Introduction
비 재생 연료 및 관련 제품 하락의 글로벌 공급으로, 과학자들은 식물 유래 소스 1에서 유사 연료 및 화학 물질을 만드는 데 도전하고있다. 이 작업의 핵심은 식물의 종은 바이오 연료 및 바이오 소재 2,3의 생산에 적합 할 수있는 결정하는 것입니다. 일반적으로 이러한 원료는 리그닌, 셀룰로오스 및 헤미셀룰로오스 콘텐츠에 대한 평가; 뿐만 아니라 또는 이후의 효소 당화하지 않고, 열 기계, 및 / 또는 화학적 전처리를 통해 해체 (반항)에 감수성있다. 자세한 분석이 필요 헤미셀룰로오스, 리그닌 및 분획물의 특정 조성물뿐만 아니라 최적의 효소 활성을 결정하기 위해 사용된다. 본질적으로 원하는 상품에 생화학 적 또는 열 화학적 변환을위한 이상적인 특성을 소유하지 않는 식물의 형질 변경은 냄비의 크게 확장 된 소스와 연구자를 제공하고 있습니다ential 원료 4. 작은 샘플 세트에 매우 유용하지만, 화학 플랜트의 특징을 정량화하는 표준 분석 방법은 시료 5-7 수백 또는 수천의 신속한 스크리닝 부적당하다. 본원에 기재된 방법 HTP 신속하고 효율적으로 열 화학적 및 / 또는 효소 분해에 세포벽 들음의 변화를 바이오 매스 변이체 다수을 평가하기 위해 개발되어왔다.
그것은 HTP 스크리닝 분석법은 본원에 기술 된 변환이나 수율을 최대화하도록 설계되지 않았다는 것을 이해하는 것이 중요하다. 목적은 관련 미생물 시료 극한 들음에 상대적인 차이를 결정하는 것이다. 결과적으로, 분석 단계의 많은 목적은 최대 전환율 또는 범위를 획득하는 것 "전형적인"바이오 매스 변환 분석, 다르다. 예를 들어, 저급 전처리 심각도 짧은 효소 가수 분해 시간은 다를 최대화하기 위해 이용된다샘플 사이에 화상 으. 대부분의 경우, 상대적으로 높은 효소 로딩 상당히 결과를 왜곡 할 수있는 효소 활성 실험 변형으로 인한 차이를 감소시키기 위해 사용된다.
식물 세포 벽과 단량체 설탕의 구성을 결정하기위한 신속한 기술은 효소 당화 적외선 등의 진동 분광학과 같은 로봇, 사용자 정의, 열화학 호환 96 웰 플레이트 및 표준 실험 방법 8-11의 수정 및 악기 프로토콜을 (포함 다음의 해방 (IR), 근적외선 (NIR), 또는 라만) 및 핵 자기 공명 (NMR) 12-17. 이 방법은 실험의 감소로 이어지는 높은 셀룰로오스 또는 낮은 리그닌 내용, 또는 가장 높은 포도당, 자일 로스, 에탄올을 산출하기 위해 예상되는 등 이러한 방법은 바이오 매스 및 소모품의 소량을 사용 축소 된 분석을 활성화와 원료를 분리하는 열쇠입니다 비용 (18) 9, 포플러 8, 10, 사탕 수수 사탕 수수 (8), 및 스위치 그래스 (8)과 같은 인기있는 원료는 성공적으로 HTP 방법을 사용하여 평가되었다.
총 리그닌과 리그닌 단량체 조성물은 또한 일반적으로 바이오 매스의 특성을 정량화하고 있습니다. 리그닌 함량의 감소는 다당류 (19, 20)의 효소 소화율을 증가시키는 것으로 나타났다. 리그닌 단량체 비율 (자주 syringyl / guaiacyl (S / G) 내용보고)이라는 역할은 아직 조사 중입니다 식물 세포 벽의 해체에서 재생됩니다. 일부 보고서는 지적했다 그 S / G의 감소다른 연구는 반대의 경향 19, 22을 공개하면서 비는 가수 분해 (21) 다음의 증가 포도당 수익률되었다. 리그닌과 단량체를 평가 처리량이 방법은 진동 다변량 분석 결합 분광법 (IR, NIR 및 라만 23-26), 및 열분해 분자 빔 질량 분석법 (pyMBMS) 27, 28을 포함한다.
매스 HTP 스크리닝 방법을 개발하는 경우, 여러 일체 고려 유념 할 필요가있다. 하나의 중요한 양상은 방법의 복잡성이다. 기술에 필요한 기술 수준은 무엇인가? 계량 화학 분석, 예를 들어, 구성, 평가 및 예측 모델을 유지하기위한 특별한 기술을 필요로한다. 표준 방법은 바람직하지 않은 준비 또는 데이터 분석 단계를 전시 또는 독성 시약을 사용한다. 모델의 개발은 새로운 데이터 모델의 견고성을 높이기 위해 시간 동안 모델에 통합 진행 과정이다. 또 다른 consideration은 비용을 절감하고 제안 된 고 처리량 방법의 실험적 분석 시간을 감소시켰다. 상기 방법은 상당히 빠르게하지만, 매우 고가 인 경우가 많은 실험실 채택위한 가능한 방법이 될 수 없다. 이 원고에 도시 된 방법은 스루풋 성능들을 증폭하도록 수정 표준화 기술의 변형이다. 이러한 프로토콜은 정량적 예측 모델의 개발을 필요없이 관심있는 미생물의 특성을 측정한다. 표준 모델을 개발하는 데 사용되는 분석과 강한 상관 관계를 보이는 동안이 예측 방법부터이 기술의 핵심 속성이다, 실제로 샘플에 대한 관심의 양을 측정하는만큼 정확하지 않습니다. 기본적으로 표준 벤치 규모 분석 방법의 버전을 축소되어 사용되는 방법 반면, 정확도와 정밀도는 속도와 처리량을 상장되어 거래되고있다. 대부분,이 결과는 작은 볼륨 피펫 및 무게에 더 높은 오류로 인해; 뿐만 아니라 증가 된 에스샘플 크기와 충분한 이질성이 감소된다. 큰 샘플 세트가 상영과 비교 될 수 있지만 별도의 캠페인 사이의 벤치 규모의 결과 비교를 할 때, 큰주의를 기울여야한다.
