Introduction
מטרה בסיסית של רפואה רגנרטיבית הוא הדור של תאים חדשים, פונקציונלי, שניתן להשתמש בהם כדי לתקן או להחליף פגום, הידרדר רקמות. Remaking תאי בוגרים זמינים בקלות לתוך חדש, על ידי המרה אותם סוג תא אחד למשנו, היא גישה במיוחד מושכת, במיוחד כאשר אוכלוסיית התא הנדרשת אינה שופעת או קשה לגישה. עם זאת, תאים בוגרים הם יציב להפליא. הם רוכשים מדינת הבדיל שלהם באמצעות הגבלה הדרגתית האפשרויות שלהם, ברגע שהם מגיעים התמחות המסוף הבוגרת, הם ביציבות לשמור אותו 1.
בשנים האחרונות במספר הפרוטוקולים פותחו, המאפשרות תכנות מחדש מגוונת" של תא סומטי (שב"ס) מושג באמצעות הביטוי הכפוי של סט של שעתוק גורמי 2,3. לחלופין, מרת תא ניתן להשיג על ידי transdifferentiation שושלת הישיר, מציגה אחת 4 p> או שילוב של שעתוק גורמי 5-7. אסטרטגיה זו אינה כרוכה במעבר דרך מדינת בדיל-דה אבל דורשת ביטוי גבוה של השעתוק הספציפי גורמי 8.
פתחנו לאחרונה פרוטוקול המרה המבוסס על החשיפה הקצרה של תאי בוגרי מאפייני demethylating של-azacytidine 5 cytidine האנלוגי (5-עז-CR), מעכב methyltransferase DNA היטב מאופיין. הצעד demethylation ומיד אחריו פרוטוקול התמיינות ספציפית 9-11 המאפשר להשיג את הפנוטיפ מסוף נדרש. שיטה זו היא מסוגלת להמיר תאים בוגרים, בדיל לתוך תאים של באים ממשפחות שונות ויש לו את היתרון המשמעותי כדי למנוע הוא את שימוש וקטורים ויראליים ואת transfection של כל גורמי שעתוק אקסוגניים. הרכישה של מדינת pluripotent יציבה, ואת הרגישות המוגברת הקשורים לתא חוסר יציבות הוא נמנע גם.
"Jove_content"> הפרוטוקול המפורט מאפשר המרה של פיברובלסטים עור אנושיים בוגרים לתאי אינסולין מפריש מתפקדים במלואה מוצג כאן. עם זאת, ראוי לציין כי הטכניקה יושמה תאים מסוגים שונים יצרה תוצאות חיוביות, כאשר הם פונים תאים כלפי מסלולי בידול שונים. יתר על כן, מרת אפיגנטיים נוצלה בעבר בהצלחת המין האנושי חזירי 9-13 וכן את הכלב (כתב יד) שנמסר המצביע על יעילות וחוסנם רחבות של הגישה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: כל הנהלים המתוארים להלן חייב להתבצע מתחת למכסה המנוע זרימה למינרית בתנאים סטריליים. ודא כי כל הליכי התרבות מבוצעים על במות נשלטו תרמוסטטית ותאים נשמרים על 37 מעלות צלזיוס לאורך כל הטיפול שלהם.
1. עור בידוד פיברובלסטים
- כן פתרון ציפוי בצלחת תרבות
- ממיסים 0.1 גרם ג'לטין חזירי 100 מ"ל מים (הריכוז הסופי 0.1%). לעקר פתרון עם חיטוי.
- הוסף 1.5 מ"ל של ג'לטין חזירי 0.1% סטרילי עד 35 מ"מ צלחות פטרי. חכה 2 hr המעיל, שמירה אותם בטמפרטורת החדר.
הערה: ביופסיות עור האדם נאספים על ידי כריתה בהרדמה מקומית מאזור avascular של ההיבט הקדמי של האמה ומאוחסנים בופר פוספט של Dulbecco (PBS) בתוספת 2% פתרון antimycotic אנטיביוטי ב +4 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
- ביופסיות לשטוף עם PBS החדש בתוספת 2% antibiפתרון antimycotic otic.
- ביופסיות מקום בצלחת פטרי 100 מ"מ וחותכים כ 2 מ"מ 3 שברים עם אזמלים סטרילית.
- להסיר את עודפי פתרון הציפוי מייד לפני הציפוי שבר.
- מניחים 5-6 שברי העור לתוך צלחת פטרי מראש מצופה 35 מ"מ.
- הכן בינוני תרבות פיברובלסטים: 77% בינוני הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) גלוקוז גבוהה, 20% בסרום שור העובר (FBS), 1% פתרון L-גלוטמין ו -2% פתרון antimycotic אנטיביוטי.
- להוסיף טיפה של המדיום פיברובלסטים על כל שבר (בדרך כלל 100 μl לכל שבר) ותרבות אותם על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2.
