Introduction
Som det globale udbud af ikke-vedvarende brændstoffer og deres tilhørende produkter falder, har forskerne blevet udfordret til at skabe lignende brændstoffer og kemikalier fra plante-afledte kilder 1. Et centralt aspekt af dette arbejde er at bestemme hvilke arter af planter kan være egnet til produktion af biobrændstoffer og biomaterialer 2,3. Typisk er disse råmaterialer evalueret for lignin, cellulose, hemicellulose og indhold; samt deres tilbøjelighed til dekonstruktion (Modstridigheden) ved termisk, mekanisk og / eller kemisk forbehandling med eller uden efterfølgende enzym forsukring. Mere detaljerede analyser anvendes til at bestemme den specifikke sammensætning af lignin og hemicellulose fraktioner samt optimale enzymaktiviteter behov. Transgene modifikationer af planter, der ikke i sig selv besidder ideelle træk for biokemisk eller termokemisk omdannelse til ønskede råvarer har givet forskere med en stærkt udvidet kilde til potrentielle råmaterialer 4. Faste analysemetoder til kvantificering af kemiske træk af en plante, mens ganske nyttigt for små prøvesæt, er uegnede til hurtig screening af hundreder eller tusinder af prøver 5-7. Der er blevet udviklet HTP heri beskrevne fremgangsmåder til hurtigt og effektivt at vurdere et stort antal af biomasse varianter for ændringer i cellevæggen Modstridigheden til termokemisk og / eller enzymatisk nedbrydning.
Det er afgørende at forstå, at HTP screeningsassays beskrevet heri er ikke designet til at maksimere konvertering eller udbytte. Formålet er at bestemme relative forskelle i den intrinsiske Modstridigheden relaterede biomasse prøver. Som et resultat, mange af analyse trin adskiller sig fra de "typiske" biomasse konvertering assays, hvor målet er at opnå maksimal omregningskurs eller omfang. For eksempel er lavere forbehandlingsanlæg sværhedsgrader og kortere enzymhydrolyse gange bruges til at maksimere afvigerner på mellem prøverne. I de fleste tilfælde er relativt høje enzymbelastninger anvendes til at reducere forskelle på grund af eksperimentelle variation i enzymaktivitet, som kunne forvrænge resultaterne betydeligt.
Hurtige teknikker til bestemmelse af sammensætningen af plante celle-vægge og de monomere sukkerarter befriet efter enzymatisk forsukring omfatter robotteknologi, tilpassede, termokemisk kompatible 96 brønde, og ændringer af standard laboratoriemetoder 8-11 og instrumentale protokoller, såsom vibrations spektroskopi (infrarød (IR), nær-infrarødt (NIR), eller Raman) og nuklear magnetisk resonans (NMR) 12-17. Disse metoder er nøglen til at isolere råmaterialer med høj cellulose eller lavt indhold lignin, eller dem forventes at give den højeste glukose, xylose, ethanol, etc. Disse metoder har aktiveret nedskaleret analyser, der beskæftiger mindre mængder af biomasse og hjælpematerialer, hvilket fører til reduktioner i eksperimentel udgift 18 9, poppel 8,10, sukkerrør bagasse 8 og staudehirse 8 er blevet evalueret med succes ved hjælp af disse metoder HTP.
Total lignin og lignin monomersammensætning er også almindeligt kvantificeret biomasse træk. Reduktioner i lignin-indhold har vist sig at øge den enzymatiske fordøjelighed af polysaccharider 19,20. Den rolle, som lignin monomere ratio (ofte rapporteret som syringyl / guaiacyl (S / G) indhold) spiller i dekonstruktion af planten cellevæggen er stadig under efterforskning. Nogle rapporter har indikeret, at reduktioner i S / GForholdet ført til øget glucose udbytter efter hydrolyse 21, mens andre undersøgelser afsløre den modsatte tendens 19,22. High throughput metoder til evaluering lignin og dets monomerer indbefatter vibrationelle spektroskopi (IR, NIR og Raman 23-26) kombineret med multivariat analyse, og pyrolyse molekylær stråle massespektrometri (pyMBMS) 27,28.
Ved udviklingen HTP metoder til screening af biomasse, har brug for flere integrerede overvejelser skal holdes for øje. Et centralt aspekt er kompleksiteten af metoden. Hvad er det krævede kvalifikationsniveau for teknik? Kemometriske analyser, for eksempel, kræver særlige færdigheder til at konstruere, evaluering, og opretholdelse af prædiktive modeller. De standardmetoder udviser uønskede skridt forberedende eller dataanalyse eller ansætte giftige reagenser. Udvikling af modellerne er en løbende proces, hvor nye data er indarbejdet i modellen over tid at øge modellens robusthed. En anden considbejde er de besparelser og nedsat eksperimentelle analyse tidspunkter af de foreslåede high-throughput metoder. Hvis metoden er ganske hurtig, men meget dyrt, kan det ikke være en gennemførlig teknik til mange laboratorier til at vedtage. Metoderne illustreret i dette manuskript er varianter af standardiserede teknikker, modificeret til at forstærke throughput kapaciteter. Disse protokoller kvantitativt måle biomasse træk af interesse uden nødvendiggør udviklingen af prognosemodeller. Dette er et centralt egenskab ved disse teknikker, da prædiktive metoder, mens udstiller stærke korrelationer med den standard analyser bruges til at udvikle modeller, er ikke så nøjagtige som faktisk måle mængden af interesse for prøverne. Hvorimod de anvendte metoder er i det væsentlige skaleret ned versioner af standard analysemetoder bench-skala, handles nøjagtighed og præcision for hastighed og gennemløb. For det meste dette resultat skyldes højere fejl i lille volumen pipettering og vejer; samt øget srigelig heterogenitet som prøve størrelse reduceres. Mens store prøvesæt kan screenes og sammenlignes, skal stor forsigtighed udvises, når de foretager sammenligninger mellem separate kampagner og til bench-skala resultater.
