Introduction
Um dos objectivos fundamentais da medicina regenerativa é a geração de células novas e funcionais que podem ser utilizadas para reparar ou substituir danificado, degenerou tecidos. Refazendo células adultas facilmente disponíveis para novos, convertendo-os a partir de um tipo de célula para outra, constitui uma abordagem particularmente interessantes, especialmente quando a população de células não é necessário abundante ou de difícil acesso. No entanto, células adultas são notavelmente estáveis. Eles adquirem seu estado diferenciado através de uma restrição gradual em suas opções e, uma vez que eles atinjam a especialização de terminais maduros, eles estavelmente guarde-1.
Nos últimos anos, um número de protocolos têm sido desenvolvidos, que permitem a reprogramação para pluripotência de uma célula somática (IPS) obtida através da expressão forçada de um conjunto de factores de transcrição 2,3. Alternativamente, a conversão de células podem ser obtidas por transdiferenciação linhagem directa, a introdução de um único quatro 5-7. Esta estratégia não envolve a transição através de um estado diferenciado-de, mas exige alta expressão da transcrição específica fatores 8.
Nós desenvolvemos recentemente um protocolo de conversão com base na breve exposição de células adultas para as propriedades demetilantes da citidina análogo 5-azacitidina (5-aza-CR), um inibidor da DNA metiltransferase bem caracterizado. O passo de desmetilação é imediatamente seguido por um protocolo de diferenciação específica 9-11 que permite obter o fenótipo do terminal necessária. Este método é capaz de converter as células maduras, diferenciadas em células de uma linhagem diferente e tem a vantagem substancial a fim de evitar, tanto a utilização de vectores virais e a transfecção de quaisquer factores de transcrição exógenos. A aquisição de um estado pluripotente estável, eo aumento da susceptibilidade relacionadas à célula instabilidade também é evitado.
9-13, bem como no cão (manuscrito apresentado), sugerindo uma grande eficácia e robustez da abordagem.
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Protocol
Nota: Todos os procedimentos descritos abaixo deve ser realizada sob capela de fluxo laminar em condições estéreis. Certifique-se de que todos os procedimentos de cultura são realizadas em etapas termóstato e as células são mantidas a 37 ° C em toda a manipulação.
1. Pele Isolamento de fibroblastos
- Prepare Cultura Solution Dish Coating
- Dissolve-se 0,1 g de gelatina porcina em 100 ml de água (concentração final 0,1%). Esterilizar solução com autoclave.
- Adicionar 1,5 ml de solução estéril de gelatina porcina 0,1% a 35 mm pratos Petri. Espera 2 h para o revestimento, mantendo-as à temperatura ambiente.
Nota: As biópsias da pele humana são recolhidas por excisão sob anestesia local a partir de uma zona avascular do aspecto anterior do antebraço e armazenado em tampão fosfato salino de Dulbecco (PBS) suplementado com solução de antibiótico antimicótico a 2% a 4 ° C antes de usar.
- Lavar com biópsias novo PBS suplementado com 2% de antibisolução antimicótico ótica.
- Coloque biópsias em um prato de 100 milímetros Petri e corte em cerca de 2 mm 3 fragmentos com bisturis esterilizados.
- Remover o excesso de solução de revestimento imediatamente antes do plaqueamento fragmentos.
- Coloque 5-6 fragmentos de pele na placa de Petri de pré-revestido 35 mm.
- Prepare meio de cultura de fibroblastos: 77% de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) elevado teor de glucose, 20% de Soro Fetal Bovino (FBS), 1% de solução de L-glutamina e 2% de solução de antibiótico antimicótico.
- Adicionar uma gota de meio de fibroblastos sobre cada fragmento (geralmente 100 ul por fragmento) e cultura los a 37 ° C em 5% de CO 2.
- Após 24 horas, adicionar 500 mL de meio de cultura de fibroblastos sobre os fragmentos para os manter húmida a 37 ° C em 5% de CO 2.