대부분의 시간 소모 단계 바이오 매스의 물리적 조작을 포함한다. 연삭 샘플은 샘플 사이의 밀을 청소 포함 샘플 당 몇 분을 취할 수있다. 수동, 하역, 청소 호퍼로드 및 작성, 차 가방 및 샘플 가방을 비우는 것은 매우 노동 집약적이다. 각 단계는 분 이상 걸릴 수 있지만, 샘플의 일을 수천 몇 시간 또는 며칠이 걸릴 수 있습니다. 로봇은 약 3 ~ 4 시간 또는 6 -1 플레이트 하루 8 로봇 바이오 매스와 일반적인 원자로 판을로드 할 수 있습니다 -1. 이러한 상황은 물론 시험 될 형 바이오 매스의 양으로 사용 정밀도 파라미터들에 의존한다. 물과 반응 판을 작성, 산을 희석 또는 효소 신속하게 액체 처리 로봇을 사용하여 수행됩니다. 피접시 스택 (1-20 반응 판)의 재치료는 어셈블리, 냉각시 1 ~ 3 시간 소요되며, 분해가 포함되어 있습니다. 효소 가수 분해 3 일 걸리며 당 분석 결과 분석을 완료하고 읽을 준비 시간 약 1 시간 플러스 반응기 접시 당 10 분을 필요로한다. 설정 전처리 및 분석 일의 주간 스케줄은 지속적으로 주당 800 ~ 1,000 샘플을 분석의 인간의 구성 요소에 대한 이상한 시간과 주말 노력을 최소화, 합리적인 작업 일정을 수용하고 처리 할 수 있습니다. 최대 처리량이 많은 하드웨어 (로봇, 원자로 판 등), 얼마나 많은 "소프트웨어"(즉, 인력)이 수동 작업을 할 수 있습니다 주로하는 방법, 여러 가지 요인에 따라 달라집니다. 실제 상한은 2,500 ~ 3,000 샘플 / 주이다 그러나, 출력은 칠일 - 주 작업과 다수의 학생 인턴 및 기술자를 필요로한다. 비교하여, HPLC에 의해 3,000 샘플 SAM의 약 125일을 필요PLE 분석 플러스 수동으로 분석하기 전에 원자로 및 필터링 샘플로 샘플 무게의 추가 노동.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
포도당과 크 실리 톨 수익률의 1. 높은 처리량 결정은 효소 당화 9, 29에 따라
- 샘플 준비 (디 - 녹말, 분쇄, 추출, 전처리)
- 와일리 밀, 이러한 입자는 20 메쉬를 통과하는 것이 (850 μm의) 스크린을 사용하여 각 시료의 바이오 매스의 적어도 300 mg의 분쇄. 정전기 방지 지퍼 가기 가방에 이동 (일반적으로 바코드) 및 바코드 데이터베이스에 기록 샘플 정보를 제공합니다.
- 조심스럽게 차 가방 (잉크 또는 마커를 사용하지 않는, 연필)을 방지하기 위해 바이오 매스를 통해 끝을 접어해야되고, 티 백을 롤 번호가 약 250 mg의 또는 정전기 방지 가방에서 지상 바이오 매스의 더 추가 드 녹말 추출하는 동안 손실.
- 주석 도금 구리 와이어를 사용하여 폐쇄 티백을 싸서. 각각의 바코드 샘플에 대한 티백 번호를 기록한다.
- 상업 효소 (일반적으로, 0.25 % (v / v)의 글루코 아밀라제 (~ 1600 AGU / L)과에서 드 녹말 효소 솔루션을 준비1.5 % (v / v)의 알파 - 아밀라제 0.1 M 나트륨 아세테이트 (~ 2,900 KNU-S / L) (PH 5.0)). 대량의 바이오 매스 g 당 16 mL를 120 티백 샘플 당 500 mL로 준비합니다. 주 : 접지 매스로부터 전분을 제거 할 수있는 하중은 효소 로딩 및 비율의 범위로 소화 한 후 전분을위한 시험함으로써 경험적으로 결정되어야한다.
- 플라스틱 용기에 일괄 접지 매스 1g 당 탈 녹말 효소 용액 16 ml를 추가. 일괄 드 녹말 프로토콜의 경우, 버퍼 효소 용액 500 ml의 120 티 백을 추가합니다.
- 가능한 전분을 제거하기 위해 120 rpm으로, 24 (± 4) 시간 동안 55 ℃에서 진탕에 품어.
- 디 녹말 인큐베이션 후 헹구고 30 분 동안 탈 이온수로 여러 리터 매스 소크. 캐스케이드에 뜨거운 액체 에탄올을 일으키는 원인이되는 솔루션의 수준에 갑자기 폭력적인 상승을 초래할 수있는 솔루션에 가스 거품의 범핑 (형성 될 수 있습니다 버퍼 염을 제거하려면이 과정을 두 개의 추가 번 반복추출 동안 반응 용기) 중.
- 드 먹인 바이오 매스의 철저한 세척에 따라, 추출을위한 속 슬렛 컬럼에 티 백을 배치합니다. 어떤 골무는이 단계에서 필요하지 않습니다.
- 95 % 에탄올을 사용하여, 속 슬렛 역류를 설정하고 24 시간 동안 샘플을 추출합니다.
- 속 슬렛 반응기에서 티 백을 제거하고 평평한 쟁반에 하나의 층에 확산.
- 샘플 흄 후드에서 실온에서 밤새 건조되도록.
- 티 백을 풀다 원래 바코드 정전기 방지 가방에 건조 된 바이오 매스를 반환합니다.
주 : 정전기 잡화 취급 특성, 바이오 매스에 정전기를 감소시키는 개선에 효율적이다. 다른 저장 옵션을 사용하는 경우, 추가 매스 인해 저장 용기의 측면에 집착 매스에 필요할 수있다. - 바코드 호퍼에 건조 된 바이오 매스의 50 mg의 이동 (더 재료를 사용하여 정확한 분배를 위해 더 낫다). 에스정전기 방지 가방 및 수신 호퍼의 바코드는 정확한 샘플 추적을 보장 할 수 있습니다.
- 고체가 랙에 샘플의 순서에주의를 기울이고, 로봇의 무게 위에로드 호퍼. 사용 된 플레이트의 수에 따라 분배 프로토콜을 모든 샘플을 포함하고 선택 충분히 반응기 판을로드.
- 로봇 부식 방지 스테인레스 스틸 96 웰 플레이트에 (0.3 mg을 ±) 건조 된 시료의 5 mg의 무게. 지역화 된 변형을 최소화하기 위해 분산 판 주위의 각 샘플을 3 회 반복 달아.
- 분석 성능을 추적하기 위해 잘 특성화 바이오 매스 표준 물질의 8 제어 바이오 매스 샘플을 포함합니다. 여러 접시를 들어, 여러 표준 바이오 매스 호퍼의 사용은 반복 분배주기를 통해 호퍼에 체질에 의한 입자 크기 드리프트를 최소화 할 수 있습니다.
참고 : 각 플레이트에서 3 복제, 탈 이온수와 효소로 구성된 4 공백, 8 contro 24 샘플이 있어야한다LS, 이전에있어서 표준을 사용하는 바이오 매스. 판의 4 모서리의 각의 3 코너 우물은 설탕 표준을 위해 예약되어 있습니다. - 잘못된 바이오 매스 입자 빈 설탕 표준 우물을 확인하고있는 경우 제거합니다.
- 각 웰에 탈 이온수 250 μl를 추가하고, 실리콘 접착제 백업 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) 테이프로 번호판을 봉인.