De mest tidskrævende trin involverer den fysiske manipulation af biomassen. Slibning prøver kan tage flere minutter per prøve, herunder rengøring ud møllen mellem prøver. Manuel lastning, losning, og rengøring tragte og fylde og tømme te poser og sække til prøveudtagning er også meget arbejdskrævende. Mens hvert trin kan tage et minut eller mere, kan gøre tusindvis af prøver tage mange timer eller endda dage. Robotterne kan indlæse en typisk reaktor plade med biomasse i omkring 3 til 4 timer eller 6 til 8 plader dag -1 robot -1. Denne situation afhænger af de parametre, der anvendes præcision samt typen og mængden af biomasse, der skal testes. Påfyldning reaktor plader med vand, fortyndet syre eller enzym hurtigt gøres ved hjælp af en væskehåndtering robot. Pgenbehandling af en plade stack (1 til 20 reaktorer plader) tager mellem 1 og 3 timer, når montering, køle ned, og adskillelse er inkluderet. Enzymhydrolyse tager 3 dage og analysen sukker kræver ca 1 time af prep tid plus 10 min pr reaktor plade til at færdiggøre analysen og læse resultaterne. En ugentlig tidsplan for fastsatte forbehandling og analyse dage rummer en rimelig arbejde tidsplan, minimerer ulige-timers og weekend indsats for den menneskelige del af analysen og giver mulighed for behandling ~ 800 til 1.000 prøver pr uge løbende. Den maksimale kapacitet afhænger af flere faktorer, herunder især hvor meget hardware (robotter, reaktorer plader, etc.), og hvor meget "software" (dvs. bemanding) til at foretage det manuelle arbejde. Den praktiske øvre grænse er 2.500 til 3.000 prøver / uge; imidlertid, at produktionen kræver syv dage om ugen drift og flere studentermedhjælpere og teknikere. Til sammenligning ville 3.000 prøver ved HPLC kræver ca. 125 dage Sample analyse plus ekstra arbejdskraft af manuelt vejer prøver i reaktorer og filtrering prøver inden analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Højkapacitetsforskning bestemmelse af glucose og xylose Udbytter Efter Enzymatisk Enzymatisk 9,29
- Prøveforberedelse (Slibning, De-stivning, Ekstraktion, Forbehandling)
- Grind mindst 300 mg af hver prøve ved anvendelse af biomasse en Wiley-mølle, således at partiklerne passerer gennem en 20 mesh (850 um) sigte. Overførsel til anti-statiske zip-top poser (typisk bar-kodet) og optage prøve information til stregkode-databasen.
- Tilføj ca. 250 mg eller mere af jorden biomasse fra anti-statiske pose til en nummereret (med blyant, skal du ikke bruge blæk eller markør) te-taske, forsigtigt rulle op teposer, og sørg for at folde enderne over biomassen for at forhindre tab under de-stivning og udvinding.
- Pak tepose lukkes med tin-belagt kobbertråd. Optag tepose nummer for hver barkode prøve.
- Forbered de-stivning enzymopløsning fra kommercielle enzymer (typisk 0,25% (v / v) glucoamylase (~ 1.600 AGU / L) og1,5% (v / v) a-amylase (~ 2.900 KNU-S / L) i 0,1 M natriumacetat (pH 5,0)). Forbered 16 ml pr g af bulk biomasse eller 500 ml pr 120 tepose prøver. Note: Belastninger kan fjerne stivelse fra jorden biomasse bør bestemmes empirisk ved at teste for stivelse efter fordøjelse med en række enzymbelastninger og forhold.
- I en plastikbeholder, tilsæt 16 ml de-stivning enzymopløsning per 1 g af bulk jorden biomasse. For en batch de-stivning protokollen, tilsættes 120 teposer til 500 ml af bufferen-enzymopløsningen.
- Inkuber i et rysteapparat ved 55 ° C i 24 (± 4) timer, ved 120 rpm for at fjerne mulig stivelse.
- Efter de-stivning inkubation skylles og proppen biomassen i flere liter deioniseret vand i 30 minutter. Gentag denne proces yderligere to gange for at fjerne buffersalte, der kan forårsage støde (dannelse af gasbobler i den løsning, som kan resultere i en pludselig og voldsom stigning i niveauet af opløsningen, der forårsager varm væske ethanol til kaskadeud af reaktionsbeholderen) under ekstraktionen.
- Efter udtømmende skylning af de stivede biomasse, placere teposer i Soxhlet kolonnen for ekstraktion. Ingen fingerbøl er nødvendig for dette trin.
- Opsæt Soxhlet reflux, hjælp 95% ethanol og udtrække prøverne i 24 timer.
- Fjern teposer fra Soxhlet reaktoren og spredt ud i et enkelt lag på en flad bakke.
- Tillad prøverne tørre natten over ved stuetemperatur i et stinkskab.
- Rul teposer og returnere den tørrede biomasse til originale stregkodede anti-statiske poser.
Bemærk: De antistatiske poser er effektive til at reducere statisk elektricitet i biomassen, forbedre køreegenskaber. Hvis der anvendes andre lagringsmuligheder, kan yderligere biomasse være nødvendig på grund af den biomasse klamrer sig til siden af opbevaringsbeholderen. - Overfør mindst 50 mg af den tørrede biomasse til en stregkode tragt (ved hjælp af mere materiale er bedre for præcis dosering). Skan stregkoder af anti-statiske poser og det modtagende tragt for at sikre nøjagtig prøve sporing.
- Load tragte onto faste stoffer vejer robot, meget opmærksomme på rækkefølgen af prøverne i stativerne. Load nok reaktor plader til at indeholde alle prøverne og vælg udleveringen protokol baseret på antallet af plader, der anvendes.
- Robot vejer 5 mg af de tørrede prøver (± 0,3 mg) i syre-resistent rustfrit stål 96-brønds plader. Afvej 3 replikater af hver prøve fordelt omkring pladen for at minimere eventuelle lokaliserede variationer.
- Omfatter 8 kontrol biomasse prøver af en velkarakteriseret biomasse standard materiale med henblik på at spore assay ydeevne. For flere plader, vil brugen af flere standard biomasse tragte minimere partikelstørrelse drift forårsaget ved sigtning i tragtene i gentagne dispensering cyklusser.
Bemærk: I hver plade, bør der være 24 prøver med 3 replikater, 4 blanke bestående af deioniseret vand og enzym, og 8 controls, anvendelse af den tidligere standard kendetegnet biomasse. De 3 hjørne brønde af hver af de 4 hjørner af pladen er forbeholdt sukker standarder. - Tjek tomme og sukker standard brønde for vildfarne biomassepartiklerne og fjern hvis tilstede.
- Tilsæt 250 pi deioniseret vand til hver brønd, og pladerne forsegles med silikone selvklæbende polytetrafluorethylen (PTFE) bånd.
- Ved hjælp af en 1/8 "loddekolbe spids, gennembore PTFE-tape på hver damp-port (117 i alt) for hver plade. Brug en tom plade stablet på forseglede reaktor plade som en guide og begrænse PTFE film bevægelse.