- Alterar o meio com uma pipeta, pelo menos uma vez a cada 48 horas.
- Após 6 dias de incubação, retirar fragmentos de tecido com cuidado e descartá-las.
Nota: Após 6 dias, de fibroblastoss começar a crescer a partir dos fragmentos de tecido e começam a formar uma monocamada de células. - Actualizar meio, adicionar 2 ml de meio de cultura de fibroblastos e continuar a cultura de células em monocamada a 37 ° C em 5% de CO2.
2. Cultura de fibroblastos
- Fibroblastos de cultura a 37 ° C em 5% de CO2, até 80% de confluência
- Para Passaging, meio de cultura de fibroblastos a partir de aspirado de pratos de cultura de tecidos. Lave as células três vezes com 4 ml de PBS suplementado com solução de antibiótico antimicótico a 1%.
- Adicionar uma camada fina (10% do volume de meio de cultura) de uma solução de tripsina-EDTA (0,5 g / L de porcino de tripsina e 0,2 g / L de EDTA) e incubar a 37 ° C até a monocamada de células começa a separar da parte inferior do tecido placa de cultura e as células se dissociam.
- Dilui-se a suspensão de células com 9 partes de meio de cultura de fibroblastos de acção para neutralizar a tripsina. A centrifugação não é necessário.
- células da placa em novas placas de cultura (coma gelatina) e cultura a 37 ° C em 5% de CO2. Mantenha a razão de passagem entre 1: 2 e 1: 4, dependendo da taxa de crescimento.
- Quando as células atingem cerca de 80% de confluência, passagem los (geralmente duas vezes por semana).
3. Fibroblasto chapeamento de epigenética Conversão
- Adicionar 0,26 ml / cm 2 de 0,1% de gelatina porcina (preparar como descrito em 1.1) para pratos de cultura de células. Esperar 2 horas para o revestimento.
- Remover o excesso de solução de revestimento min antes do plaqueamento 10-30 fibroblastos.
- Remover o meio de cultura de fibroblastos a partir de placas de cultura. Lave as células três vezes com PBS suplementado com solução de antibiótico antimicótico a 1%.
- Adicionar uma camada fina (10% do volume de meio de cultura) de uma solução de tripsina-EDTA (0,5 g / L de porcino de tripsina e 0,2 g / L de EDTA) e incubar a 37 ° C até a monocamada de células começa a separar da parte inferior do tecido placa de cultura e as células se dissociam.
- Dilui-se a suspensão de células com 9 partes de fibroblmeio de cultura de AST para neutralizar tripsina acção.
- Contagem de células utilizando uma câmara de contagem sob um microscópio à temperatura ambiente. Calcular o volume necessário de meio de cultura de fibroblastos para ressuspender as células, para se obter uma concentração celular de 7,8 x 10 4 fibroblastos / cm2. Isto dependerá do tipo específico de câmara utilizada.
Células / ml = Número médio de célula por grade x 90 (fator de multiplicação) diluição x pequena - suspensão de células Centrifugar a 150 g durante 5 min à temperatura ambiente. Remover as células sobrenadante e ressuspender com o volume calculado previamente de meio de cultura de fibroblastos.
- Células de placa em pratos de 0,1% de gelatina e cultura los durante 24 h a 37 ° C em 5% de CO 2 incubadora pré-revestidos.
A plasticidade celular 4. Aumento Usando o De-metilação Agente 5-aza-CR
- dia 0
- Prepare 5-aza-CR solução de reserva dissolvendo 2,44 mg de 5-aza-CR, em 10 ml de DMEM de alto teor de glucose Medium. Esterilizar por filtração. Prepare da 5-aza-CR imediatamente antes da utilização.
- Dilui-se 1 ul de 5-aza-CR solução estoque em 1 ml de meio de cultura de fibroblastos (concentração final de 1 uM).
