lignin och dess monomerer innefattar vibrationsspektroskopi (IR, NIR och Raman 23-26) i kombination med multivariat analys, och pyrolys molekylstråle masspektrometri (pyMBMS) 27,28.
När man utvecklar HTP metoder för screening av biomassa, flera integrerade överväganden måste hållas i åtanke. En viktig aspekt är komplexiteten av förfarandet. Vad är det som krävs kompetensnivå för tekniken? Kemometriska analyser, till exempel, kräver särskilda kunskaper för att konstruera, utvärdering, och upprätthålla prediktiva modeller. De standardmetoder uppvisar oönskade förberedande eller dataanalyssteg eller anställa toxiska reagens. Utveckling av modellerna är en kontinuerlig process där nya data införlivas i modellen över tiden för att öka modellens robusthet. En annan Considbete är kostnadsbesparingar och minskad experimentella analystider för de föreslagna hög genomströmning metoder. Om metoden är ganska snabb, men mycket kostsamt, kan det inte vara en genomförbar teknik för många laboratorier att anta. De metoder som illustreras i detta manuskript är varianter av standardiserade tekniker, modifierade för att förstärka genomströmningskapacitet. Dessa protokoll mäta kvantitativt biomassa drag av intresse utan kräver utvecklingen av prediktiva modeller. Detta är en viktig egenskap hos dessa tekniker, eftersom prediktiva metoder, samtidigt uppvisar starka samband med standarden analyser används för att utveckla modellerna, är inte lika exakt som faktiskt mäta mängden av intresse för proven. De metoder som används är väsentligen förminskad versioner av standardbänkskale analysmetoder, är noggrannhet och precision handlas för hastighet och genomströmning. Mestadels är detta resultat beror på högre fel i liten volym pipettering och vägning; samt ökad sriklig heterogenitet som urvalsstorleken minskar. Medan stora provmängder kan screenas och jämföras, måste stor försiktighet iakttas när man gör jämförelser mellan separata kampanjer och till bänkskale resultat.
De mest tidskrävande stegen involverar fysisk manipulation av biomassan. Slip prover kan ta flera minuter per prov, bland annat rensa kvarnen mellan prover. Manuellt lastning, lossning och rengöring trattar och påfyllning och tömning tepåsar och provpåsar är också mycket arbetskrävande. Även om varje steg kan ta en minut eller mer, kan göra tusentals prover ta många timmar eller dagar. Robotarna kan ladda en typisk reaktor platta med biomassa i cirka 3-4 timmar eller 6-8 plattor dag -1 robot -1. Denna situation beror på precisionsparametrar som används samt typen och mängden biomassa som ska testas. Fyllning reaktorplattor med vatten, utspädd syra, eller enzymet snabbt gjort med användning av en flytande robothantering. Pbehandling av en plattstapel (1 till 20 reaktorplattor) tar mellan 1 och 3 timmar när montering, svalna, och demontering ingår. Enzymhydrolys tar 3 dagar och analys sockret kräver ca 1 tim av prep tid plus 10 minuter per reaktorplattan för att slutföra analysen och läsa resultaten. Ett veckovis schema med som förbehandlings och analys dagar rymmer en rimlig arbetsschema, vilket minimerar udda timme och helg insatser för mänskliga komponenten i analysen och möjliggör bearbetning ~ 800 till 1.000 prover per vecka på ett löpande. Den maximala genomströmning beror på flera faktorer, främst hur mycket hårdvara (robotar, reaktorer tallrikar, etc.) och hur mycket "programvara" (dvs, bemanning) finns tillgängliga för att göra det manuellt arbete. Den praktiska övre gränsen är 2500 till 3000 sampel / vecka; kräver dock att utsignalen 7 dag i veckan drift och flera praktikanter och tekniker. I jämförelse skulle 3000 prover av HPLC kräver ca 125 dagar sampel analys plus extra arbetskraft manuellt väger prover i reaktorer och filtreringsprover före analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. hög kapacitet bestämning av glukos och xylos avkastning Efter Enzymatisk Försockring 9,29
- Provberedning (Slipning, De-stärkning, Extraction, förbehandling)
- Grind minst 300 mg av varje prov av biomassa under användning av en Wiley-kvarn, så att partiklarna passerar genom en 20 mesh (850 | im) sikt. Överföring till antistatiska zip-top väskor (typiskt bar-kodad) och provregistret till streckkoden databasen.
- Tillsätt cirka 250 mg eller mer av jord biomassa från antistatpåse till en numrerad (med penna, inte använda bläck eller markör) tepåsen, försiktigt rulla upp tepåsar, var noga med att vika ändarna över biomassan för att förhindra förlust under de-stärkning och extraktion.
- Linda tepåse stängs med tennbelagda koppartråd. Anteckna tepåse nummer för varje streckkods prov.
- Förbered de-stärkning enzymlösning från kommersiella enzymer (typiskt 0,25% (volym / volym) glukoamylas (~ 1600 AGU / L) och1,5% (volym / volym) alfa-amylas (~ 2900 KNU-S / L) i 0,1 M natriumacetat (pH 5,0)). Förbered 16 ml per g av bulk biomassa eller 500 ml per 120 teabag prover. Obs: Belastningar förmåga att avlägsna stärkelse från mark biomassa bör bestämmas empiriskt genom att testa för stärkelse efter uppslutning med ett område av enzymbelastningar och förhållanden.
- I en plastbehållare, tillsätt 16 ml av de-stärkning enzymlösningen per 1 g av bulkmark biomassa. För en satsvis de-stärkning protokoll, tillsätt 120 tepåsar till 500 ml av den buffert-enzymlösningen.
- Inkubera i en skakapparat vid 55 ° C under 24 (± 4) h, vid 120 varv per minut för avlägsnande av eventuellt stärkelse.