- Spænd pladerne tæt med "tykke PTFE pakninger 0,031 glas-forstærket (udstansede med huller til damp-porte) mellem plader og tomme plader på toppen og bunden af stakken. Forbehandle prøverne ved hjælp af en dampreaktor indstillet til 180 ° C i 17,5 min, eller andre kombinationer temperatur / tid baseret på ønsket sværhedsgrad.
- Cool reaktor plader til 50 °; C ved oversvømmelser med deioniseret vand.
- Enzymatisk Enzymatisk
- Forbered en enzymatisk forsukring opløsning bestående af 8% (v / v) enzymopløsning i 1,0 M natriumcitrat, pH 5,0. Forbered 5 ml pr reaktor plade. Bemærk: Fortynding nødvendig bør bestemmes på grundlag af aktivitet og proteinindholdet i den specifikke bestand enzym løsning.
- Når pladerne er cool, centrifugeres dem i en svingende spand rotor ved 1.500 xg i 20 minutter. Fjern forseglingsfilm. Bemærk: Disse plader er tunge og centrifuge specifikationer bør kontrolleres for kompatibilitet.
- Tilsæt 40 ul af 8% enzym stamopløsning til hver brønd (70 mg enzym pr g biomasse).
- Tillukkes med nye PTFE-tape. Placer forseglet plade i magnetisk plade klemme.
- Bland forsigtigt prøverne ved inversion (mindst 15 gange), og inkuberes ved 50 ° C i 70 timer.
- Når forsukring har konkluderet, bland ved at vende, og centrifugere pladerne ved 1.500 xg i 20 minutter.
- Sukker Assay
- Udarbejder et sæt 6 glucose og xylose kombineret kalibreringsstandarder i 0,014 M citratpuffer (pH 5,0) området fra 0 til 0.750 mg / ml (0, 0,2, 0,3, 0,45, 0,65 og 0,75 mg / ml anbefales) og fra 0 til 0.600 mg / ml (0, 0,1, 0,2, 0,35, 0,45 og 0,6 mg / ml anbefales) for glucose og xylose, henholdsvis.
- Forbered glucoseoxidasen / peroxidase (GOPOD) og xylose (XDH) reagenser i henhold til vejledningen i sættet.
- Ved hjælp af en pipette til at fjerne 200 pi væske fra de 4 hjørne brønde og kant brønde støder op til hjørne brønde (12 af total brønde) i reaktoren pladen.
- Ved hjælp af en pipette, dispensere 180 ul deioniseret vand til hver brønd på en 96-brønds polystyren fladbundede fortynding plade. Tilsæt ikke vand til 12 sukker standard og hjørne brønde (fjerne disse tip, hvis du bruger et 96-kanals hoved).
- Ved hjælp af en pipette, dispensere 180 pi GOPOD reagens til hver brønd af glukose analysen plspiste.
- Ved hjælp af en pipette, dispensere 180 pi XDH reagens til hver brønd af xylose assaypladen.
- Ved hjælp af en pipette 20 pi hydrolysat alikvoter fra 96 brønde reaktor pladen til fortynding pladen. Pipetter fra den øverste del af brøndene for at undgå biomassefaststoffer og restvæske i hjørne brønde. Bland ved triturering i mindst 10 cykler.
- Ved hjælp af en pipette 110 pi af sukker standarder, i to eksemplarer til hjørne brønde i fortynding pladen.
- Ved hjælp af en pipette 20 portioner pi fra fortyndingen pladen til glucose og xylose assayplader. Bland ved findeling.
- Inkubér glucose og xylose assayplader ved stuetemperatur i 30 minutter. Bryde omhyggeligt enhver overflade bobler, før du læser. Kort passeret over overfladen af pladen en varmepistol fungerer godt.
- Ved anvendelse af en ultraviolet / synligt 96-brønds plade-læser, indstille den målte bølgelængde til 510 nm og registrere absorbansen mod en reagensblank.Denne måling overvåger dannelsen af quinonimine, der er proportional med glukosekoncentrationen. Glucosekoncentrationen beregnes ud fra kalibreringskurven på grundlag kalibreringsstandarderne udarbejdet i 1.3.1.
- Ved anvendelse af en ultraviolet / synligt 96-brønds plade-læser, indstille den målte bølgelængde til 340 nm og registrere absorbansen. Denne måling overvåger reduktion af NAD + til NADH, som er proportional med koncentrationen xylose. Koncentrationen af xylose beregnes ud fra kalibreringskurven på grundlag kalibreringsstandarderne udarbejdet i 1.3.1.
2. Højkapacitetsforskning Bestemmelse af alt lignin og Lignin Monomert indhold ved hjælp pyMBMS 28
- Prøveforberedelse
- Grind og udtrække biomassen hjælp af de metoder, der er beskrevet i trin 1.1.1 og 1.1.6-1.1.8. Dette omfatter formaling og ekstraktion af et sæt standarder til brug som eksperimentelle kontroller.
Bemærk: Den pyMBMS measurements ikke partikelstørrelse afhængig, så hvis kun ved hjælp af pyMBMS protokollen, bør præparatet biomasse udføres for at gøre det muligt for prøven at passe i prøveholderen, <4 mm. - Ved hjælp af en lille spatel dispensering ca. 4 mg (3 til 5 mg foretrækkes), i den fremstillede biomasse i en 80 pi rustfrit stål cup designet til autosampler.
- Sikre, at mindst 10% af prøverne bliver analyseret er kontrolstandarder såsom dem tilgængelige fra National Institute of Standards and Technology (sukkerrørsbagasse-8491, poppel-8492, fyr-8493 eller hvedehalm-8494). Standarden kan også være enhver art analoge med de, der skal analyseres prøver, der allerede er karakteriseret ved anvendelse af standardmetoder.
- Tilfældigt indlæse prøverne ind i auto-sampler kopper ved hjælp af en pincet til at undgå bias på grund af mulig spektrometer afdrift over tid. Bemærk: En typisk randomisering af prøverne ville omfatte målingen af alle prøver en gang, efterfulgt af en re-randomiseringaf rækkefølgen af prøver til en dublet måling. Randomisering programmer er tilgængelige online.
- Ved hjælp af en standard hulning, manuelt producere glas filter diske fra type A / D-glas fiber ark, uden bindemiddel. Hold runde fiber filter glas med en pincet, centrere det over prøven kop, og skub ind i prøven ved hjælp af en 3,5 mm unbrakonøgle til at begrænse materialet i hver kop under eksperimentet.