- Para aumentar a plasticidade da célula, 24 horas após o plaqueamento de células (3,8 subtítulo), remover o meio de cultura a partir de fibroblastos semeados e adicionar 1 uM 5-aza-CR solução estoque e a cultura durante 18 horas a 37 ° C em 5% de CO2.
- Dia 1
- Prepare meio fresco pluripotentes humanas (HP), tal como descrito na Tabela 1.
- Após incubação com 1 uM de 5-aza-CR, remover o meio e lava-se as células três vezes com PBS para assegurar que a 5-aza-CR é lavado.
- Incubar 5-aza-CR fibroblastos tratados com meio de HP durante 3 horas (período de recuperação) a 37 ° C em 5% de CO 2.
- Após o período de recuperação, remover o meio, lavar três vezes com PBS.
- Para controlar a eficácia de 5-aza-CR tratamento, verificar neste passo fou a presença de alterações morfológicas (detalhado na secção de resultados). Células perdem a morfologia alongada típica de fibroblastos e adquirem uma forma redonda ou oval, tornando-se menores em tamanho, com núcleos aumentados.
- Prosseguir com a diferenciação de pâncreas.
5. pâncreas Diferenciação Protocolo
- dias 1-6
- Prepare pâncreas Meio Basal como descrito na Tabela 2.
- Prepare Activina A solução estoque: dissolver 5 ug de proteína de activina A recombinante humana em 166.6 ul de água estéril.
- Cultura 5-aza-CR tratada fibroblastos em 0,26 ml / cm 2 de pâncreas Meio Basal, suplementado com 1 ul / ml de activina A solução de reserva (ver 5.1.2) durante 6 dias a 37 ° C em 5% de CO2. Alterar média diária.
- dias 7-8
- Preparar solução mãe de ácido retinóico por adição de 16,6 ml de sulfóxido de dimetilo (DMSO) a 50 mg de aci retinóicod.
- Células de cultura em 0,26 ml / cm 2 de pâncreas Meio Basal suplementado com 1 ul / ml de activina A solução de reserva (ver 5.1.2) e / ml de solução concentrada de ácido retinóico 1 ul (ver 5.2.1) durante 2 dias a 37 ° C em 5% de CO 2. Alterar média diária.
- dias 9-36
- Células de cultura em 0,26 ml / cm 2 de pâncreas Meio Basal suplementado com 1% (v / v) insulina-transferrina-selênio (ITS), 2% (v / v) B27 e 0,1% (v / v) recombinante de FGF humano básico (bFGF) da solução (ver Quadro 1) a 37 ° C em 5% de CO2. Mudar a forma diariamente durante os primeiros 15 dias.
- A partir do dia 16 em diante, refrescar meio todos os outros dias, sob um microscópio, uma vez que as células formadoras de agregados pode soltar-se do fundo do prato de cultura.
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Representative Results
Estabelecimento de cultura primária a partir de biópsias de pele
As biópsias da pele foram cortados em pequenos fragmentos e colocados em pratos de gelatina pré-revestidos. Após 6 dias, os fibroblastos começou a crescer a partir dos fragmentos de tecido e formou uma monocamada de células (Figura 1A). As células apresentaram uma forma típica alongado e, como esperado, apresentou um imuno-positividade uniforme para o fibroblasto vimentina marcador específico (VIM, Figura 1B).
As mudanças morfológicas e metilação padrão de fibroblastos da pele após a exposição de 18 h a 5-aza-CR
Para se obter uma conversão bem sucedida epigenética de fibroblastos em células secretoras de insulina, que aumentou a sua plasticidade utilizando o agente de de-metilação, 5-aza-CR. Fibroblastos humanos foram semeadas em 0,1% de gelatina pratos pré-revestidos a uma concentração de 7,8 x 10 4 / cm 2 fibroblastos. Vinte e quatro horas após a sementeira, as células Were incubadas com 1? M de 5-aza-CR durante 18 h.