- Efter de-stärkning inkubation, skölj och blöta biomassan i flera liter avjoniserat vatten under 30 minuter. Upprepa denna process ytterligare två gånger för att avlägsna buffertsalter som kan orsaka stötar (bildning av gasbubblor i lösningen som kan resultera i en plötslig och våldsam ökning av nivån av lösningen, vilket orsakar heta flytande etanol till kaskadut ur reaktionskärlet) under extraktionen.
- Efter den uttömmande sköljning av de-stärkta biomassa, placera tepåsar i Soxhlet kolumnen för utvinning. Ingen fingerborg krävs för detta steg.
- Konfigurera Soxhlet återflöde, med användning av 95% etanol och extrahera prover för 24 timmar.
- Avlägsna de tepåsar från Soxhlet-reaktorn och sprids ut i ett enkelskikt på en plan bricka.
- Låt proverna torka över natten vid rumstemperatur i ett dragskåp.
- Rulla ut tepåsar och returnera den torkade biomassan originalstreckkodade antistatiska påsar.
Obs: De antistatiska påsar är effektiva för att minska statisk elektricitet i biomassan, förbättra köregenskaper. Om andra lagringsalternativ används kan ytterligare biomassa behövas på grund av biomassan klängande till sidan av lagringstanken. - Överföra minst 50 mg av den torkade biomassan till en streckkods tratt (med mer material är bättre för korrekt dosering). Skan streckkoder av antistatiska påsar och avlastarbord för att säkerställa korrekt prov spårning.
- Last trattar fast föda väger robot, mycket uppmärksamma på ordningen av proverna i rack. Ladda tillräckligt reaktorplattor att innehålla alla prover och välja dispenseringsprotokoll baserat på antal plattor används.
- Robot väger 5 mg av de torkade proven (± 0,3 mg) i syrafast rostfritt stål med 96 brunnar. Väg upp 3 replikat av varje prov distribueras runt plattan för att minimera eventuella lokala variationer.
- Det finns 8 kontroll biomassa prov av en väldefinierad biomassa standardmaterial för att spåra analysens prestanda. För flera plattor, kommer användningen av flera standard trattar biomassa minimera partikelstorleks drift till följd av siktning i magasinen under upprepade doseringscykler.
Anmärkning: I varje platta, bör det finnas 24 prover med 3 replikat, 4 ämnen som består av avjoniserat vatten och enzym, och 8 controls, med hjälp av den tidigare kännetecknas standard biomassa. De 3 hörn brunnar av var och en av de 4 hörnen av plattan är reserverade för standarderna socker. - Kontrollera blank och socker standardbrunnar för krångliga partiklar biomassa och ta bort om det finns.
- Tillsätt 250 | il av avjoniserat vatten till varje brunn, och försegla plattorna med silikon självhäftande polytetrafluoreten (PTFE) band.
- Med hjälp av en 1/8 "lödkolv spets, hål i PTFE-bandet vid varje ånga port (117 totalt) för varje platta. Använd en tom tallrik staplade på sluten reaktor plattan som en vägledning och att begränsa PTFE-film rörelse.
- Kläm plattorna tätt med 0,031 "tjocka glasförstärkt PTFE packningar (pre sade med hål för ånga portar) mellan plattor och tomma tallrikar på toppen och botten av stapeln. Förbehandla prov med användning av en ånga reaktor inställd på 180 ° C under 17,5 minuter, eller andra temperatur / tid-kombinationer baserat på önskad svårighetsgrad.
- Coola reaktorplattor till 50 °, C av översvämningar med avjoniserat vatten.
- Enzymatisk Försockring
- Förbered en enzymatisk försockring lösning bestående av 8% (volym / volym) enzymlösning i 1,0 M natriumcitrat, pH 5,0. Förbered 5 ml per reaktorplattan. Obs: Utspädning krävs bör fastställas baserat på aktivitet och proteinhalten i det särskilda aktieenzymlösningen.
- När plattorna är svala, centrifugera dem i en svängande hink rötor vid 1500 xg under 20 minuter. Ta bort tätnings film. Obs: Dessa plattor är tunga och centrifug specifikationer bör kontrolleras för kompatibilitet.
- Tillsätt 40 ul av 8% enzymstamlösning till varje brunn (70 mg enzym per g biomassa).
- Återförslut med ny PTFE-band. Placera förseglade plattan i magnetisk platta klämma.
- Blanda försiktigt proverna med inversion (minst 15 gånger), och inkubera vid 50 ° C under 70 h.
- När försockringen har ingått, blanda genom inversion och centrifugera plattorna vid 1500 xg under 20 minuter.
- Sockeranalys
- Bered en uppsättning av 6 glukos och xylos kombinerade kalibreringsstandarder i 0,014 M citratbuffert (pH 5,0) som sträcker sig från 0 till 0,750 mg / ml (0, 0,2, 0,3, 0,45, 0,65, och 0,75 mg / ml rekommenderas) och 0 till ,600 mg / ml (0, 0,1, 0,2, 0,35, 0,45, och 0,6 mg / ml rekommenderas) för glukos och xylos, respektive.
- Förbered glukosoxidas / peroxidas (GOPOD) och xylos (XDH) reagens enligt anvisningarna i satsen.
- Med hjälp av en pipett, ta bort 200 pl vätska från 4 hörnbrunnar och kantbrunnar i anslutning till hörnbrunnar (12 totalt brunnar) i reaktorplattan.
- Med hjälp av en pipett, dosera 180 pl avjoniserat vatten till varje brunn i en 96-väl polystyren flatbottnad utspädningsplatta. Lägg inte till vatten till 12 socker standard och hörnbrunnar (ta bort dessa tips om du använder en 96-kanals huvudet).
- Med hjälp av en pipett, dosera 180 pl GOPOD reagens till varje brunn av glukosanalys plåt.