- 1/8 "납땜 인두 팁을 사용하여, 각각의 판에 대한 각각의 스팀 포트 (117 총)에 PTFE 테이프를 관통. 가이드로 밀폐 된 원자로 접시에 쌓여 빈 접시를 사용하여 PTFE를 필름의 이동을 제한 할 수 있습니다.
- 단단히 상단과 스택의 바닥에 접시와 빈 판 사이 0.031 "두께의 유리 강화 PTFE 가스켓 (스팀 포트 구멍 천공)으로 판을 클램프. 17.5 분, 또는 원하는 심각도에 따라 다른 온도 / 시간 조합에 대해 180 ° C로 설정 증기 반응기를 사용하여 샘플 전처리.
- 50 ℃로 냉각 원자로 판; C 탈 이온수로 홍수.
- 효소 당화
- 1.0 M 시트르산 나트륨, pH 5.0으로 8 % (v / v)의 효소 용액 이루어진 당화 효소 용액을 제조 하였다. 원자로 판 당 5 mL를 준비합니다. 주 : 특정 효소 스톡 용액의 활성 및 단백질 함량에 기초하여 결정될 필요 희석한다.
- 플레이트가 멋진 경우, 20 분 동안 1,500 XG에서 스윙 버킷 로터에서 그들을 원심 분리기. 필름을 밀봉 제거합니다. 참고 :이 판은 무겁와 원심 분리기 사양의 호환성을 확인해야합니다.
- 각 웰 (G 바이오 매스 당 70 mg의 효소)에 8 % 효소 원액의 40 μl를 추가합니다.
- 새로운 PTFE 테이프로 봉인. 자기 플레이트 클램프로 밀봉 플레이트를 놓습니다.
- 조심스럽게 반전에 의해 샘플 (이상 15 회)를 혼합하고, 70 시간 동안 50 ℃에서 배양.
- 당화가 체결되면, 반전에 의해 믹스 1,500 X에서 번호판을 원심 분리20 분 동안 G.
- 설탕 분석
- 6 글루코스 0.014 M 시트르산 완충액 크실 로스 결합 검정 표준 0 내지 0.750 ㎎ / ㎖ 범위 (PH 5.0)의 세트 준비 (0, 0.2, 0.3, 0.45, 0.65, 및 0.75 mg의 / ㎖ 권장) 및 0-0.600 ㎎ / ㎖ (0, 0.1, 0.2, 0.35, ml의 권장 0.45, 0.6 밀리그램 /)는 각각 포도당과 자일 로스, 대한.
- 키트의 지침에 따라 포도당 산화 효소 / 퍼 옥시 다제 (GOPOD) 및 자일 로스 탈수소 효소 (XDH) 시약을 준비합니다.
- 피펫을 사용하여, 반응 플레이트의 모서리 우물 (총 12 우물)에 인접한 4 코너 우물과 가장자리의 우물에서 액체의 200 μl를 제거합니다.
- 피펫을 사용하여, 96- 웰 평면 바닥 폴리스티렌 희석 플레이트의 각 웰에 탈 이온수 180 μL 분주. (12) 당 표준 및 코너 우물에 물을 추가하지 마십시오 (96 채널 헤드를 사용하는 경우 그 팁을 제거).
- 피펫을 사용하여, PL 포도당 분석의 각 웰에 180 ㎕를 GOPOD 시약을 분배먹었다.
- 피펫을 사용하여, 글루코오스 분석 플레이트의 각 웰에 180 μL의 XDH 시약 분주.
- 피펫을 이용하여 희석 플레이트 96 웰 반응 플레이트로부터 20 μL 분취 분해물 옮긴다. 우물의 상부에서 피펫은 바이오 매스 고체와 코너 우물에 잔류 액을 방지 할 수 있습니다. 적어도 10 사이클 저작하여 혼합한다.
- 피펫을 사용하여 희석 플레이트의 모서리 우물, 중복, 설탕 표준의 110 μl를 전송합니다.
- 피펫을 사용하여 포도당과 자일 로스 분석 플레이트에 희석 플레이트에서 20 μL 씩 전송합니다. 분쇄하여 섞는다.
- 30 분 동안 실온에서 글루코오스 및 글루코오스 분석 판을 배양한다. 주의 깊게 읽기 전에 어떤 표면의 거품을 휴식. 간략 판의 표면에 전달되는 열 총은 잘 작동합니다.
- 자외선 / 가시 96- 웰 플레이트 판독기를 사용하여 510 nm의 파장을 측정하고 설정 시약 블랭크에 대해 흡광도를 기록한다.이 측정은 글루코오스 농도에 비례 퀴논 이민의 형성을 모니터링한다. 글루코스 농도는 1.3.1에서 제조 검정 표준에 기초하여 검량선으로부터 계산된다.
- 자외선 / 가시 96- 웰 플레이트 판독기를 사용하여 340 nm의 파장을 측정하고 설정 흡광도를 기록한다. 이 측정은 글루코오스 농도에 비례하는 NADH의 NAD + 환원을 모니터링한다. 글루코오스 농도는 1.3.1에서 제조 검정 표준에 기초 검량선으로부터 계산된다.
pyMBMS 28 사용하여 총 리그닌과 리그닌 단량체 내용의 2. 높은 처리량 결정
- 샘플 준비
- 분쇄 및 단계 1.1.1 및 1.1.6-1.1.8에서 설명한 방법을 이용하여 바이오 매스를 추출 하였다. 이 연마하고 실험적인 컨트롤을 사용하여 표준 집합의 추출이 포함되어 있습니다.
참고 : pyMBMS의 지표 성과를ements하지 입도 의존하므로 만 pyMBMS 프로토콜을 사용하는 경우, 미생물 제제 샘플 <샘플 홀더에 4mm 맞게 있도록 수행되어야한다. - 약 4 mg의 작은 주걱을 사용하여 분배 자동 샘플러 위해 설계된 80 μL 스테인레스 컵에 준비된 바이오 매스 (3~5 mg을 선호).
- 분석 된 시료의 적어도 10 %는 국립 표준 기술 연구소에서 사용할 수있는 등의 관리 기준 있는지 확인하십시오 (사탕 수수 사탕 수수-8491, 포플러-8492, 소나무 - 8493 또는 밀 밀짚 8494). 표준은 이미 표준 방법을 사용하여 특성화되었다 분석 될 샘플 유사한 어떤 종류 일 수있다.
- 무작위로 인해 시간이 지남에 따라 가능한 분광계 드리프트에 편견을 방지하기 위해 핀셋을 사용하여 자동 샘플러 컵에 샘플을로드합니다. 주의 : 샘플의 전형적인 랜덤는 다시 랜덤이어서 일단 모든 샘플의 측정 값을 포함 할 것이다중복 측정 용 샘플의 순서. 무작위 프로그램은 온라인으로 사용할 수 있습니다.
- 표준 홀 펀치를 사용하여 수동으로 바인더와, 입력 A / D 유리 섬유 시트로부터 유리 필터 디스크를 생성한다. 핀셋으로 둥근 유리 섬유 필터를 잡고 샘플 컵에 그것을 센터, 실험 기간 동안 각 컵에 재료를 한정하기 위해 3.5 mm 육각 렌치를 사용하여 샘플로 밀어 넣습니다.