No final deste tratamento, uma grande alteração de fenótipo das células era visível (Mensagem 5-aza-CR, Figura 2A). A morfologia alongada típica de fibroblastos não tratados (T0, Figura 2A), foi substituída por uma forma redonda ou oval e o tamanho da célula tornou-se consideravelmente mais pequena. O citoplasma foi granulado, achatada, e as células eram aderentes à superfície da cultura. Núcleos apareceu maior e vacuolizado, como uma consequência da estrutura da cromatina relaxado. Na nossa experiência, a presença destas alterações morfológicas é essencial e deve ser cuidadosamente monitorizada como um marcador para a eficácia do tratamento com 5-aza-CR.
Após 18 h de exposição para 5-aza-CR, uma diminuição acentuada de metilação global do DNA também era evidente e foi claramente demonstrado pela diminuição da intensidade da imunocoloração 5-metilcitidina ( alterações morfológicas e funcionais durante a conversão epigenética da pele fibroblastos em células secretoras de insulina Durante o primeiro passo, as células foram cultivadas durante 7 dias em meio suplementado basal do pâncreas com a activina A para promover a adesão endoderme. Nesse intervalo, as células mais achatadas e gradualmente começou a se organizar em grupos (dia 7, Figura 3A). Subsequentemente, a diferenciação da linhagem de pâncreas foi promovida com a adição de ácido retinóico, durante 2 dias. Em resposta a este tratamento, as células reorganizadas em um padrão reticular e cresceu em agregados claramente distinguíveis celulares (Dia 10, Figura 3A). A formação de agrupamento pROCESSO aumentou com o tempo e foi mais estimulada por o terceiro e último passo, que consistiu de exposição da célula para B27, bFGF e ITS. Isto levou ao recrutamento de um número crescente de células que agregadas em grandes colônias 3D (dia 20, Figura 3A). Por volta do dia 36, essas colônias apareceu como estruturas arredondadas que lembram distintas de ilhotas pancreáticas típicos in vitro (dia 36, Figura 3A). A aquisição do novo fenótipo EPICC foi acompanhada por um aumento gradual dos níveis de metilação do DNA globais que retornaram aos observados nos fibroblastos não tratados (5 mC Dia 36 A Figura 3B). Depois de 36 dias de indução de pâncreas, a eficiência de conversão epigenética também foi demonstrada pela expressão de marcadores pancreicas maduras típicos, que foram originalmente indetectável nos fibroblastos não tratados (T0, Tabela 1: soluções de materiais. Tabela 2: soluções de materiais.
Para induzir a diferenciação pancreática, 5-aza-CR fibroblastos tratados foram expostos a um protocolo de três passos para a indução do pâncreas, imediatamente após o período de recuperação de três horas. 
Figura 1: Isolamento e caracterização de fibroblastos da pele humana (A) Imagem representativa de fibroblastos crescem fora dos fragmentos de tecido.. (B) fibroblastos exibir uma imuno-positividade uniforme para sua svimentina marcador ESPECÍFICAS (Vim). Os núcleos são corados com DAPI. (Barras de escala, de 100 m). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 
Figura 2: As alterações morfológicas e metilação de fibroblastos da pele humana após 5-aza-CR tratamento (A) Imagens representativas de fibroblastos não tratados mostrando forma alongada (T0), e 5-CR aza fibroblastos tratados exibindo uma rodada ou morfologia oval, granulada. citoplasma e ampliadas e vacuoladas núcleos (Post 5-aza-CR). (barras de escala, de 100 m). (B) Uma diminuição da metilação de DNA global é detectável após tratamento com 5-aza-CR (Mensagem 5-aza-CR). (Barras de escala, 50 mm). Por favor, click aqui para ver uma versão maior desta figura. 