- Med hjälp av en pipett, dosera 180 pl XDH reagens till varje brunn av xylos analysplattan.
- Med hjälp av en pipett 20 ul hydrolysat alikvoter från 96 brunnar reaktorplatta till utspädningsplattan. Pipett från den övre delen av brunnarna för att undvika fasta ämnen biomassa och återstående vätska i hörnbrunnar. Blanda genom triturering i minst 10 cykler.
- Med hjälp av en pipett 110 ul av socker standarder, i två exemplar, till hörn brunnarna i utspädningsplattan.
- Med hjälp av en pipett 20 pl alikvoter från utspädningsplattan till glukos och xylos analysplattor. Blanda genom rivning.
- Inkubera glukos och xylos analysplattor vid rumstemperatur under 30 minuter. Försiktigt bryta några bubblor på ytan innan du läser. En värmepistol kort passera över ytan av plattan fungerar bra.
- Med användning av en ultraviolett / synligt 96-brunnsplattläsare, ställer den uppmätta våglängden på 510 nm och registrera absorbansen mot ett reagensämne.Denna mätning övervakar bildandet av quinonimine, vilken är proportionell mot glukoskoncentrationen. Glukoskoncentrationen beräknas från kalibreringskurva baserad på kalibreringsstandarder som framställts i 1.3.1.
- Med användning av en ultraviolett / synligt 96-brunnsplattläsare, ställer den uppmätta våglängden på 340 nm och registrera absorbansen. Denna mätning övervakar minskningen av NAD + till NADH, som är proportionell mot xylos koncentration. Den xylos Koncentrationen beräknas från kalibreringskurva baserad på kalibreringsstandarder som framställts i 1.3.1.
2. hög kapacitet Fastställande av Total Lignin och Lignin Monomer innehåll Använda pyMBMS 28
- Provberedning
- Slipa och extrahera biomassa med hjälp av metoder som beskrivs i steg 1.1.1 och 1.1.6-1.1.8. Detta inkluderar slipning och extrahering av en uppsättning standarder som ska användas som experimentella kontroller.
Anmärkning: pyMBMS measurements inte partikelstorleksberoende, så om bara använder pyMBMS protokollet bör förberedelse biomassa utföras för att tillåta provet att passa in i provhållaren, <4 mm. - Med användning av en liten spatel dispense approximativt 4 mg (3 till 5 mg föredrages) av det beredda biomassa till en 80 | j, l av rostfritt stål kopp utformad för auto-sampler.
- Se till att åtminstone 10% av proverna som analyserats är kontrollstandarder såsom de som är tillgängliga från National Institute of Standards and Technology (sockerrör bagass-8491, poppel-8492, tall-8493, eller vete halm-8494). Standarden kan också vara någon art som är analoga med de prover som ska analyseras som redan har karaktäriserats med användning av standardmetoder.
- Slumpmässigt ladda proverna i auto-sampler koppar använder pincett för att undvika en snedvridning på grund av möjlig spektrometer drift över tiden. Obs: Ett typiskt randomisering av proverna skulle omfatta mätning av alla prover gång, följt av en åter randomiseringi storleksordningen av proverna för en dubblett mätning. Randomisering program finns tillgängliga online.
- Med en vanlig hålslagning, manuellt tillverka glas filterskivor från typ A / D glasfiber ark, utan bindemedel. Håll den runda glasfiberfilter med pincett, centrera den över provkoppen och tryck in i provet med användning av en 3,5 mm insexnyckel för att innesluta materialet i varje kopp under experimentet.
- Slipa och extrahera biomassa med hjälp av metoder som beskrivs i steg 1.1.1 och 1.1.6-1.1.8. Detta inkluderar slipning och extrahering av en uppsättning standarder som ska användas som experimentella kontroller.
- Instrumental protokoll
- Kalibrera masspektrometer med användning av en känd standard som har toppintensiteter över hela området av föreningar som kan finnas för de experimentella proverna. För typiska prover biomassa, använd perfluorotributylamin (PFTBA).
- Ställ in helium bärgasflödeshastigheten till 0,9 l / min med användning av en gasflödesmätare.
- Ställa in den automatiska provtagaren ugnen till en pyrolystemperatur av 500 ° C och gränssnittstemperaturen till 350 ° C med användning av den automatiska provtagaren programvara. Obs: En 1/8 "rostfritt stål uppvärmdöverföringsledning insvept i värmetejp som ansluter autoprovtagare till masspektrometern kontrolleras med användning av en värmeledaren vid 250 ° C.
- Börja datainsamling på masspektrometer och vänta minst 60 sekunder för att få underlag för bakgrundsspektra samling.
- Starta den automatiska auto-sampler metoden med specifikationerna från 2.2.2. Obs: Den automatiska provtagaren droppar varje prov individuellt i den automatiska provtagaren ugnen. Den totala datainsamlingstiden är ca 1,5 min; emellertid är pyrolys av en typisk 4 mg prov fullständig efter 30 sek.
- Spela total joninnehållet (TIC) för varje prov med hjälp av mass programvara spektrometer vid 0,5 sek skanningshastighet. Rekord intensiteter mellan m / z 30-450.
Obs: Typiska föreningar biomassa använder mjuka jonisering vid 17 eV. Instrumentet kan spela större intervall från m / z 1 till 1000; kommer dock svephastighet begränsas av datorprocessorkraft. - Ta bakgrund från spektra med hjälp av manual förbättra funktionen i programvaran. Obs: En 60 avlästa delen av baslinjen i början av datainsamling används för att beräkna ett genomsnittligt bakgrundsvärde. Denna genomsnittliga bakgrundsspektra avlägsnas från den experimentella provspektra automatiskt i masspektrometern programvara.