- 분쇄 및 단계 1.1.1 및 1.1.6-1.1.8에서 설명한 방법을 이용하여 바이오 매스를 추출 하였다. 이 연마하고 실험적인 컨트롤을 사용하여 표준 집합의 추출이 포함되어 있습니다.
- 경음악 프로토콜
- 실험 샘플에 대해 존재할 수있는 화합물의 전체 범위에서 피크 강도를 갖는 공지 된 표준을 이용하여 질량 분석을 교정. 일반적으로 바이오 매스 샘플은, 루오 로트리 (PFTBA)를 사용합니다.
- 가스 유량계를 사용하여 0.9 L / 분의 헬륨 캐리어 가스 유량을 설정한다.
- 500 ℃의 열분해 온도 및 오토 샘플러 소프트웨어를 사용하여 350 ° C로 인터페이스 온도로 자동 샘플러로를 설정한다. 참고 : 1/8 "스테인레스 스틸 가열질량 분석기로 자동 샘플러를 접속 가열 테이프에 싸서 전달 라인은 250 ℃에서의 열 제어를 이용하여 제어된다.
- 질량 분석기에 대한 데이터 수집을 시작하고 배경 스펙트럼 수집을위한 충분한 데이터를 얻기 위해 최소 60 초를 기다립니다.
- 2.2.2의 사양을 자동 자동 샘플러 방법을 시작합니다. 참고 : 자동 샘플러 자동 샘플러로에 개별적으로 각각의 샘플을 삭제합니다. 총 데이터 획득 시간은 약 1.5 분이며; 그러나, 일반적인 4 mg의 시료의 열분해는 30 초 후에 완료됩니다.
- 0.5 초 스캔 속도로 질량 분석 소프트웨어를 사용하여 각 샘플의 기록 총 이온 함유량 (TIC). M / Z 30-450 사이의 기록 강도.
참고 : 일반적인 바이오 매스 화합물은 17 eV의에서 부드러운 이온화를 사용합니다. 장비는 1,000 M / Z 1에서 더 큰 간격을 기록 할 수 있습니다; 그러나, 스캔 속도는 컴퓨터의 CPU 파워에 의해 제한됩니다. - 엄마를 사용하여 스펙트럼에서 배경을 제거nual 소프트웨어의 기능을 향상시킬 수 있습니다. 주 : 데이터 수집의 시작에서 초기의 주사 부 (60)는 배경 평균 값을 계산하는데 사용된다. 이 평균 배경 스펙트럼은 질량 분석기 소프트웨어에서 자동 실험 샘플 스펙트럼으로부터 제거된다.
- 데이터베이스 프로그램에 각 샘플에 대한 분광 데이터를 포함하는 질량 분석기 소프트웨어에 의해 생성 된 단일 열 텍스트 파일을 가져 오기 및 하나의 데이터베이스로 모든 샘플을 결합한다. 스프레드 시트에 적용 가능한 메타 데이터를 추가합니다. 통계 소프트웨어 패키지로 형식의 데이터 (스프레드 시트 / CSV 파일을) 가져 오기 및 열분해 샘플 질량의 변화를 설명 할 수있는 스펙트럼을 정상화 의미한다.
- 측정에 사용되는 복제 표준 샘플의 그룹을 분석 스펙트럼 데이터를 이용하여 주성분 분석 (PCA)을 수행하는 통계 소프트웨어 패키지를 사용하여,뿐만 아니라 화학적 분류에 통합되는 피크 평가할부하의 화합물은 28 플롯.
PCA는 그룹 그들의 스펙트럼의 유사성을 기준으로 샘플을하고, 표준 검사로 인해 운전 중 기기의 드리프트에 실험 오차를 측정 할 수 있습니다 :합니다. - 리그닌 syringyl (S) / guaiacyl (G)의 비율을 계산하기 위해, S 피크의 면적 합계 (m / z = 154, 167, 168, 182, 194, 208, 및 210) G 피크의 합으로 나눈 124, 137, 138, 150, 164, 178에서.
- 총 리그닌 함량을 계산 m / z = 120, 124, 137, 138, 150, 152, 154, 164, 167, 178, 180, 182, 194, 및 210 리그닌 피크를 합산한다.
- 이러한 Klason 리그닌으로, 총 리그닌을 추정하기위한 표준 방법에 pyMBMS 측정을 스케일링하는 보정 팩터를 계산한다. pyMBMS를 사용하여 해당 표준 시료에 대한 측정 된 총 리그닌 함량에 의해 개별 표준의 Klason 리그닌 값을 나눈다.
- 데이터 세트에있는 모든 종 등이 보정 계수를 적용한다. 분석 바이오 매스의 각 유형에 대해이 단계를 반복합니다. NOTE : 보정 계수가 크게 분석 바이오 매스의 S / G에 기초하여 변할 수있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
열 화학적 전처리 및 후속 당화 효소의 결합 된 효과는 분석의 단부에 해제 포도당과 자일 로스의 질량의 함수로서 측정된다. 결과는 바이오 매스의 g 당 발표 포도당과 자일 로스의 밀리그램의 관점에서보고됩니다. 이것은 일반적으로 출발 물질의 조성 분석에 기초하여 이론적 퍼센트 수율로보고 벤치 스케일 분석에서보고 된 데이터에 대조적이다. 아직 주 당 샘플 수천 성분 분석을 수행하는 것이 실용적이지 않다 같이, 데이터는 가장 질량 기준 변환 수치로보고된다. 비교가 너무 많이 변하지 않는 밀접하게 관련된 미생물의 시료와 시료 사이에 조성 된 바와 같이이 긴 적당한 샘플 평가를 허용한다.
분석의 주요 목표는 결합 열화학 / enzym에 식물 세포벽의 저항의 상대적인 차이를 평가하는 것이다개별 변형의 범위에 걸쳐 ATIC 당화. 이 분석법은 당화 사용 조건 중 하나를 최적화하는 것을 시도하지 않는 주목할 가치가있다. 사실, 전처리 조건은 이론적 심각도의 50 % 내지 70 %의 최종 환산 수율을 대상으로, 분석의 감도 범위를 확장하기 위해 상당히 차선책이다. 또는 근처에서 최적의 조건은 크게 전처리 분석의 동적 범위를 좁혀, 높은 변환 모든 샘플을 밀어 것이다. 반대로, 효소로드는 일반적으로 벤치 규모의 digestions에 대해보고 된 것보다 훨씬 더 크다. 다시,이 방법의 목적은 가장 효소를 발견하거나 효소의 비용을 최소화하지만, 변환 세포벽 극한 들음을 측정하고 매우 높은 효소 로딩을 사용하는 분석에서 변동을 제거하는 것이 아니다.