- Grind og udtrække biomassen hjælp af de metoder, der er beskrevet i trin 1.1.1 og 1.1.6-1.1.8. Dette omfatter formaling og ekstraktion af et sæt standarder til brug som eksperimentelle kontroller.
- Instrumental Protokol
- Kalibrere massespektrometer under anvendelse af en kendt standard, der har topintensiteter over hele området af forbindelser, der kan være for de eksperimentelle prøver. For typiske biomasse prøver, brug perfluortributylamin (PFTBA).
- Indstil helium bæregasflowet til 0,9 l / min ved hjælp af en gas flowmeter.
- Indstil autosampler ovnen til en pyrolyse temperatur på 500 ° C og grænsefladen temperaturen til 350 ° C ved hjælp af autosampler software. Bemærk: En 1/8 "rustfrit stål opvarmesoverføringsledning indpakket i varme bånd, der forbinder autosampler til massespektrometeret styres ved hjælp af en varme controller ved 250 ° C.
- Begynd datafangst på massespektrometer og vente mindst 60 sekunder for at opnå tilstrækkelige data til baggrunden spektre kollektion.
- Start den automatiske auto-sampler metoden med specifikationerne fra 2.2.2. Bemærk: autosampler dråber hver prøve individuelt i autosampler ovnen. Den samlede dataopsamling er cirka 1,5 min; dog pyrolyse af et typisk 4 mg prøve er fuldstændig efter 30 sek.
- Optag total ion-indhold (TIC) i hver prøve ved anvendelse massespektrometer software 0.5 sek scanningshastighed. Optag intensiteter mellem m / z 30-450.
Bemærk: Typiske biomasse forbindelser bruger bløde ionisering ved 17 eV. Instrumentet kan optage større intervaller fra m / z 1 til 1000; dog vil scanningshastighed være begrænset af computeren CPU kraft. - Fjern baggrund fra spektrene ved hjælp af maNual forbedre funktionen i softwaren. Bemærk: En 60 scanning del af baseline i begyndelsen af dataindsamlingen anvendes til at beregne en gennemsnitlig baggrund værdi. Denne gennemsnitlige baggrund spektre fjernes fra den eksperimentelle prøvespektre automatisk i massespektrometeret software.
- Importer enkelt kolonne tekstfil skabt af massespektrometer-softwaren indeholder de spektrale data for hver prøve, i en database program og kombinere alle prøverne i en database. Tilføj enhver gældende metadata til regnearket. Importer de formaterede data (regneark / CSV-fil) til en statistisk programpakke og betyder normalisere spektre at tage højde for variation i pyrolyseret prøve masserne.
- Brug en statistisk programpakke til at udføre en principal komponent analyse (PCA) ved hjælp af de spektrale data til at analysere gruppering af de replikerede standardprøver anvendes i målingerne, samt at vurdere, hvilke toppe er en integreret del af klassificering af kemiskforbindelser i indlæsningsplot 28.
Bemærk: PCA grupperer prøver baseret på ligheden mellem deres spektre, og tillader en kontrol af de standarder, til at måle eksperimentelle fejl på grund af instrumentets drift under kørslen. - At beregne lignin syringyl (S) / guaiacyl (G) forhold, opsummere områderne S toppe (m / z = 154, 167, 168, 182, 194, 208 og 210) og dividere med summen af G toppe ved 124, 137, 138, 150, 164, og 178.
- For at beregne det samlede ligninindhold, opsummere lignin toppe med m / z = 120, 124, 137, 138, 150, 152, 154, 164, 167, 178, 180, 182, 194 og 210.
- Beregne en korrektionsfaktor til skalering af pyMBMS målingen til en standardmetode til vurdering af den samlede lignin, såsom Klason lignin. Opdel Klason lignin værdien af den enkelte standard med det samlede ligninindhold målt for denne standard prøve ved hjælp pyMBMS.
- Anvend denne korrektionsfaktor til alle lignende arter i datasættet. Gentag for hver type biomasse analyseres. Note: Korrektionsfaktoren kan variere betydeligt baseret på S / G af biomassen analyseret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den kombinerede virkning af termokemiske forbehandling og efterfølgende enzym forsukring måles som en funktion af massen af glucose og xylose der frigives ved afslutningen af assayet. Resultaterne er rapporteret i form af milligram glucose og xylose der frigives per gram biomasse. Dette er i skarp kontrast til data rapporteret fra bench-skala assays, der normalt rapporteres som procent teoretiske udbytte baseret på analyse af sammensætningen af udgangsmaterialet. Da det endnu ikke er praktisk at udføre analyse af sammensætningen på tusindvis af prøver pr uge, er data rapporteret som bedste konvertering niveauer på en massebasis. Dette giver mulighed for en rimelig prøve evaluering, så længe sammenligningerne er foretaget mellem nært beslægtede prøver af biomasse og sammensætningen af prøverne ikke varierer for meget.
Det primære mål med analysen er at vurdere de relative forskelle i modstanden af anlægget cellevæggen til kombineret termokemisk / enzymatic forsukring tværs af en række individuelle varianter. Det er værd at bemærke, at analysen ikke forsøger at optimere en af de betingelser, der anvendes til forsukring. Faktisk forbehandling sværhedsgraden betingelser er betydeligt suboptimale med henblik på at udvide følsomhedsområde for assayet rettet mod en endelige omdannelse udbytte på 50% til 70% af det teoretiske. Forbehandlingsbetingelser på eller nær optimale ville skubbe alle prøver til høj omdannelse, i høj grad begrænse det dynamiske område for analysen. Omvendt enzymet loading er meget større end den, der typisk rapporteret for bench-skala fordøjelser. Igen, målet med metoden er ikke at finde den bedste enzym eller minimere enzymet omkostninger, men at måle den iboende Modstridigheden cellevæggene til konvertering og anvendelse af meget høje enzymbelastninger fjerner variabilitet fra analysen.
Endelig er det vigtigt at forstå, at variation i den samlede analyse er betydeligt højere end den, der er rapporteret for bench-skala arbejde. Typiske standard fejl er omkring 8%, selvom området er meget bredere. Det er simpelthen karakter af mindre målestok, HTP forskning. Pipettering og vejer fejl er forholdsmæssigt højere på pi og mg skala, som er fordampning og kondens tab. Biomasse heterogenitet bliver en meget stor variabel, når analyse flere størrelsesordener færre partikler i hver prøve, dvs 5 mg vs. multipel g. De kolorimetriske assays anvendes til at bestemme glucose og xylose korrelerer godt med HPLC-resultater; Men mens enzymbundne assays for sukker analyse er hurtige og kan udføres parallelt, er de ikke så præcis som analysemetoder såsom HPLC, indfører endnu et lag af unøjagtighed (figur 1).