- Importera enda kolumn textfilen som skapats av masspektrometer programvara som innehåller spektrala data för varje prov, i en databas program och kombinera alla prover i en databas. Lägg tillämplig metadata till kalkylbladet. Importera formaterade data (kalkylblad / CSV-fil) i ett statistiskt programpaket och menar normalisera spektra att ta hänsyn till variationer i pyrolyseras provmassorna.
- Använd en statistiskt programpaket för att göra en principalkomponentanalys (PCA) med användning av de spektrala data för att analysera gruppering av de replikerade standardprov som används i mätningarna, samt för att utvärdera vilka toppar är i ett stycke med klassificeringen av kemiskaföreningar i de belastningar plotta 28.
Obs: PCA grupper proven bygger på likheten mellan deras spektra, och möjliggör en kontroll av de standarder för att mäta experimentellt fel på grund av instrumentdrift under körningen. - För att beräkna lignin syringyl (S) / guaiacyl (G) förhållande, summera områdena S topparna (m / z = 154, 167, 168, 182, 194, 208, och 210) och dividera med summan av G toppar vid 124, 137, 138, 150, 164 och 178.
- För att beräkna det totala lignininnehållet, summera de lignintoppar med m / z = 120, 124, 137, 138, 150, 152, 154, 164, 167, 178, 180, 182, 194, och 210.
- Beräkna en korrektionsfaktor för skalning av pyMBMS mätning för en standardmetod för att uppskatta den totala lignin, såsom Klason lignin. Dividera Klason lignin individens värde standard av totala ligninhalten uppmättes för den standardprov med hjälp pyMBMS.
- Tillämpa denna korrektionsfaktor för alla som-arter i datamängden. Upprepa för varje typ av biomassa analyseras. NAnm: Korrektionsfaktorn kan variera avsevärt baserat på S / G av biomassan analyseras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den kombinerade effekten av termo förbehandling och efterföljande enzym saccharification mäts som en funktion av massan av glukos och xylos släpptes i slutet av analysen. Resultaten rapporteras i termer av milligram glukos och xylos som frigörs per gram biomassa. Detta står i skarp kontrast till uppgifter som rapporterats från bänkskaleanalyser, som vanligen rapporteras som procent teoretiskt utbyte baserat på analysen av sammansättningen av utgångsmaterialet. Eftersom det ännu inte är praktiskt att utföra sammansättningsanalys på tusentals prover per vecka, är data som är mest rapporteras som omvandlingsnivåer på massbasis. Detta gör det möjligt för rimliga prov utvärdering så länge jämförelser görs mellan närbesläktade prover av biomassa och sammansättningen av proverna inte varierar för mycket.
Det primära målet med analysen är att utvärdera de relativa skillnaderna i motståndet i växtcellväggen till kombinerad termo / enzymatic försockring i en rad enskilda varianter. Det är värt att notera att analysen inte försöker optimera något av de betingelser som används för försockring. I själva verket, förbehandlings svårighetsgrad villkor är betydligt suboptimala för att utöka känslighetsområde för analysen, riktar en sista omvandlingsutbyte av 50% till 70% av det teoretiska. Förbehandlingsbetingelser vid eller nära optimalt skulle driva alla prover till hög omvandling, kraftigt minska det dynamiska området för analysen. Omvänt är enzymet lastning mycket större än den typiskt rapporterats för bänkskale digestioner. Återigen är målet med metoden inte att hitta det bästa enzym eller minimera enzymet kostnaden, men för att mäta den inneboende motsträvighet av cellväggarna för att omvandling och användning av mycket höga enzymbelastningar avlägsnar variabilitet från analysen.
Slutligen är det viktigt att förstå att variationen i den totala analysen är signifikant högre än den som rapporteras för Bench-skala arbete. Typiska standard fel är omkring 8%, trots att området är mycket bredare. Detta är helt enkelt den typ av småskaliga, HTP forskning. Pipettering och vägningsfel är proportionellt högre vid il och mg skala, som är avdunstning och kondenseringsförluster. Biomassa heterogenitet blir en mycket stor variabel när analys flera storleksordningar färre partiklar i varje prov, det vill säga 5 mg jämfört med flera g. De kolorimetriska analyser användes för att bestämma glukos och xylos korrelerar väl med HPLC-resultat; Men, medan enzymkopplade analyser för sockeranalys är snabb och kan utföras parallellt, de är inte lika exakt som analytiska metoder såsom HPLC, införa ytterligare ett lager av vaghet (Figur 1).
På grund av alla ovanstående bör resultaten endast tolkas och rapporteras inom vissa begränsningar. Data bör undersökas i hela uppsättningar, inte som enskilda prover. Replikat krävs för meaningful resultat. Trender och extremvärden är meningsfulla, men enskilda resultat är det inte. Jämförelser görs bäst inom enskilda experimentella uppsättningar. Jämförelser över temporärt eller rumsligt separerade kampanjer kräver extremt sträng kontroll och noggrann kontroll ska vara meningsfull. HTP uppgifter är inte direkt jämförbar med jämförelse eller annan skala uppgifter. Trender spår mellan HTP och andra skalor, men direkta prov jämförelser inte ger identiska resultat.