Figura 3:. As alterações morfológicas e funcionais durante a conversão epigenética (A) imagens representativas das alterações morfológicas que ocorrem durante a diferenciação de pâncreas endócrino. Após 7 dias de indução, as células humanas organizar gradualmente em aglomerados (dia 7). Em resposta à adição de ácido retinóico, que rearranjam-se de um padrão reticular e agrupar em agregados distinguíveis (Dia 10). Estas formações progredir com o tempo, as células de recrutamento e agregação em grandes colônias 3D (dia 20). Finalmente, as colónias tornam-se estruturas esféricas que tendem a separar e flutuar livremente no meio de cultura, reminiscente de ilhéus pancreáticos típicos in vitro (36 ° dia). (barras de escala, de 100 m). (B) Depois de 36 dias de pâncreas emprodução, os níveis de metilação do DNA globais de retorno EPICC humana aos observados em fibroblastos não tratados (5 Dia mC 36). (Barra de escala, 50 mm). A co-localização de Pdx1 com C-PEP é detectável no final do período de conversão (Dia 36), enquanto que estes marcadores pancreáticas endócrinas são completamente ausente nos fibroblastos não tratados (T0). (barras de escala, de 100 m). A libertação de insulina (C) EPICC em resposta a 20 mM de D-glicose e 20 mM de L-exposição de glicose. As barras representam a média ± SD de três réplicas independentes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Nome do material / Equipamento Quantidade (v / v) Comentários / Descrição Mix de nutrientes F-10 de Ham 40% DMEM de baixa glucose 40% Substituição KnockOut Serum 10% FBS 5% solução antimicótico antibiótico 1% solução de L-Glutamina 1% Solução Aminoácidos MEM Non-Essential 1% stock 2-Mercaptoethanol 1% 2-mercaptoetanol da preparação: diluite 3,5 ul de 2-mercaptoetanol em 5 ml de PBS estéril. Loja no escuro a 4 ° C. Nota: Use dentro de 2 semanas estoque mix nucleosídeo 1% nucleosídeos preparação da mistura de estoque: dissolver 0,042 g Guanosine, 0,040 g de adenosina, 0,036 g citidina, 0,036 g Uridina e 0,012 g timidina em 50 ml de água estéril. Fundem a 50 ° C para dissolver. Esterilizar em filtration e armazenar a 4 ° C ESGRO (LIF) 0,1% Recombinante FGF humano básico (bFGF) de ações 0,1% preparação de estoque de bFGF: adicionam-se 5 ml de 0,1% de Albumina de Soro Bovino (BSA) em PBS a 25 jig de bFGF Nome do material / Equipamento Quantidade (v / v) Comentários / Descrição DMEM / F-12 93% B-27 Suplemento Minus vitamina A 2% N-2 Suplemento 1% Solução Aminoácidos MEM Non-Essential 1% Antibióticosolução antimicótico 1% stock 2-Mercaptoethanol 1% 2-mercaptoetanol da preparação: diluite 3,5 ul de 2-mercaptoetanol em 5 ml de PBS estéril. Loja no escuro a 4 ° C. Nota: Use dentro de 2 semanas solução de L-Glutamina 1% estoque BSA 1% Preparação de BSA estoque: dissolver 250 mg em 50 ml de água. Esterilizar por filtração e armazenar a 4 ° C.
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Discussion
O presente manuscrito descreve um método que permite a conversão de fibroblastos de pele humana em células produtoras de insulina, por meio de uma exposição transitória e breve a 5-aza-CR, seguido por um protocolo de indução de tecido específico. Esta abordagem permite que um interruptor de mesoderme endoderme de células relacionadas, sem a expressão forçada de factores de transcrição ou microARNs nem a aquisição de um estado pluripotente estável, que torna as células mais instável e propenso a erros 14.