På grund af til alle de ovenstående bør resultater kun fortolkes og rapporteres inden for visse begrænsninger. Dataene bør undersøges i hele sæt, ikke som individuelle prøver. Der kræves gentagelser for meaudføre et meningsfuldt resultat. Tendenser og outliers er meningsfulde, men enkelte resultater er ikke. Sammenligninger er bedst foretaget inden enkelte eksperimentelle sæt. Sammenligninger på tværs af tidsmæssigt eller rumligt adskilte kampagner kræver ekstremt stram kontrol og omhyggelig kontrol kan finde meningsfuld. HTP data er ikke direkte sammenlignelige, at sammen- ligne eller anden skala data. Trends spor mellem HTP og andre skalaer, men sammenligninger direkte prøve giver ikke identiske resultater.
Datarepræsentation typisk falder i tendenser, outliers, eller sub-population / variant sammenligninger. Et eksempel på tendenserne er en oversigt over vrangvillighed af 755 naturlige varianter af poppel stikprøven over et stort område i Pacific Northwest i USA 19. Den vrangvillighed af disse prøver blev plottet mod deres lignin indhold og syringyl / guaiacyl forhold bestemt efter pyMBMS. Resultaterne antyder, at S / G stiger, Modstridigheden aftager, indtil et S / G-forhold på omkring 2, hvor Modstridigheden Improvement flader ud (figur 2). Outliers kan tydeligt ses i figur 3, hvor Pt4CL1 genet blev nedreguleret i poppel. Flere hundrede kultivarer blev screenet, og flere er klart forøget i Modstridigheden, som det fremgår af den reducerede sukker frigivelse. Figur 4 viser en undersøgelse, hvor flere forskellige hvede-halm sorter blev dyrket på flere seværdigheder over to år og høst efter flere variationer i vækstbetingelserne , hvilket resulterer i 20 forskellige populationer baseret på kombinationer af de ovenfor nævnte parametre. Disse prøvesæt er let skelnes og angiver positive og negative variabler for Modstridigheden. Figur 5 viser, hvordan pyMBMS kan anvendes til at vurdere ændringer i cellevæggen sammensætning. Massespektrale fragmenter er tildelt forskellige lignin-monomerer (tabel 1). Når man sammenligner en prøve med højt lignin vs. højt indhold af kulhydrater, forskellene i de spektrale data er synlige. Than bruge af pyMBMS data kombineret med en principal komponent analyse (PCA) er illustreret i figur 6. I dette eksempel er prøverne klassificeret i henhold til lav eller høj nitrogengødskningen. Lignin og kulhydrat indhold tilpasse omvendt langs PC1. Brugen af hovedstolen komponent loadings plot kan hjælpe med at identificere, hvilke kemiske egenskaber bliver forklaret i scoringer klassifikation plot, samt belyse hvilke karaktertræk ændrer mellem prøven klynger.
Figur 1: Sammenligning af glucose og xylose kvantificering ved hjælp af høj-throughput assays kolorimetriske vs. HPLC 9. Sammenligning af glucose og xylose detektion blev udført under anvendelse Xylose (XDH, øverste panel) og glucoseoxidase / peroxidase (GOPOD, nedre panel) med højt gennemløb kolorimetriske enzymbundne assays og højtydende liquid kromatografi.
Figur 2: vrangvillighed af poppel cellevægge som en funktion af syringyl at guaiacyl indhold i lignin 9 (S / G) Forøgelse af vrangvillighed af poppel cellevægge som en funktion af syringyl at guaiacyl indhold i fraktionen lignin (S / G) har. blevet observeret og rapporteret. 755 poppel kerne prøver af samme poppel sort blev overtaget flere hundrede miles af skov i det nordamerikanske Pacific Northwest og screenet for glucose og xylose frigivelse efter termokemisk forbehandling og enzym forsukring. Resultater blev afbildet mod S / G-forhold i cellevæggen lignin som bestemt ved pyMBMS. Modstridigheden falder med stigende S / G indtil omkring 2, hvor det forbliver konstant ved højere S / G. Teoretisk udbytte værdier er baseret på BESC "standard" poppel og skal opfattes som en reference til sammenligning.
Figur 3:. Vrangvillighed i nedreguleret Pt4CL1 ekspression i poppel Nedregulering af Pt4CL1 genet i poppel resulterede i lidt variation i cellevæggen vrangvillighed mellem kloner, men flere drastisk øget vrangvillighed varianter er let identificeres. Klik her for at se et større version af denne figur.
Figur 4: vrangvillighed i forskellige wheatstraw populationer Virkningerne af sort type, stedet for dyrkning, gødning ansøgning, og vanding sats resultat i klart forskellige vrangvillighed niveauer.. Forskellige symboler repræsenterer Forskelnt eksperimentelle vækstbetingelser. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5:. Anvendelse af pyMBMS til analyse af kemiske ændringer i plantecellevægge 28 Toppene betegnet med pile er ligninfragmenter, og blev brugt til at evaluere (a) høj lignin (b) medium lignin eller (c) lavt indhold lignin.
Figur 6:. Principal komponent analyse scoringer plot af forskelle i cellevæggen kemi folkerige træer, der dyrkes med højere og lavere fertilisationsgrader 28 (Top) Principal komponent analysescorer plot illustrerer en præcis klassifikation og derfor forskelle i cellevæggen kemi folkerige træer dyrket med højere og lavere fertilisationsgrader. Principal komponent 1 partitioneret prøverne baseret på højere lignin (negativ) eller indhold højere kulhydrat (positive). (Nederst) De vigtigste komponent belastninger belyse hvilke kemiske komponenter skifte mellem de to klynger af prøver i scoringer plot. De positive belastninger korrelerer med de positive scores, der er repræsentative for indholdet højere kulhydrat, mens negativt korrelerede belastninger tilpasse sig negative scores og dermed højere indhold lignin.