Datarepresentation faller typiskt i trender, outliers, eller delpopulation / variant jämförelser. Ett exempel på trender är en undersökning av motspänstighet av 755 naturliga varianter av poppel samplade över ett brett område i nordvästra USA: s 19. Den motspänstighet av dessa prover avsattes mot deras ligninhalt och syringyl / guaiacyl faktorn, som fastställts av pyMBMS. Resultaten indikerar att när S / G stiger, minskar motsträvighet tills ett S / G-förhållande av omkring 2, där motsträvighet improvement planar ut (figur 2). Extremvärden kan tydligt ses i figur 3, där Pt4CL1 genen nedregleras i poppel. Flera hundra sorter screenades och flera är tydligt ökat i motsträvighet, vilket framgår av den minskade socker release. Figur 4 visar en studie där flera olika vete-halm sorter odlades på flera sevärdheter över två år och skörd efter flera variationer i tillväxtbetingelser , vilket resulterar i 20 distinkta populationer baserade på kombinationer av ovanstående variabler. Dessa provningssatser är lätt urskiljas och indikera positiva och negativa variabler för motsträvighet. Figur 5 visar hur pyMBMS kan användas för att utvärdera förändringar i cellväggskomposition. Masspektral fragment är tilldelade olika lignin monomerer (tabell 1). När man jämför ett prov med hög lignin kontra högt kolhydratinnehåll, skillnaderna i spektraldata är uppenbara. Than använder för pyMBMS uppgifter tillsammans med en principalkomponentanalys (PCA) illustreras i figur 6. I detta exempel är proverna klassificeras efter låg eller hög kvävegödsling. Lignin och kolhydratinnehåll anpassa omvänt längs PC1. Användningen av huvudkomponent belastningar tomt kan hjälpa till att identifiera vilka kemiska egenskaper håller på att förklaras i poäng klassificerings tomten, samt klargöra vilka egenskaper förändras mellan prov kluster.
Figur 1: Jämförelse av glukos och xylos kvantifiering med hjälp av hög genomströmning kolorimetriska analyser vs. HPLC 9. Jämförelse av glukos och xylos detektion utfördes med användning Xylos (XDH, övre panelen) och glukosoxidas / peroxidas (GOPOD, nedre fältet) hög genomströmning kolorimetriska enzymkopplade analyser och högpresterande liquid kromatografi.
Figur 2: Recalcitrance av poppel cellväggar som en funktion av syringyl att guaiacyl innehåll (S / G) i lignin 9 öka motspänstighet av poppel cellväggar som en funktion av syringyl att guaiacyl innehåll (S / G) i ligninfraktionen har. observerats och rapporterats. 755 poppel borrkärnor av samma poppel sort övertogs flera hundra miles av skog på den nordamerikanska nordvästra och screenades för glukos och xylos frisättning efter termo förbehandling och enzym saccharification. Resultat plottades mot S / G-förhållandet i cellväggen lignin bestämt genom pyMBMS. Motsträvighet minskar med ökande S / G fram till omkring 2, där det förblir konstant vid högre S / G. Teoretiska flytgränsvärden är baserade på BESC "standard" poppel och tillhandahålls som en Reference för jämförelse.
Figur 3:. Recalcitrance i nedregleras Pt4CL1 uttryck i poppel Down-reglering av Pt4CL1 genen i poppel resulterade i lite variation i cellväggen motspänstighet mellan kloner, men flera drastiskt ökade motsträvighet varianter är lätta att identifiera. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Recalcitrance i olika wheatstraw populationer Effekterna av sorten typ, platsen för odling, gödselspridare, och vattning hastighet resulterar i klart urskiljbara motsträvighet nivåer.. Olika symboler representerar different experimentella tillväxtbetingelser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5:. Tillämpning av pyMBMS för analys av kemiska förändringar i växtcellväggar 28 Topparna markerade med pilar är ligninfragment, och användes för att utvärdera (a) hög lignin (b) medel lignin eller (c) låg ligninhalt.
Figur 6:. Principalkomponentanalys poäng tomt på skillnader i cellväggen kemin för folkrika träd som odlas med högre och lägre befruktningshastigheter 28 (Top) Principalkomponentanalyspoäng plotta illustrerar en exakt klassificering och därför skillnader i cellväggen kemin för folkrika träd som odlas med högre och lägre befruktningshastigheter. Huvudkomponent en lades proverna baserade på högre lignin (negativ) eller högre kolhydrat (positiva) innehåll. (Nederst) De viktigaste komponentbelastningar klarlägga vilka kemiska komponenter växla mellan de två kluster av prover i poäng tomten. De positiva laddningar korrelerar med positiva poäng, som är representativa för högre halter kolhydrater, medan negativt korrelerade belastningar i linje med negativa poäng och därmed högre halt lignin.
| m / z | Molekylär uppdraget 30 | S / G / H uppdrag |
| 94 | fenol | S / G / H |
| 120 | Vinylfenol | H |
| 124 | Guajakol | G |
| 137 | Ethylguaiacol, homovanillin, koniferylalkohol | G |
| 138 | Methylguaiacol | G |
| 150 | Vinylguaiacol | G |
| 154 | Syringol | S |
| 164 | Allyl- + propenyl guajakol | G |
| 167 | Ethylsyringol, syringylacetone, propiosyringone | S |
| 168 | 4-metyl-2,6-dimetoxifenol | S |
| 178 | Koniferylaldehyd | G |
| 180 | Koniferylalkohol, syringylethene | S, G |
| 182 | Syringaldehyd | S |
| 194 | S | |
| 208 | Sinapylaldehyde | S |
| 210 | Sinapylalcohol | S |
Tabell 1:. Peak m / z och uppdrag för lignin härrörande pyrolys fragment som detekteras genom masspektrometri Förteckning över typiska föreningar som upptäckts av pyMBMS. Molekylära uppdrag baserade på Evans, RJ och TA Milne (1987). Molekylär karakterisering av pyrolys av biomassa Energi och bränslen 1 (2):. 123-137.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nyckelprovberedningssteg för att erhålla exakta och reproducerbara data när ledande high-throughput screening experiment är som följer:
Socker frisättningsanalys:
I allmänhet är prover i partier som sträcker sig från några tiotal till flera tusen i taget. Varje stort steg utförs typiskt för alla prover innan han flyttade framåt för att minimera variationer i beredningen mellan prover. De-stärkning var inte ursprungligen en del av protokollet och kan uteslutas i vissa fall. Trä borrkärnor och senesced örtartade material är genomgående låg i stärkelse och därför inte kräver de-stärkning för att minska variabilitet. Stärkelse är en viktig fråga; men i prov uppsättningar av grön vävnad växter, särskilt för stora provmängder där skörden sker under flera timmar. Som stärkelse stiger under dagsljus timmar och är uttömda under mörker, kan stärkelsenivåer variera kraftigt över several h och glukos från stärkelse är omöjlig att skilja från glukos från cellulosa kan därför hög stärkelsenivåer leda till distortedly låga mätningar motspänstighet. Den faktiska enzymbelastningen i destarching steg är av mindre betydelse, så länge som det finns tillräckligt med överskottsaktivitet för att ta bort allt tillgängligt stärkelse inom tidsramen av stärkelse hydrolyssteget. Variationer i de särskilda enzymer som används, tid, temperatur, volym och agitation hastigheten för stärkelse avlägsnande steg kan säkert leda till skillnader i stärkelse borttagning nivåer och och bör bestämmas empiriskt när det är möjligt. Slutligen, när inslagning tepåsar för utvinning, använder tennbelagda koppartråd. Bar koppartråd kan orsaka oönskade kemiska reaktioner med enzymlösningen, vilket ger falska sockervärden. Tennbelagda koppar löst problemet medan tråd av rostfritt stål var inte formbart nog att hålla tepåsar väl tillsluten.