마지막으로, 상기 분석에서의 전체 변화는 benc 대해보고 된 것보다 상당히 높다는 것을 이해해야H 규모의 작업. 더 넓은 범위는 비록 전형적인 표준 오차는 8 % 정도였다. 이것은 단순히 소규모 HTP 연구의 본질이다. 증발 및 응축 손실만큼 피펫과 계량 오류, μL 및 mg의 규모에 비례하여 더 높다. 즉, 5 mg의 대 다수를 들어, 각 샘플의 크기 이하의 입자의 여러 가지 주문을 분석 할 때 바이오 매스의 이질성이 매우 큰 변수가된다. 비색 분석은 포도당과 자일 로스는 HPLC 결과와 상관 관계가 결정하는 데 사용; 당 분석 용 효소 - 결합 분석법 빠르다 병렬로 수행 될 수 있지만 그러나, 그들은 같은 HPLC 등의 분석 방법의 부정확성의 다른 층을 도입 (도 1)만큼 정확하지 않다.
때문에 상기 모든 고려에, 결과 만 해석되어야하고, 어떤 한계 내에서보고 하였다. 데이터는 전체 세트, 개별하지 샘플에서 검토되어야한다. 복제는 MEA 필요ningful 결과. 동향 및 아웃 라이어는 의미가 있지만, 하나의 결과는 아니다. 비교는 가장 좋은 하나의 실험 세트 내에서 만들어집니다. 시간적 또는 공간적으로 분리 된 캠페인에서 비교는 의미로 매우 엄격한 통제와주의 깊은 조사가 필요합니다. HTP 데이터는 벤치 또는 다른 스케일 데이터에 직접 비교할 수 없습니다. 동향 HTP 및 기타 저울 사이에 추적하지만, 직접 샘플 비교는 동일한 결과를 얻을 수 없습니다.
데이터의 표현은 일반적으로 동향, 아웃 라이어, 또는 하위 인구 / 변형 비교에 빠진다. 동향의 예는 미국 (19)의 퍼시픽 노스 웨스트에서 넓은 범위의 샘플 포플러의 755 자연 변종의 반항에 대한 조사입니다. pyMBMS 의해 결정되는 이들 샘플을 들음는 리그닌 함량 syringyl / guaiacyl 비율에 대해 도시 하였다. 결과는 S / G가 상승, 들음은 약 2의 S / G 비, 반항의 노출 수까지 감소한다는 것을 나타냅니다ovement 수준 오프 (그림 2). 특이점 명확 Pt4CL1 유전자 포플러에서 하향 조절 된도 3에서 볼 수있다. 수백 품종을 선별하고, 감소 설탕 자료에 의해 입증 여러 명확하게, 반항으로 증가한다. 그림 4 여러 가지 밀 밀짚 품종은 성장 조건에 몇 가지 변화 후 2 년 수확을 통해 여러 명소에서 재배 된 한 연구를 묘사 상기 변수들의 조합에 기초하여 20 별개 집단의 결과. 이러한 샘플 세트는 용이하게 구별하고 들음위한 양 및 음의 변수를 나타낸다. pyMBMS가 세포벽 조성의 변화를 평가하는 방법을도 5를도. 질량 스펙트럼 조각은 다른 리그닌 단량체 (표 1)에 할당됩니다. 높은 탄수화물 함량 대 높은 리그닌으로 샘플을 비교할 때, 스펙트럼 데이터의 불균형은 명백하다. 티그는도 6에 도시되어 주성분 분석 (PCA)와 결합 pyMBMS 데이터로 사용한다.이 예에서, 샘플은 높거나 낮은 질소 시비에 따라 분류된다. 리그닌과 탄수화물 내용은 PC1를 따라 역으로 맞 춥니 다. 주성분 로딩 플롯의 사용은 화학 형질 형질 샘플 클러스터 사이 변화 점수 분류 플롯뿐만 아니라 아는데 설명되고있는 식별하는데 도움을 줄 수있다.
그림 1 : HPLC 9 대 높은 처리량 비색 분석법을 이용하여 포도당과 자일 로스 정량의 비교. 글루코스 및 자일 로스 검출의 비교 크 실리 톨 탈수소 효소 (XDH, 상단 패널) 글루코오스 옥시 다제 / 퍼 옥시 다제 (GOPOD, 하부 패널) 높은 처리량 측색 효소 - 결합 분석법 및 고성능 L을 사용하여 실시 하였다iquid 크로마토 그래피.
그림 2. 리그닌 분획 (S / G) 콘텐츠 guaiacyl하기 syringyl의 함수로서 포플러 세포벽 들음을 높이는 리그닌 9 (S / G) 콘텐츠 guaiacyl하기 syringyl의 함수로서 포플러 세포벽 들음 갖는다 관찰 및보고되었습니다. 같은 포플러 품종의 755 포플러 코어 샘플은 북미 태평양 북서부 숲의 수백 마일에 걸쳐 촬영 및 열 화학적 전처리 후 포도당과 자일 로스 릴리스에 대한 검사와 당화 효소했다. pyMBMS 의해 결정된 결과 세포벽 리그닌의 S / G 비율에 대해 도시 하였다. 들음 약 2, 더 높은 S / G로 일정하게 유지되는 때까지 S / G가 증가함에 따라 감소한다. 이론적 수율 값 BESC "표준"포플러에 기초한 것이며 referen로서 제공된다비교를 위해 CE.
그림 3 :. 반항 포플러에서 아래로 조절 Pt4CL1 식의 포플러의 Pt4CL1 유전자의 하향 조절은 그러나 몇 가지 크게 증가 반항의 변형이 쉽게 식별, 클론 사이의 세포벽 들음에서 작은 변화의 결과. 크게 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의 버전입니다.
그림 4 : 다양한 wheatstraw 인구 반항 명확하게 구별 반항 수준의 품종 종류, 재배 현장, 시비, 물을 비율 결과의 효과.. 다른 기호는 differe 대표실험 성장 조건을 NT. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5 :. 식물 세포 벽 (28)에 화학적 변화의 분석 pyMBMS 적용 화살표로 나타낸 피크는 리그닌 단편이며, (a) 높은 리그닌 (b) 매체 리그닌 또는 (c) 낮은 리그닌 함량을 평가하기 위해 사용되었다.