No primeiro passo, a plasticidade de células é aumentada graças a um modificador epigenética sintético que induz um estado permissivo transitória, reversível em células terminalmente diferenciadas. Em particular, 5-aza-CR foi usada a fim de provocar uma diminuição da metilação global das células de fibroblastos da pele. 5-aza-CR é conhecido por inibir directamente a actividade metil-transferase e para evitar que a metilação de novo no ADN recentemente sintetizado. Devido ao seu efeito, esta moléculafoi anteriormente usado para reactivar genes silenciosos, bem como para modificar o estado de diferenciação de células eucarióticas 15,16. Consistente com este, coloca-5-aza-CR fibroblastos da pele mostrou uma desmetilação global do DNA (Figura 2A), indicando 5-aza-CR capacidade de aumentar a plasticidade nas células utilizadas para as experiências presentes. Esta é também de acordo com a observação de que 5-aza-CR facilita a expressão da alta marcador relacionadas com a plasticidade Oct-4 em células de neuroesferas (NCCC) 17. No entanto, é interessante notar que o POST 5-aza-CR fibroblastos da pele reverter para o seu fenótipo original após a remoção de 5-aza-CR. Com efeito, foi previamente demonstrado que os fibroblastos devolvido ao seu meio de cultura original, expressão regulada para baixo dos factores relacionados com o pluripotência 9,10, indicando que o estado de plasticidade superior adquirida, em resposta ao modificador epigenética, é transitória, reversível e não envolve modificações permanentes de tele células.
Alterações acentuadas na morfologia celular acompanhou a indução de um estado mais elevado de plasticidade (Figura 2A). Os corpos celulares alongado típicos de células de fibroblasto não tratados foi substituído por células redondas ou ovais que apresentaram dimensões menores e um aumento do volume de núcleos, que apareceu maior do que a de células diferenciadas. Niwa correlacionados este alargamento nuclear para a estrutura da cromatina relaxado descrito como uma característica relacionada com a pluripotência 18. A presença de núcleos vacuoladas e citoplasma granular, bem como um aumento da morfologia achatar, eram evidentes. Todas as alterações morfológicas descritas pode ser praticamente utilizado como um marcador para a conclusão bem sucedida da primeira parte do protocolo de conversão; em nossa experiência, quando as mudanças estão presentes, 5-aza-CR tem células para adquirir um estado mais permissiva, na verdade ajudou.
É possível tirar partido desta transitórios "altos permistempo-janela sividade "para dirigir células para um fenótipo completamente diferente. O presente protocolo demonstra que os fibroblastos pós 5-aza-CR pode ser re-dirigida a células semelhantes a células beta do pâncreas, em resposta a um meio de diferenciação específica. O protocolo usado permitir que as células de mudar de um tipo de célula mesoderme derivada de uma população de células que pertencem à linhagem endoderme.
A insulina, que originalmente era indetectável em fibroblastos da pele não tratada, foi positivo no final do protocolo de diferenciação (Figura 3B). Esta foi acompanhada da expressão simultânea de outros factores, tais como, Pdx1 envolvidos na diferenciação da totalidade do pâncreas exócrino sua -, endócrino e populações de células ductais, ao lado da linhagem de culas beta específica. Isto é consistente com trabalhos anteriores sobre células estaminais embrionárias de ratinho (CES), indicando que uma diferenciação adequada em células beta foi conseguida apenas quando as células imaturas foram mergulhadas com outrcélulas endócrinas R 19, sugerindo que o micro-ambiente local fornecida pela ilhéus pancreáticos de Langerhans da arquitectura tem um papel funcional forte.
Com efeito, EPICC alcançado um fenótipo diferenciado madura e mostrou a capacidade de responder aos 20 mM de exposição de glucose (Figura 3). A insulina foi segregada activamente no meio de cultura após 1 h de estimulação D-glucose, confirmando a natureza de boa fé de EPICC como as produtoras de insulina (Figura 3C).
Um requisito distintos para o sucesso do procedimento é a manutenção rigorosa das células a 37 ° C, em todos os passos, incluindo o seu manuseamento sob o fluxo laminar estéril e o microscópio. Em nossa experiência, é também altamente recomendável para preparar reagentes recentemente, antes da sua utilização em cultura e para refrescar meio estritamente de acordo com o protocolo. Esta operação deve ser efectuada sob um microscópio, uma vez que as células que formam agregadospode soltar do fundo da placa de cultura e perdeu durante as mudanças de médio porte.