Konsekvent storleks minskning av biomassa är avgörande för accudatahastighet av två skäl: 1) Fint malda biomassa, medan enklare och konsekvent ut, är också lättare att smälta än grövre material. 2) Biomassa som är för grova kan täppa magasinen, vilket resulterar i otillräcklig material eller, om den träsko endast delvis blockerar öppningen, kan den fungera som en sikt och tillåter endast fina partiklar genom, minskar den observerade motsträvighet av provet. Om för lite biomassa finns i magasinen, kan belägga det sidorna av tratten, orsakar roboten att ta magasinet är tomt och provet kommer att hoppas över i dispenseringsprocessen. Dessutom kan låga nivåer av biomassa bidra till överdriven prov heterogenitet, särskilt som tätare partiklar (såsom svålen) tenderar att sikta till botten av könen och få utmatas först. När mindre än 50 mg av material finns tillgängligt, kan analysen fortfarande genomföras; dock bör proverna vara hand vägs. Men resultaten av hand-vägning är mer varierande än de från robotisk vägning.
Den faktiska mängden biomassa som krävs för förberedande åtgärder inte väldefinierad. Vi har föreslagit 250 mg som en rimlig utgångspunkt, uppvisar emellertid varje prov biomassa olika egenskaper när det gäller förluster till följd av hantering, slipning, och utvinna samt hålls i magasinen eller dispens reproducerbart. De olikartade biomassa mellan olika typer och även inom samma typ utesluter en mer definierad protokoll. De som vill genomföra dessa analysmetoder kommer helt enkelt att behöva bestämma många av dessa variabler för sig själva, men erfarenheten gör det lättare.
Ett annat steg som kan införa fel är att blanda i mikrotiterplattor, som är notoriskt svåra och är kritisk i dessa analyser av flera skäl. Enzymlösningen används koncentreras och kan stratifieras vid tillsats till brunnarna, begränsande enzymet tillgänglighet till biomassan. Som försockring fortskrider, den sugars släppt kan också skikta och koncentrera nära biomassa och beroende på samplingsdjupet, kan socker analyser vara artificiellt hög eller låg. Det är därför det viktigt att blanda prover efter enzymtillsats och enzym saccharification, så grundlig blandning av enzymer med biomassan för ännu försockring och jämn fördelning av de resulterande socker för att möjliggöra en konsekvent analys av socker. I form av plattor som inte innehåller biomassa, t ex spädning eller analysplattor har blandning genom upprepad pipettering (sönderdelning) visat sig vara vida överlägsen än skakning. Men som lösningar i detta protokoll har varierande densiteter och partikelnivåer, pipetteringshastighet och vertikal spets läge i vätskepelaren är kritisk. Om hastigheten är för hög, dålig noggrannhet på grund av kavitation (aspiration) och vätskeretention i spetsen (dispense) kan förekomma. Om spetsen är för djupt i brunnen, kan biomassa täppa toppen eller spetsen kan pressas till botten, vilket förhindrar noggrann aspiration, och detär mer yttre yta för vätska att hålla fast vid och överföring till nästa steg. Den senare frågan kan lindras något av kontroll spetstillbakadragande hastighet, såsom långsammare spetseliminerings tillåter vätska som skall avlägsnas till bulklösningen genom ytspänning. Om spetstillbakadragande är för långsam, kan pipetter vätska krypa tillbaka in i bulklösningen samt. Biomassa partiklar har också en tendens att hålla fast vid de tips och bli överförd till utspädningsplattan, där de kan täppa spetsen under blandning eller överföring till analysplattor, skapa felaktigheter i provvolymer analyseras. Dessa partiklar kan också interferera med spektroskopisk analys av analysplattorna om de ockludera ljusstrålen under läsning.
Konsekvent färgutveckling timing är avgörande för GOPOD och XDH analyser. Färgen utveckling måste få gå till fullbordan; tenderar emellertid GOPOD analys färg fortsätta stiga efter färdigställande och NADH alstras av XDH-analysen långsamtminskar på grund av spontan oxidation av NADH. Som en följd av detta kan timing variation leda till inkonsekventa jämförelser av data mellan separata plattor. Analys åtgärder bör övervakas noga, eftersom avbrott på grund av hårdvara eller mjukvara problem kan leda till stora skillnader i analystider. Användningen av socker standarder och standardstyr biomassa brunnar i varje platta kan bidra till att mildra detta i viss utsträckning.