그림 6 :. 높고 낮은 수정률 (28)와 함께 성장하는 인구가 많은 나무의 세포벽 화학의 차이 주성분 분석 점수 플롯 (TOP) 주성분 분석점수는 별개의 분류를 나타내는 플롯, 따라서 인구가 나무의 세포벽 화학의 차이는 높고 낮은 수정률 함께 성장. 주성분 1 (네거티브) 높은 리그닌 이상의 탄수화물 (양)의 내용에 기초하여 상기 샘플들을 분할. (아래)를 주성분 적재량은 화학 성분이 점수 플롯 샘플의 두 클러스터들 사이에서 변경되는 명료. 긍정적 인 하중 부하는 음의 상관 관계가 있으므로 부정적인 점수와, 높은 리그닌 함량과 정렬하는 동안, 높은 탄수화물 함량의 대표적인 포지티브 점수와 상관 관계.
| M / Z | 분자 할당 30 | S / G는 / H 할당 |
| (94) | 페놀 | S / G / H |
| (120) | 비닐 페놀 | H |
| (124) | 아이 아콜 | G |
| 137 | Ethylguaiacol, homovanillin, coniferyl 알코올 | G |
| (138) | Methylguaiacol | G |
| (150) | Vinylguaiacol | G |
| (154) | Syringol | 에스 |
| (164) | 알릴 - + 프로 아이 아콜 | G |
| 167 | Ethylsyringol, syringylacetone, propiosyringone | 에스 |
| (168) | 4- 메틸 -2,6- 디메 톡시 | 에스 |
| 178 | Coniferyl 알데히드 | G |
| (180) | Coniferyl 알코올, syringylethene | S, G |
| (182) | Syringaldehyde | 에스 |
| (194) | 에스 | |
| (208) | Sinapylaldehyde | 에스 |
| (210) | Sinapylalcohol | 에스 |
표 1. pyMBMS에 의해 검출 된 전형적인 화합물의 질량 분석에 의해 검출되는 리그닌 유래 열분해 조각에 대한 피크 M / Z와 과제 목록. 에반스, RJ 및 TA 밀른 (1987)를 기반으로 분자 할당. . 123-137 : 바이오 매스 에너지와 연료 (1) (2)의 열분해의 분자 특성.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
다음 높은 처리량 스크리닝 실험을 실시 할 때 정확하고 재현성있는 데이터를 획득하기위한 키 샘플 준비 단계는 다음과 같다
설탕 자료 분석 :
일반적으로, 샘플은 수십에서 한 번에 수천에 이르기까지 많은 준비되어있다. 각 주요 단계는 전형적으로 샘플 제제 사이의 편차를 최소화하기 위해 전진에 앞서 모든 샘플에 대해 수행된다. 디 녹말 원래 프로토콜의 일부가 아닌이고 어떤 경우 생략 될 수있다. 목재 코어 샘플 및 senesced 초본 자료는 따라서 변동성을 줄이기 위해 해제 녹말 필요로하지 않는, 전분에서 지속적으로 낮은합니다. 전분은 중요한 관심사이다; 그러나, 특히 수확 몇 시간에 걸쳐 발생하는 큰 샘플 세트 녹색 조직 식물의 샘플 세트에. 전분 수준이 낮 시간 동안 상승과 어둠 중에 고갈됨에 따라, 전분 수준의 이상 크게 달라질 수 있습니다전분에서 everal 시간과 포도당은 셀룰로오스에서 포도당에서 구별 따라서, 높은 전분 수준이 왜곡되어 낮은 반항 측정 될 수 있습니다. destarching 단계에서 실제의 효소 로딩 한 전분 가수 분해 공정의 시간 프레임 내에서 액세스 가능한 모든 전분을 제거하기에 충분한 과량의 활성이 있으므로, 덜 관심사이다. 사용되는 특정 효소의 변화는, 시간, 온도, 전분 제거 공정의 부피, 교반 속도는 확실히 전분 제거 레벨 및 비율의 차이가 발생할 수 있으며, 가능하다면 경험적으로 결정되어야한다. 추출을위한 티 백을 포장 할 때 마지막으로, 주석 도금 구리 와이어를 사용합니다. 베어 구리 와이어 거짓 설탕 값을주는 효소 용액으로 원치 않는 화학 반응을 일으킬 수있다. 스테인레스 스틸 와이어는 밀폐 티 백을 유지하기에 충분 전성 아니었지만 주석 도금 구리는이 문제를 해결.
바이오 매스의 일관된 크기 감소는 ACCU 중요하다1) 미세보다 쉽고 지속적으로 분배하는 동안, 바이오 매스를 분쇄, 또한 거친 재료보다 소화하기 쉬운 : 두 가지 이유 때문에 속도 데이터. 2) 너무 굵고 불충분 재료 결과 호퍼를 막히게하거나, 막힘 일부만 개구부를 차단하는 경우는 시료의 관찰 들음 감소 통해 미립자 자체의 역할만을 허용 할 수 매스. 너무 적은 미생물이 디스펜서에 포함되어있는 경우에는 코트 수도 호퍼를 가정하는 로봇을 일으키는 호퍼의 측면은, 비어 있으며 시료 분배 과정에서 스킵 될 것이다. 또한, 낮은 수준의 바이오 매스 (예 껍질과 같은) 입자 밀도는 콘의 바닥 체하고 제 분배받을 경향 특히, 과장된 샘플 이질성에 기여할 수있다. 재료 미만 50mg을 사용할 수있는 경우, 분석은 여전히 수행 될 수있다; 그러나, 샘플은 손으로 무게해야합니다. 그러나, 손의 계량 결과에서 로브들보다 더 가변적귀의 무게.
준비 단계에 필요한 바이오 매스의 실제 금액은 잘 정의되어 있지 않습니다. 우리의 시작점 250 밀리그램을 제안하지만, 각각의 바이오 샘플 인해, 연마 처리, 및 압축뿐만 아니라 호퍼에 잡혀 재현성 또는 분배되는 손실에 대한 서로 다른 특성을 나타낸다. 전체 종류와 같은 종류의 바이오 매스 내 이질성 이상의 정의 된 프로토콜을 배제한다. 경험을보다 쉽게 수행하지만 이러한 분석 방법을 구현하고자하는 사람들은 단순히 자신에 대한 이러한 변수의 많은 결정해야합니다.
오류를 도입 할 수 있습니다 또 다른 단계는 악명 어렵고 여러 가지 이유로 이러한 분석에 중요한 마이크로 타이 터 플레이트에 혼합된다. 사용 된 효소 용액을 농축시키고, 바이오 매스 효소에 접근을 제한 웰에 첨가시 층화 될 수있다. 당화가 진행되면서 설탕 없ARS는 계층화 및 바이오 매스 근처에 집중 샘플링 깊이에 따라 설탕 분석 인위적으로 높거나 낮을 수 있습니다 발표했다. 이것은 중요한 일관성 당 분석을 허용하더라도 당화하고, 생성 된 당을 균일 분배를위한 매스와 효소의 완전한 혼합을 허용 효소 첨가 및 효소 당화 후 샘플을 혼합하는 이유이다. 이러한 희석 또는 분석 판과 같은 바이오 매스를 포함하지 않는 판에서 반복 피펫 팅 (분쇄)에 의해 혼합 흔들어보다 훨씬 우수한 것으로 입증되었습니다. 이 프로토콜 솔루션은 액체 열에서 변수 밀도와 입자 수준, 피펫 속도와 수직 팁 위치를하지만, 중요합니다. 속도가 팁에 의한 캐비테이션 (흡인)에 너무 빨리, 가난한 정확성과 액체 유지를하는 경우 발생할 수 있습니다 (분배). 팁이 아니라 너무 깊은 경우, 바이오 매스는 팁을 막히게되거나 팁 정확한 흡입을 방지 바닥 가압하고있을 수있다액체가 다음 단계로 및 이월 집착하는 더 많은 외부 표면 영역입니다. 팁 느린 제거가 액체의 표면 장력에 의한 벌크 용액으로 분리 할 수있는 바와 같이, 후자 문제는 다소 제어 선단 인출 속도가 완화 될 수있다. 팁 철수가 너무 느린 경우, 피펫, 액체뿐만 아니라 다시 벌크 용액에 크리프 수 있습니다. 바이오 매스 입자는 경향이 팁에 집착하고 분석중인 샘플 볼륨의 부정확성을 생성, 그들은 분석 판에 혼합 또는 전송 중에 팁을 방해 할 수있는 희석 플레이트로 전송되고있다. 이들이 판독 중에 광 빔을 흡장하면 이들 입자는 분석 플레이트의 분광 분석을 방해 할 수있다.