| m / z | Molekylær opgave 30 | S / G / H opgave |
| 94 | phenol | S / G / H |
| 120 | Vinylphenol | H |
| 124 | Guaiacol | G |
| 137 | Ethylguaiacol, homovanillin, coniferylaldehyd alkohol | G |
| 138 | Methylguaiacol | G |
| 150 | Vinylguaiacol | G |
| 154 | Syringol | S |
| 164 | Allyl- + propenyl guaiacol | G |
| 167 | Ethylsyringol, syringylacetone, propiosyringone | S |
| 168 | 4-methyl-2,6-dimethoxyphenol | S |
| 178 | Coniferylaldehyd | G |
| 180 | Coniferylaldehyd alkohol, syringylethene | S, G |
| 182 | Syringaldehyd | S |
| 194 | S | |
| 208 | Sinapylaldehyde | S |
| 210 | Sinapylalcohol | S |
Tabel 1:. Peak m / z og opgaver for lignin-afledte pyrolyse fragmenter som påvist ved massespektrometri Liste over typiske forbindelser opdaget af pyMBMS. Molekylære opgaver baseret på Evans, RJ og TA Milne (1987). Molekylær karakterisering af pyrolyse af biomasse Energi og Fuels 1 (2):. 123-137.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De vigtigste prøveforberedelse trin til opnåelse af nøjagtige og reproducerbare data ved udførelse af high-throughput screening eksperimenter er som følger:
Sugar frigivelsesassay:
I almindelighed prøver fremstillet i partier, der spænder fra nogle få dusin til flere tusinde ad gangen. Hvert stort skridt udføres typisk for alle prøver før bevæger sig fremad for at minimere variationer i forberedelse mellem prøver. De-Stivelse var ikke oprindeligt en del af protokollen og kan udelades i visse tilfælde. Træ kerne prøver og senesced urteagtige materialer er konstant lav i stivelse, og derfor ikke kræver de-stivning at reducere variabilitet. Stivelse er et stort problem; Men i prøvesæt af grønne væv planter, især for store prøvesæt, hvor høsten sker over flere timer. Som stivelse stiger i dagtimerne og er udtømte i mørke, kan stivelse varierer betydeligt i several h og glukose fra stivelse ikke kan skelnes fra glukose fra cellulose, derfor kan høje stivelse niveauer føre til forvrængede, lave vrangvillighed målinger. Den faktiske enzym belastning i destarching trin er af mindre bekymring, så længe der er nok overskydende aktivitet til at fjerne alle tilgængelige stivelse inden for tidsrammen af stivelsen hydrolyse trin. Variationer i de specifikke enzymer, der anvendes, tid, temperatur, volumen, og agitation på trin stivelse-fjernelse af kan helt sikkert føre til forskelle i stivelse fjernelse niveauer og satser og bør bestemmes empirisk når det er muligt. Endelig, når indpakning teposer for udvinding, bruge tin-belagt kobbertråd. Bare kobbertråd kan forårsage uønskede kemiske reaktioner med enzymopløsningen, der gav falske sukker værdier. Tin-belagt kobber løst dette problem, mens tråd af rustfrit stål ikke var plastisk nok til at holde de teposer tæt lukket.
Ensartet størrelse-reduktion af biomasse er afgørende for accusats data for to grunde: 1) Fint formalet biomasse, mens lettere og konsekvent dispenseres, er også lettere at fordøje end grovere materiale. 2) Biomasse, der er for groft kan tilstoppe tragtene, hvilket resulterer i utilstrækkelig stof eller, hvis clog kun delvist blokerer åbningen, kan den fungere som en si og tillader kun fine partikler igennem, sænke den observerede Modstridigheden prøven. Hvis for lidt biomasse er indeholdt i tragtene, kan belægge den siderne af tragten, hvilket får robotten til at antage tragten er tom, og prøven vil blive sprunget over i udleveringsprocessen. Derudover kan lave niveauer af biomasse bidrager til overdreven prøve heterogenitet, især da tættere partikler (såsom svær) tendens til at si til bunden af keglen og få afgives først. Når mindre end 50 mg materiale til rådighed, kan assayet stadig udføres; dog bør prøverne være hånd-vejet. Men resultaterne af hånd-vejning er mere variable end dem fra røveotisk vejning.
Den faktiske mængde af biomasse kræves for forberedende skridt er ikke veldefineret. Vi har foreslået 250 mg som en rimelig udgangspunkt, men hver biomasse prøven har forskellige egenskaber med hensyn tab som følge af håndtering, slibning, og udvinding samt at blive holdt op i tragte eller der dispenseres reproducerbart. Den heterogenitet af biomasse på tværs typer, og selv inden for samme type til hinder for en mere defineret protokol. Dem, der ønsker at gennemføre disse analysemetoder vil simpelthen nødt til at bestemme mange af disse variabler for sig selv, selvom erfaring gør det nemmere.
Et andet skridt, som kan indføre fejl blanding i mikrotiterplader, hvilket er notorisk vanskeligt og er kritisk i disse assays for flere grunde. Enzymopløsningen anvendes, er koncentreret og kan stratificeres ved tilsætning til brøndene, enzym adgang til biomassen. Som saccharificeringsprocesser skrider frem, det sugars frigives, kan også stratificere og koncentrere nær biomasse og afhængig af dybden prøveudtagning, kan sukker assays kunstigt høj eller lav. Derfor er det afgørende at blande prøver efter enzymtilsætning og enzym forsukring, tillader grundig blanding af enzymerne med biomassen for endnu forsukring og ensartet fordeling af de resulterende sukkerarter for at muliggøre konsekvent sukkeranalyse. I plader, der ikke indeholder biomasse, såsom fortyndings- eller assayplader, er blanding ved gentagen pipettering (triturering) vist sig at være langt overlegen end omrystning. Men som opløsninger i denne protokol har variable tætheder og partikler, pipettering hastighed og lodrette spids placering i den flydende kolonne er kritisk. Hvis hastigheden er for hurtigt, dårlig nøjagtighed på grund af kavitation (aspiration) og flydende tilbageholdelse i spidsen (afgivelse) kan forekomme. Hvis spidsen er for dybt i brønden, kan biomasse tilstoppe spidsen eller spidsen kan presses til bunden, hvilket forhindrer nøjagtig aspiration, og derer mere ydre overflade område for væske at klamre sig til og overførsel til næste trin. Sidstnævnte problem kan afbødet noget af kontrol spidsen tilbagetrækning hastighed, som langsommere tip fjernelse tillader væske, der skal fjernes for at bulkopløsningen ved overfladespænding. Hvis tilbagetrækning tip er for langsom, kan pipetteret væske krybe tilbage i bulkopløsningen samt. Biomassepartikler har også en tendens til at klynge sig til spidserne og bliver overført til fortyndingsplade, hvor de kan tilstoppe spidsen under blanding eller overførsel til assaypladerne, skaber unøjagtigheder i prøvevolumener, der analyseres. Disse partikler kan også interferere med spektroskopisk analyse af assaypladerne hvis de okkluderer lysstrålen under læsning.