PyMBMS:
Standarder måste övervägas noga för pyMBMS experiment för jämförelse med standard våta kemiska metoder. På grund av den varierande ligninkompositionen (S / G förhållanden) arter biomassa måste korrektionsfaktorn bestämmas med hjälp av ett representativt standard som är densamma art som den experimentella provet. Om det inte finns några lämpliga standard finns, kan skillnader i ligninkoncentration jämföras med hjälp av intensiteten hos lignin prekursorer direkt. Hög S / G-förhållanden (över ~ 3,5) kan leda till överskattning av lignin innehåll genom pyMBMS. Detta orsakas av en tendens för S-lignin att företrädesvis frisläppas på de standardbetingelser som används i denna metod. Dessutom mängden prov som krävs för pyMBMS mätningar beror på vilken typ av biomassa som används. Isolerade lignin- och ligninmodellföreningar kräver mindre material (0,1 mg), som att använda större delmängder av provet kan mätta detektorn.
En annan kritisk steg i PyMBMS processen är noggrann inställning av instrumentet till en känd standard såsom perfluorotributylamin (PFTBA) före varje experiment. PFTBA innehåller molekyltopparna över hela spektrumet av typiska biomassa och därför medger jämn instrument tuning mellan experimentella försök. Den mellersta regionen av PFTBA spektra är avstämd så att m / z 131 och m / z 219 är ungefär 50% av intensiteten av m / z 69. Denna avstämning används för att betona typiska toppar ses i mjuk jonisering (17 eV) används för att minimera fragmenteringen av joner av lägre massa att C Annot lätt identifieras.
Det bör noteras att dessa metoder inte analysmetoder för den exakta kvantifieringen av analyter av intresse. Snarare dessa hög kapacitet tekniker för screening av stora biomassa uppsättningar för att identifiera dem som har de önskade kemiska egenskaper. Dessa metoder bör endast användas för screening, ranking, och sambandet mellan prov inom en datamängd. Data uppsättningar kan inte direkt jämföras när samlas på olika dagar på grund av källor till variation såsom instrumentdrift, förändringar i enzymaktivitet, omgivande fukthalt i biomassan på grund av förändringar i luftfuktigheten, variationer i temperatur, och skillnader i tips och absorbans platt partier . Dessutom är förbehandling som används i provberedningen protokollet inte en optimerad förbehandlingsstrategi, utan har utformats särskilt för att vara optimal. Detta möjliggör subtila skillnader mellan växterna att mer effektivt belysas.
jove_content "> Den största fördelen med att anta hög genomströmning metoder är att många fler prover kan mätas i samma period 18. Till exempel, är en vanlig metod för att analysera kolhydrater som produceras under en syra eller enzymatisk försockring användning av högpresterande vätskekromatografi (HPLC). Selig et al., uppger att den allestädes närvarande två steg syrahydrolys, men ganska bra och avgörande för kvantifiering av strukturella kolhydrater, begränsar forskare att kunna utvärdera cirka 25 prover per vecka 9. Även om den analytiska instrumentering som används i hög genomströmning metoder kanske inte känsligheten hos en standardteknik som HPLC, ger snabb analys forskare lyxen att kunna bedöma stora mängder av prover. Dessutom ofta med hög kapacitet metoder har nedskalad experimentella protokoll, minska användningen av förbrukningsartiklar, och därför minskar experimentella kostnader och avfall.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biomek FX Automated Workstation | Beckman Coulter | Biomek FX | Automated Liquid Handler |
| Wiley mill | Thomas Scientific | 3375E15 (Model 4), or 3383L20 (Mini-mill) | |
| anti-static bags | Minigrip* | MGST4P02503 | 2.5x3", multiple suppliers available |
| tin-coated copper wire | McMaster-Carr | 8871K84 | 0.016" diameter, bend-and-stay wire |
| tea-bags | Herbco | press n' brew teabags | 3.5x5 inches |
| gluco-amylase | Novozymes | Spirizyme Fuel | |
| alpha-amylase | Novozymes | Liquozyme SC DS | |
| sodium acetate trihydrate | any chemical supplier | reagent grade | |
| acetic acid | any chemical supplier | reagent grade | |
| 190 proof (95%) ethanol | any chemical supplier | reagent grade | |
| hoppers | Freeslate | ||
| 96-well C-276 Hastelloy plates | Aspen Machining (Lafayette, Colorado) | N/A (custom built) | |
| 1/8” soldering iron tip | Sears | ||
| silicone-adhesive backed Teflon tape | 3M | 5180 | 3" wide (36-yard rolls) |
| enzyme solution | Novozymes | Cellic CTec2 | |
| citric acid monohydrate | any chemical supplier | ||
| trisodium citrate dihydrate | any chemical supplier | ||
| disposable, polystyrene 96-well plates | Greiner Bio-One | 655101 | or equivalent; multiple suppliers available |
| glucose oxidase/peroxidase | Megazyme | K-Gluc | Megazyme D-glucose assay kit |
| xylose dehydrogenase | Megazyme | K-Xylose | Megazyme D-xylose assay kit |
| glucose standard solution | Megazyme | K-Gluc | Megazyme D-glucose assay kit |
| xylose standard solution | Megazyme | K-Xylose | Megazyme D-xylose assay kit |
| stainless steel sample cups | Frontier Laboratories | PY1-EC80F | |
| glass fiber sheets | Pall | 66227 | 8x10" sheets; circles punched with standard hole punch |
| Sugarcane Bagasse Whole Biomass Feedstock | NIST | 8491 | |
| Eastern Cottonwood (poplar) Whole Biomass Feedstock | NIST | 8492 | |
| Monterey Pine Whole Biomass Feedstock | NIST | 8493 | |
| Wheat Straw Whole Biomass Feedstock | NIST | 8494 |
References
- U.S. Billion-Ton Update: Biomass Supply for a Bioenergy and Bioproducts Industry. Perlack, R. D., Stokes, B. J. , Oak Ridge National Laboratory. Oak Ridge, TN. (2011).
- Henry, R.