일관된 색상 개발시기는 GOPOD과 XDH 분석을 위해 중요하다. 색상 개발은 완료에 갈 수 있어야; 그러나 GOPOD 검정 색상 완성 및 XDH 분석법에 의해 생성 된 NADH 후 계속 상승하는 경향이 서서히때문에 NADH의 자연 산화를 감소시킨다. 그 결과, 변화 타이밍 분리 판 사이의 데이터 일관성 비교로 이어질 수있다. 하드웨어 또는 소프트웨어에 의한 문제가 중단 분석 시간에 큰 차이가 나타날 수 있음 분석 단계는, 신중하게 모니터링해야한다. 각각의 접시에 설탕 표준 및 표준 바이오 매스 제어 우물의 사용은 어느 정도이 문제를 완화 할 수 있습니다.
PyMBMS :
표준 신중 표준 습식 화학 방법에 대한 비교를 위해 pyMBMS 실험에 고려되어야한다. 바이오 매스 종의 상이한 리그닌 조성물 (S / G 비율)로, 상기 보정 계수는 시험 물질과 동일한 종의 대표적인 표준을 사용하여 결정되어야한다. 가용 한 적절한 기준이없는 경우, 리그닌 농도의 차이를 직접 리그닌 전구체 농도를 이용하여 비교 될 수있다. (이상 ~ 3.5) 높은 S / G 비율은 L의 과대 평가로 이어질 수pyMBMS로 ignin 내용. S 리그닌은 우선적으로이 방법에 사용되는 표준 조건 하에서 해제 될 때까지이는 경향에 의해 발생합니다. 또한 pyMBMS 측정을 위해 필요한 샘플의 사용량은 바이오 매스의 종류에 따라 달라진다. 고립 된 리그닌과 리그닌 모델 화합물은 검출기를 포화 수있는 샘플의 큰 분취 액을 사용하는 것으로, 적은 재료 (0.1 mg)을 필요로한다.
PyMBMS 과정에서 또 다른 중요한 단계는 각 실험 전에 이러한 루오 로트리 (PFTBA)로 알려진 표준 악기의주의 튜닝입니다. PFTBA은 전형적인 바이오 매스의 전체 스펙트럼에 걸쳐 분자 피크를 포함하고, 따라서 실험 실행 사이의 균일 한 악기 튜닝을 할 수 있습니다. 즉, m / z 131, m / z 219 대략 m / z (69)의 강도의 50 %가이 튜닝 소프트 이온화 아래 본 전형적인 피크를 강조하기 위해 사용되는 아르 (17 eV의)이 사용되도록 PFTBA 스펙트럼의 중간 영역은 동조 낮은 대중 것과 이온의 분열을 최소화하기 위해 C ANNOT 쉽게 식별 될 수있다.
이들 방법은 관심 분석 물질의 정확한 정량 분석 방법이 아니라는 것을 유의해야한다. 오히려, 이러한 높은 처리량의 바이오 매스 기술은 대형의 스크리닝은 원하는 화학적 특성을 갖는 것들을 식별하기 위해 설정된다. 이들 방법은 데이터 세트 내에서 선별, 순위, 및 샘플의 상관 관계를 사용한다. 이러한 쓸모 드리프트, 효소 활성의 변화, 바이오 매스 주변 수분 함량 등 변동의 원인으로 인해 다른 일에 수집 될 때의 데이터 세트를 직접 때문에 습도의 변화, 온도의 변동, 및 팁의 차이 흡수 판 로트를 비교할 수없는 . 또한, 샘플 준비 프로토콜에서 사용 전처리 전처리 최적화 전략이 아니라, 구체적으로는 차선 수 있도록 설계되었다. 이것은 식물 간의 미묘한 차이가보다 효율적으로 설명 될 수 있습니다.
jove_content는 "> 높은 처리량 방법을 채택하는 주요 이점은 더 많은 샘플을 동일한 시간주기 (18)에서 측정 될 수 있다는 것이다. 예를 들어, 산 또는 효소 적 당화 동안 생산 된 탄수화물을 분석하기위한 일반적인 방법은 고성능의 사용은 액체 크로마토 그래피 (HPLC). 셀릭 등., 구조 탄수화물의 정량에 매우 유용하고 가장 중요하지만 유비쿼터스 두 단계 산 가수 분해,. 주 9 당 약 25 샘플을 평가 할 수있는 연구자 제한 그 상태 분석하는 동안 높은 처리량 방법에 이용 계측 HPLC와 같은 표준 기법의 감도, 신속한 분석은 연구자에게 샘플 다량을 평가할 수 있다는 호화 수득 제공하지 않을 수있다. 또한, 높은 처리량 방법이 종종 실험 프로토콜을 다운 스케일링 한 소모품의 사용을 줄일 수 있으므로, 실험 비용 및 폐기물을 감소시킨다.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biomek FX Automated Workstation | Beckman Coulter | Biomek FX | Automated Liquid Handler |
| Wiley mill | Thomas Scientific | 3375E15 (Model 4), or 3383L20 (Mini-mill) | |
| anti-static bags | Minigrip* | MGST4P02503 | 2.5x3", multiple suppliers available |
| tin-coated copper wire | McMaster-Carr | 8871K84 | 0.016" diameter, bend-and-stay wire |
| tea-bags | Herbco | press n' brew teabags | 3.5x5 inches |
| gluco-amylase | Novozymes | Spirizyme Fuel | |
| alpha-amylase | Novozymes | Liquozyme SC DS | |
| sodium acetate trihydrate | any chemical supplier | reagent grade | |
| acetic acid | any chemical supplier | reagent grade | |
| 190 proof (95%) ethanol | any chemical supplier | reagent grade | |
| hoppers | Freeslate | ||
| 96-well C-276 Hastelloy plates | Aspen Machining (Lafayette, Colorado) | N/A (custom built) | |
| 1/8” soldering iron tip | Sears | ||
| silicone-adhesive backed Teflon tape | 3M | 5180 | 3" wide (36-yard rolls) |
| enzyme solution | Novozymes | Cellic CTec2 | |
| citric acid monohydrate | any chemical supplier | ||
| trisodium citrate dihydrate | any chemical supplier | ||
| disposable, polystyrene 96-well plates | Greiner Bio-One | 655101 | or equivalent; multiple suppliers available |
| glucose oxidase/peroxidase | Megazyme | K-Gluc | Megazyme D-glucose assay kit |
| xylose dehydrogenase | Megazyme | K-Xylose | Megazyme D-xylose assay kit |
| glucose standard solution | Megazyme | K-Gluc | Megazyme D-glucose assay kit |
| xylose standard solution | Megazyme | K-Xylose | Megazyme D-xylose assay kit |
| stainless steel sample cups | Frontier Laboratories | PY1-EC80F | |
| glass fiber sheets | Pall | 66227 | 8x10" sheets; circles punched with standard hole punch |
| Sugarcane Bagasse Whole Biomass Feedstock | NIST | 8491 | |
| Eastern Cottonwood (poplar) Whole Biomass Feedstock | NIST | 8492 | |
| Monterey Pine Whole Biomass Feedstock | NIST | 8493 | |
| Wheat Straw Whole Biomass Feedstock | NIST | 8494 |
References
- U.S. Billion-Ton Update: Biomass Supply for a Bioenergy and Bioproducts Industry. Perlack, R. D., Stokes, B. J. , Oak Ridge National Laboratory. Oak Ridge, TN. (2011).