Konsekvent farveudvikling timing er kritisk for GOPOD og XDH assays. Farven udvikling skal have lov til at gå til færdiggørelse; dog GOPOD analysen farve har tendens til at fortsætte med stigende efter afslutningen og NADH genereret af XDH analysen langsomtfalder som følge spontan oxidation af NADH. Som et resultat, kan timing variation føre til inkonsistente sammenligninger af data mellem separate plader. De assaytrin bør overvåges nøje, da driftsstop på grund af hardware- eller softwareproblemer kan føre til store forskelle i assay gange. Brugen af standarder sukkerpriser og standard biomasse kontrolbrønde i hver plade kan bidrage til at afbøde dette til en vis grad.
PyMBMS:
Standarder skal nøje overvejes for pyMBMS eksperimenter til sammenligning med standard våde kemiske metoder. På grund af den forskellige lignin sammensætning (S / G-forhold) biomasse arter, skal korrektionsfaktoren bestemmes ved anvendelse af en repræsentativ standard, der er den samme art som den eksperimentelle prøve. Hvis der ikke er nogen passende standard til rådighed, kan sammenlignes forskelle i lignin koncentration ved hjælp af intensiteterne af lignin forstadier direkte. Høj S / G-forhold (over ~ 3.5) kan føre til overvurdering af lignin indhold ved pyMBMS. Dette er forårsaget af tendensen til S lignin skal fortrinsvis frigivet under standardbetingelserne, der anvendes i denne metode. Hertil kommer, at mængden af prøven nødvendig for pyMBMS målinger afhænger af typen af biomasse. Isolerede lignin og lignin modelforbindelser kræver mindre materiale (0,1 mg), som ved hjælp af større portioner af prøven kan mætte detektoren.
Et andet afgørende skridt i PyMBMS processen er omhyggelig indstilling af instrumentet til en kendt standard som perfluortributylamin (PFTBA) før hvert forsøg. PFTBA indeholder molekylære toppe på tværs af hele spektret af typiske biomasse, og derfor giver ensartede akt tuning mellem eksperimentelle kørsler. Den midterste område af PFTBA spektre er tunet så m / z 131 og m / z 219 er cirka 50% af intensiteten af m / z 69. Denne tuning anvendes til at fremhæve typiske toppe ses under blød ionisering (17 eV) anvendes om at undgå opsplitning af ioner til lavere masser at C Annot let identificeres.
Det skal bemærkes, at disse metoder er ikke analysemetoder til den nøjagtige kvantificering af analytter af interesse. Tværtimod, disse high-throughput teknikker er til screening af store biomasse sætter at identificere dem, der har de ønskede kemiske egenskaber. Disse metoder bør kun anvendes til screening, ranking, og korrelation af prøver inden et datasæt. Datasæt kan ikke direkte sammenlignes, når indsamlet på forskellige dage på grund af kilder til variation som instrumental afdrift, ændringer i enzymaktivitet, omgivende fugtindhold i biomassen grund af ændringer i luftfugtighed, temperatursvingninger, og forskelle i tips og absorbans plade masser . Derudover forbehandlingen anvendes i prøveforberedelsen protokollen er ikke en optimeret forbehandling strategi, men snarere er specielt designet til at være suboptimal. Dette muliggør subtile forskelle mellem de planter, der skal mere effektivt belyst.
jove_content "> Den største fordel ved at vedtage high-throughput metoder er, at kan måles mange flere prøver i samme periode 18. For eksempel er en fælles metode til at analysere kulhydrater produceret i en syre eller enzymatisk forsukring er brugen af højtydende væskekromatografi (HPLC). Selig et al., angiver, at den allestedsnærværende totrins syrehydrolyse, men ganske nyttigt og altafgørende for kvantificering af strukturelle kulhydrater, begrænser forskere at kunne evaluere ca. 25 prøver per uge 9. Mens den analytiske instrumentering anvendes i high-throughput metoder ikke giver, kan følsomheden af en standard teknik som HPLC, hurtig analyse giver forskere luksus at kunne vurdere store mængder prøver. Desuden ofte high-throughput metoder har nedskaleres forsøgsprotokoller, reducere brugen af forbrugsvarer, og derfor faldende eksperimentelle omkostninger og affald.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biomek FX Automated Workstation | Beckman Coulter | Biomek FX | Automated Liquid Handler |
| Wiley mill | Thomas Scientific | 3375E15 (Model 4), or 3383L20 (Mini-mill) | |
| anti-static bags | Minigrip* | MGST4P02503 | 2.5x3", multiple suppliers available |
| tin-coated copper wire | McMaster-Carr | 8871K84 | 0.016" diameter, bend-and-stay wire |
| tea-bags | Herbco | press n' brew teabags | 3.5x5 inches |
| gluco-amylase | Novozymes | Spirizyme Fuel | |
| alpha-amylase | Novozymes | Liquozyme SC DS | |
| sodium acetate trihydrate | any chemical supplier | reagent grade | |
| acetic acid | any chemical supplier | reagent grade | |
| 190 proof (95%) ethanol | any chemical supplier | reagent grade | |
| hoppers | Freeslate | ||
| 96-well C-276 Hastelloy plates | Aspen Machining (Lafayette, Colorado) | N/A (custom built) | |
| 1/8” soldering iron tip | Sears | ||
| silicone-adhesive backed Teflon tape | 3M | 5180 | 3" wide (36-yard rolls) |
| enzyme solution | Novozymes | Cellic CTec2 | |
| citric acid monohydrate | any chemical supplier | ||
| trisodium citrate dihydrate | any chemical supplier | ||
| disposable, polystyrene 96-well plates | Greiner Bio-One | 655101 | or equivalent; multiple suppliers available |
| glucose oxidase/peroxidase | Megazyme | K-Gluc | Megazyme D-glucose assay kit |
| xylose dehydrogenase | Megazyme | K-Xylose | Megazyme D-xylose assay kit |
| glucose standard solution | Megazyme | K-Gluc | Megazyme D-glucose assay kit |
| xylose standard solution | Megazyme | K-Xylose | Megazyme D-xylose assay kit |
| stainless steel sample cups | Frontier Laboratories | PY1-EC80F | |
| glass fiber sheets | Pall | 66227 | 8x10" sheets; circles punched with standard hole punch |
| Sugarcane Bagasse Whole Biomass Feedstock | NIST | 8491 | |
| Eastern Cottonwood (poplar) Whole Biomass Feedstock | NIST | 8492 | |
| Monterey Pine Whole Biomass Feedstock | NIST | 8493 | |
| Wheat Straw Whole Biomass Feedstock | NIST | 8494 |
References
- U.S. Billion-Ton Update: Biomass Supply for a Bioenergy and Bioproducts Industry. Perlack, R. D., Stokes, B. J. , Oak Ridge National Laboratory. Oak Ridge, TN. (2011).