O protocolo de conversão epigenética também tem sido aplicada com êxito para os suínos, bem como para o cão (manuscrito submetido), usando o mesmo número de células / cm2 e concentração do agente de metilação-des descrito para os seres humanos.
Em conclusão, um protocolo que permite a conversão de fibroblastos da pele em outro tipo de células é apresentada aqui. A estratégia descrita tem as vantagens de uma conversão de células baseado em epigenetically: ou seja, a possibilidade de evitar um estado pluripotente que poderiam deixar para trás as células capazes de causar câncer; a eliminação de factores genéticos exógenos que podem causar mudanças nas células remanescentes. Estas vantagens tornam a presente abordagem muito promissora para aplicações de medicina translacional e permite a terapia com células específicas do paciente.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela Fundação Carraresi e Fundação Europeia para o Estudo da Diabetes (EFSD). GP é apoiado por uma bolsa de pós-doc, da Universidade de Milão. Os autores são membros da Acção COST FA1201 Epiconcept: Epigenética e Periconception ambiente e da Acção COST BM1308 Sharing avança em modelos animais de grande porte (SALAAM). Talb é membro da Acção COST CM1406 epigenética Chemical Biology (EPICHEM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D5652 | PBS; for cell wash and solution preparation |
| Antibiotic Antimycotic Solution | Sigma | A5955 | Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media |
| 100 mm Petri dish | Sarstedt | 83.3902 | For Fibroblast isolation |
| Porcine Gelatin | Sigma | G1890 | For dish coating |
| Water | Sigma | W3500 | For solution preparation |
| 35 mm Petri dishes | Sarstedt | 83.39 | For Fibroblast isolation |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 41966052 | For Fibroblast culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10500064 | FBS; Component of Fibroblast and HP media |
| L-Glutamine solution | Sigma | G7513 | Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | For Fibroblast dissociation |
| KOVA GLASSTIC SLIDE 10 WITH GRIDS | Hycor Biomedical | 87144 | Cell counting |
| 5-Azacytidine | Sigma | A2385 | 5-aza-CR, for increrase cell plasticity in fibroblasts |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Life Technologies | 31550031 | For HP medium |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Life Technologies | 31885023 | For HP medium |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828028 | Component of HP medium |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Life Technologies | 11140035 | Component of HP and Pancreatic Basal media |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | Component of HP and Pancreatic Basal media |
| Guanosine | Sigma | G6264 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Adenosine | Sigma | A4036 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Cytidine | Sigma | C4654 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Uridine | Sigma | U3003 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Thymidine | Sigma | T1895 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Millex-GS 0,22 µm | Millipore | SLGS033SB | For sterilizing of solution |
| FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Life Technologies | PHG0261 | bFGF; Component of HP and Pancreatic Basal medium |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3311 | BSA; Component of Pancreatic Basal medium |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320074 | For Pancreatic Basal medium |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A | Life Technologies | 12587010 | Component of Pancreatic medium |
| N-2 Supplement | Life Technologies | 17502048 | Component of Pancreatic Basal medium |
| Activin A Recombinant Human Protein | Life Technologies | PHG9014 | For Pancreatic medium |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | For Pancreatic medium |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | DMSO; for Retinoic Acid stock preparation |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Life Technologies | 41400045 | ITS; for Pancreatic Final medium |
| Anti-Vimentin antibody | Abcam | ab8069 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100 |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma | 32670 | DAPI. For immunocytochemical analisys. Working dilution 1 µg/ml |
| 5-Methylcytidine | Eurogentec | MMS-900P-B | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500 |
| Anti-C Peptide antibody | Abcam | ab14181 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100 |
| Anti-PDX1 antibody | Abcam | ab47267 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500 |
| Mercodia Insulin ELISA | Mercodia | 10-1113-10 | For insulin release detection |
References
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