- Henry, R.
- Henry, R. J. Evaluation of plant biomass resources available for replacement of fossil oil. Plant Biotechnol. J. 8 (3), 288-293 (2010).
- Furtado, A., et al. Modifying plants for biofuel and biomaterial production. Plant Biotechnol. J. 12 (9), 1246-1258 (2014).
- Sluiter, J. B., Ruiz, R. O., Scarlata, C. J., Sluiter, A. D., Templeton, D. W. Compositional analysis of lignocellulosic feedstocks. 1. Review and description of methods. J. Agric. Food Chem. 58 (16), 9043-9053 (2010).
- Lupoi, J. S., Singh, S., Simmons, B. A., Henry, R. J. Assessment of Lignocellulosic Biomass Using Analytical Spectroscopy: an Evolution to High-Throughput Techniques. Bioenerg. Res. 7 (1), 1-23 (2014).
- Lapierre, C., Monties, B., Rolando, C. Thioacidolysis of lignin: comparison with acidolysis. J. Wood Chem. Technol. 5 (2), 277-292 (1985).
- DeMartini, J. D., Studer, M. H., Wyman, C. E. Small-scale and automatable high-throughput compositional analysis of biomass. Biotechnol. Bioeng. 108 (2), 306-312 (2010).
- Selig, M. J., et al. High throughput determination of glucan and xylan fractions in lignocelluloses. Biotechnol. Lett. 33 (5), 961-967 (2011).
- Selig, M. J., et al. Lignocellulose recalcitrance screening by integrated high-throughput hydrothermal pretreatment and enzymatic saccharification. Ind. Biotechnol. 6 (2), 104-111 (2010).
- Studer, M. H., De Martini, J. D., Brethauer, S., McKenzie, H. L., Wyman, C. E. Engineering of a high-throughput screening system to identify cellulosic biomass, pretreatments, and enzyme formulations that enhance sugar release. Biotechnol. Bioeng. 105 (2), 231-238 (2009).
- Gjersing, E., Happs, R. M., Sykes, R. W., Doeppke, C., Davis, M. F. Rapid determination of sugar content in biomass hydrolysates using nuclear magnetic resonance spectroscopy. Biotechnol. Bioeng. 110 (3), 721-728 (2013).
- Templeton, D. W., Sluiter, A. D., Hayward, T. K., Hames, B. R., Thomas, S. R. Assessing corn stover composition and sources of variability via NIRS. Cellulose (Dordrecht, Netherlands). 16 (4), 621-639 (2009).
- Tucker, M. P., et al. Fourier transform infrared quantification of sugars in pretreated biomass liquors. Appl. Biochem. Biotechnol. 84-86, 39-50 (2000).
- Wolfrum, E. J., Sluiter, A. D. Improved multivariate calibration models for corn stover feedstock and dilute-acid pretreated corn stover. Cellulose (Dordrecht, Netherlands). 16 (4), 567-576 (2009).
- Ona, T., et al. Non-destructive determination of wood constituents by Fourier-transform Raman spectroscopy. J. Wood Chem. Technol. 17 (4), 399-417 (1997).
- Ona, T., Sonoda, T., Ohshima, J., Yokota, S., Yoshizawa, N. A rapid quantitative method to assess eucalyptus wood properties for kraft pulp production by FT-Raman spectroscopy. J. Pulp Pap. Sci. 29 (1), 6-10 (2003).
- Hames, B. R., Thomas, S. R., Sluiter, A. D., Roth, C. J., Templeton, D. W. Rapid biomass analysis. New tools for compositional analysis of corn stover feedstocks and process intermediates from ethanol production. Appl. Biochem. Biotechnol. 105-108, 5-16 (2003).
- Studer, M. H., et al. Lignin content in natural Populus variants affects sugar release. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (15), 6300-6305 (2011).
- Chen, M., Zhao, J., Xia, L. Comparison of four different chemical pretreatments of corn stover for enhancing enzymatic digestibility. Biomass Bioenergy. 33 (10), 1381-1385 (2009).
- Davison, B. H., Drescher, S. R., Tuskan, G. A., Davis, M. F., Nghiem, N. P. Variation of S/G ratio and lignin content in a Populus. family influences the release of xylose by dilute acid hydrolysis. Appl. Biochem. Biotechnol. 129-132, 427-435 (2006).
- Li, X., et al. Lignin monomer composition affects Arabidopsis cell-wall degradability after liquid hot water pretreatment. Biotechnol. Biofuels. 3, 27-33 (2010).
- Lupoi, J. S., et al. High-throughput prediction of eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using multivariate analysis: a comparison between mid-infrared, near-infrared, and Raman spectroscopies for model development. Biotechnol. Biofuels. 7, 93 (2014).
- Lupoi, J. S., Smith, E. A. Characterization of woody and herbaceous biomasses lignin composition with 1064 nm dispersive multichannel Raman spectroscopy. Appl. Spectro. 66 (8), 903-910 (2012).
- Sun, L., et al. Rapid determination of syringyl:guaiacyl ratios using FT-Raman spectroscopy. Biotechnol. Bioeng. 109 (3), 647-656 (2012).
- Lupoi, J. S., et al. High-throughput prediction of Acacia and eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using FT-Raman spectroscopy and partial least squares modeling. Bioenerg. Res. in press, (2015).
- Sykes, R., Kodrzycki, B., Tuskan, G., Foutz, K., Davis, M.
- Sykes, R., et al. Ch. 12. High-Throughput Screening of Plant Cell-Wall Composition Using Pyrolysis Molecular Beam Mass Spectroscopy. Biofuels: Methods and Protocols. Mielenz, J. R. 581, 169-183 (2009).
- Decker, S., et al. Ch. 17. Reducing the effect of variable starch levels in biomass recalcitrance screening). Biomass Conversion. Himmel, M. E. 908, Humana Press. 181-195 (2012).
- Evans, R. J., Milne, T. A.