- Henry, R.
- Henry, R. J. Evaluation of plant biomass resources available for replacement of fossil oil. Plant Biotechnol. J. 8 (3), 288-293 (2010).
- Furtado, A., et al. Modifying plants for biofuel and biomaterial production. Plant Biotechnol. J. 12 (9), 1246-1258 (2014).
- Sluiter, J. B., Ruiz, R. O., Scarlata, C. J., Sluiter, A. D., Templeton, D. W. Compositional analysis of lignocellulosic feedstocks. 1. Review and description of methods. J. Agric. Food Chem. 58 (16), 9043-9053 (2010).
- Lupoi, J. S., Singh, S., Simmons, B. A., Henry, R. J. Assessment of Lignocellulosic Biomass Using Analytical Spectroscopy: an Evolution to High-Throughput Techniques. Bioenerg. Res. 7 (1), 1-23 (2014).
- Lapierre, C., Monties, B., Rolando, C. Thioacidolysis of lignin: comparison with acidolysis. J. Wood Chem. Technol. 5 (2), 277-292 (1985).
- DeMartini, J. D., Studer, M. H., Wyman, C. E. Small-scale and automatable high-throughput compositional analysis of biomass. Biotechnol. Bioeng. 108 (2), 306-312 (2010).
- Selig, M. J., et al. High throughput determination of glucan and xylan fractions in lignocelluloses. Biotechnol. Lett. 33 (5), 961-967 (2011).
- Selig, M. J., et al. Lignocellulose recalcitrance screening by integrated high-throughput hydrothermal pretreatment and enzymatic saccharification. Ind. Biotechnol. 6 (2), 104-111 (2010).
- Studer, M. H., De Martini, J. D., Brethauer, S., McKenzie, H. L., Wyman, C. E. Engineering of a high-throughput screening system to identify cellulosic biomass, pretreatments, and enzyme formulations that enhance sugar release. Biotechnol. Bioeng. 105 (2), 231-238 (2009).
- Gjersing, E., Happs, R. M., Sykes, R. W., Doeppke, C., Davis, M. F. Rapid determination of sugar content in biomass hydrolysates using nuclear magnetic resonance spectroscopy. Biotechnol. Bioeng. 110 (3), 721-728 (2013).
- Templeton, D. W., Sluiter, A. D., Hayward, T. K., Hames, B. R., Thomas, S. R. Assessing corn stover composition and sources of variability via NIRS. Cellulose (Dordrecht, Netherlands). 16 (4), 621-639 (2009).
- Tucker, M. P., et al. Fourier transform infrared quantification of sugars in pretreated biomass liquors. Appl. Biochem. Biotechnol. 84-86, 39-50 (2000).
- Wolfrum, E. J., Sluiter, A. D. Improved multivariate calibration models for corn stover feedstock and dilute-acid pretreated corn stover. Cellulose (Dordrecht, Netherlands). 16 (4), 567-576 (2009).
- Ona, T., et al. Non-destructive determination of wood constituents by Fourier-transform Raman spectroscopy. J. Wood Chem. Technol. 17 (4), 399-417 (1997).
- Ona, T., Sonoda, T., Ohshima, J., Yokota, S., Yoshizawa, N. A rapid quantitative method to assess eucalyptus wood properties for kraft pulp production by FT-Raman spectroscopy. J. Pulp Pap. Sci. 29 (1), 6-10 (2003).
- Hames, B. R., Thomas, S. R., Sluiter, A. D., Roth, C. J., Templeton, D. W. Rapid biomass analysis. New tools for compositional analysis of corn stover feedstocks and process intermediates from ethanol production. Appl. Biochem. Biotechnol. 105-108, 5-16 (2003).
- Studer, M. H., et al. Lignin content in natural Populus variants affects sugar release. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (15), 6300-6305 (2011).
- Chen, M., Zhao, J., Xia, L. Comparison of four different chemical pretreatments of corn stover for enhancing enzymatic digestibility. Biomass Bioenergy. 33 (10), 1381-1385 (2009).
- Davison, B. H., Drescher, S. R., Tuskan, G. A., Davis, M. F., Nghiem, N. P. Variation of S/G ratio and lignin content in a Populus. family influences the release of xylose by dilute acid hydrolysis. Appl. Biochem. Biotechnol. 129-132, 427-435 (2006).
- Li, X., et al. Lignin monomer composition affects Arabidopsis cell-wall degradability after liquid hot water pretreatment. Biotechnol. Biofuels. 3, 27-33 (2010).
- Lupoi, J. S., et al. High-throughput prediction of eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using multivariate analysis: a comparison between mid-infrared, near-infrared, and Raman spectroscopies for model development. Biotechnol. Biofuels. 7, 93 (2014).
- Lupoi, J. S., Smith, E. A. Characterization of woody and herbaceous biomasses lignin composition with 1064 nm dispersive multichannel Raman spectroscopy. Appl. Spectro. 66 (8), 903-910 (2012).
- Sun, L., et al. Rapid determination of syringyl:guaiacyl ratios using FT-Raman spectroscopy. Biotechnol. Bioeng. 109 (3), 647-656 (2012).
- Lupoi, J. S., et al. High-throughput prediction of Acacia and eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using FT-Raman spectroscopy and partial least squares modeling. Bioenerg. Res. in press, (2015).
- Sykes, R., Kodrzycki, B., Tuskan, G., Foutz, K., Davis, M.
- Sykes, R., et al. Ch. 12. High-Throughput Screening of Plant Cell-Wall Composition Using Pyrolysis Molecular Beam Mass Spectroscopy. Biofuels: Methods and Protocols. Mielenz, J. R. 581, 169-183 (2009).
- Decker, S., et al. Ch. 17. Reducing the effect of variable starch levels in biomass recalcitrance screening). Biomass Conversion. Himmel, M. E. 908, Humana Press. 181-195 (2012).
- Evans, R. J., Milne, T. A.