- Henry, R. J. Evaluation of plant biomass resources available for replacement of fossil oil. Plant Biotechnol. J. 8 (3), 288-293 (2010).
- Furtado, A., et al. Modifying plants for biofuel and biomaterial production. Plant Biotechnol. J. 12 (9), 1246-1258 (2014).
- Sluiter, J. B., Ruiz, R. O., Scarlata, C. J., Sluiter, A. D., Templeton, D. W. Compositional analysis of lignocellulosic feedstocks. 1. Review and description of methods. J. Agric. Food Chem. 58 (16), 9043-9053 (2010).
- Lupoi, J. S., Singh, S., Simmons, B. A., Henry, R. J. Assessment of Lignocellulosic Biomass Using Analytical Spectroscopy: an Evolution to High-Throughput Techniques. Bioenerg. Res. 7 (1), 1-23 (2014).
- Lapierre, C., Monties, B., Rolando, C. Thioacidolysis of lignin: comparison with acidolysis. J. Wood Chem. Technol. 5 (2), 277-292 (1985).
- DeMartini, J. D., Studer, M. H., Wyman, C. E. Small-scale and automatable high-throughput compositional analysis of biomass. Biotechnol. Bioeng. 108 (2), 306-312 (2010).
- Selig, M. J., et al. High throughput determination of glucan and xylan fractions in lignocelluloses. Biotechnol. Lett. 33 (5), 961-967 (2011).
- Selig, M. J., et al. Lignocellulose recalcitrance screening by integrated high-throughput hydrothermal pretreatment and enzymatic saccharification. Ind. Biotechnol. 6 (2), 104-111 (2010).
- Studer, M. H., De Martini, J. D., Brethauer, S., McKenzie, H. L., Wyman, C. E. Engineering of a high-throughput screening system to identify cellulosic biomass, pretreatments, and enzyme formulations that enhance sugar release. Biotechnol. Bioeng. 105 (2), 231-238 (2009).
- Gjersing, E., Happs, R. M., Sykes, R. W., Doeppke, C., Davis, M. F. Rapid determination of sugar content in biomass hydrolysates using nuclear magnetic resonance spectroscopy. Biotechnol. Bioeng. 110 (3), 721-728 (2013).
- Templeton, D. W., Sluiter, A. D., Hayward, T. K., Hames, B. R., Thomas, S. R. Assessing corn stover composition and sources of variability via NIRS. Cellulose (Dordrecht, Netherlands). 16 (4), 621-639 (2009).
- Tucker, M. P., et al. Fourier transform infrared quantification of sugars in pretreated biomass liquors. Appl. Biochem. Biotechnol. 84-86, 39-50 (2000).
- Wolfrum, E. J., Sluiter, A. D. Improved multivariate calibration models for corn stover feedstock and dilute-acid pretreated corn stover. Cellulose (Dordrecht, Netherlands). 16 (4), 567-576 (2009).
- Ona, T., et al. Non-destructive determination of wood constituents by Fourier-transform Raman spectroscopy. J. Wood Chem. Technol. 17 (4), 399-417 (1997).
- Ona, T., Sonoda, T., Ohshima, J., Yokota, S., Yoshizawa, N. A rapid quantitative method to assess eucalyptus wood properties for kraft pulp production by FT-Raman spectroscopy. J. Pulp Pap. Sci. 29 (1), 6-10 (2003).
- Hames, B. R., Thomas, S. R., Sluiter, A. D., Roth, C. J., Templeton, D. W. Rapid biomass analysis. New tools for compositional analysis of corn stover feedstocks and process intermediates from ethanol production. Appl. Biochem. Biotechnol. 105-108, 5-16 (2003).
- Studer, M. H., et al. Lignin content in natural Populus variants affects sugar release. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (15), 6300-6305 (2011).
- Chen, M., Zhao, J., Xia, L. Comparison of four different chemical pretreatments of corn stover for enhancing enzymatic digestibility. Biomass Bioenergy. 33 (10), 1381-1385 (2009).
- Davison, B. H., Drescher, S. R., Tuskan, G. A., Davis, M. F., Nghiem, N. P. Variation of S/G ratio and lignin content in a Populus. family influences the release of xylose by dilute acid hydrolysis. Appl. Biochem. Biotechnol. 129-132, 427-435 (2006).
- Li, X., et al. Lignin monomer composition affects Arabidopsis cell-wall degradability after liquid hot water pretreatment. Biotechnol. Biofuels. 3, 27-33 (2010).
- Lupoi, J. S., et al. High-throughput prediction of eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using multivariate analysis: a comparison between mid-infrared, near-infrared, and Raman spectroscopies for model development. Biotechnol. Biofuels. 7, 93 (2014).
- Lupoi, J. S., Smith, E. A. Characterization of woody and herbaceous biomasses lignin composition with 1064 nm dispersive multichannel Raman spectroscopy. Appl. Spectro. 66 (8), 903-910 (2012).
- Sun, L., et al. Rapid determination of syringyl:guaiacyl ratios using FT-Raman spectroscopy. Biotechnol. Bioeng. 109 (3), 647-656 (2012).
- Lupoi, J. S., et al. High-throughput prediction of Acacia and eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using FT-Raman spectroscopy and partial least squares modeling. Bioenerg. Res. in press, (2015).
- Sykes, R., Kodrzycki, B., Tuskan, G., Foutz, K., Davis, M.
- Sykes, R., et al. Ch. 12. High-Throughput Screening of Plant Cell-Wall Composition Using Pyrolysis Molecular Beam Mass Spectroscopy. Biofuels: Methods and Protocols. Mielenz, J. R. 581, 169-183 (2009).
- Decker, S., et al. Ch. 17. Reducing the effect of variable starch levels in biomass recalcitrance screening). Biomass Conversion. Himmel, M. E. 908, Humana Press. 181-195 (2012).
- Evans, R. J., Milne, T. A.