- לאחר 24 שעות, להוסיף 500 μl של מדיום התרבות פיברובלסטים על שברי לשמור אותם רטובים על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2.
- שינוי המדיום עם טפטפת לפחות פעם בכל 48 שעות.
- לאחר 6 ימים של דגירה, להסיר שברי רקמה בזהירות וזורק אותן.
הערה: לאחר 6 ימים, פיברובלסטיםתתחיל לצמוח מתוך שברי הרקמה ולהתחיל לגבש בשכבת תא. - רענן בינונית, מוסיפים 2 מ"ל של מדיום תרבות פיברובלסטים ולהמשיך תרבות monolayer תא ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 באינקובטור.
2. פיברובלסטים תרבות
- פיברובלסטים תרבות על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 עד מפגש 80%
- לקבלת passaging, מדיום התרבות פיברובלסטים לשאוב מן המנות בתרבית רקמה. שטפו תאים שלוש פעמים עם 4 מ"ל של PBS השלימו עם פתרון antimycotic אנטיביוטי 1%.
- הוספת שכבה דקה (10% של נפח בינוני תרבות) של פתרון טריפסין-EDTA (טריפסין 0.5 גר '/ ל חזירי ו -0.2 גרם / EDTA L) ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס עד monolayer התא מתחיל להתנתק התחתון של הרקמה צלחת ותאי תרבות לנתק.
- לדלל השעית תא עם 9 חלקים של מדיום התרבות פיברובלסטים לנטרל פעולת טריפסין. צנטריפוגה אין צורך.
- פלייט תאים במנות תרבות חדשה (עםמתוך ג'לטין) ותרבות ב 37 מעלות צלזיוס CO 2 באינקובטור 5%. שמור את היחס המעבר בין 1: 2 ו -1: 4, תלוי בקצב הצמיחה.
- כאשר התאים מגיעים סביב 80% המפגש, מעבר להם (בדרך כלל פעמיים בשבוע).
3. ציפוי פיברובלסטים לגיור אפיגנטיים
- להוסיף 0.26 מ"ל / 2 ס"מ של 0.1% ג'לטין חזירי (להכין כמתואר 1.1) מנות תרבית תאים. חכה 2 hr כדי המעיל.
- הסר את הדקות עודפות 10-30 פתרון ציפוי לפני הציפוי פיברובלסטים.
- הסר בינוני תרבות פיברובלסטים מן הכלים תרבות. שטפו תאים שלוש פעמים עם PBS בתוספת פתרון antimycotic אנטיביוטי 1%.
- הוספת שכבה דקה (10% של נפח בינוני תרבות) של פתרון טריפסין-EDTA (טריפסין 0.5 גר '/ ל חזירי ו -0.2 גרם / EDTA L) ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס עד monolayer התא מתחיל להתנתק התחתון של הרקמה צלחת ותאי תרבות לנתק.
- לדלל השעית תא עם 9 חלקים של fibroblמדיום תרבות אס לנטרל פעולת טריפסין.
- ספירת תאים באמצעות תא ספירה תחת מיקרוסקופ בטמפרטורת החדר. חשב את נפח הנדרש בינוני תרבות פיברובלסטים כדי resuspend תאים, כדי להשיג ריכוז התא של 7.8 x 10 4 פיברובלסטים / 2 ס"מ. זה יהיה תלוי בסוג מסוים של תא בשימוש.
תאים / μl = מספר ממוצע של תא לכל רשת קטנה x 90 (מקדם הכפלה) דילול x - צנטריפוגה ההשעיה התא ב 150 גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. הסרת תאי supernatant ו resuspend עם הנפח מחושב בעבר של מדיום התרבות פיברובלסטים.
- פלייט תאים על מנות מצופות מראש ג'לטין 0.1% ותרבות אותם למשך 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 באינקובטור.
4. פלסטי תא גדל שימוש הסוכן דה-methylating 5-העז-CR
- יום 0
- כן פתרון מניות של 5 עזה-CR ידי המסת 2.44 מ"ג של 5-עז-CR ב 10 מיליליטר של Medi גלוקוז DMEM הגבוהאממ. לעקר על ידי סינון. כן מניית 5-העז-CR מייד לפני השימוש.
- לדלל 1 μl של 5-עזה-CR פתרון המניות ב 1 מ"ל של מדיום תרבות פיברובלסטים (מיקרומטר 1 הריכוז הסופי).
- כדי להגדיל פלסטיות התא, 24 שעות לאחר ציפוי התא (משנה 3.8), להסיר בינוני תרבות מן פיברובלסטים זורעים ולהוסיף 1 מיקרומטר 5-עזה-CR פתרון המניות ותרבות במשך 18 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 באינקובטור.
- יום 1
- כן פלוריפוטנטיים אדם טרי (HP) בינוני כמתואר בטבלה 1.
- לאחר דגירה עם 1 מיקרומטר 5-עז-CR, להסיר בינוניים לשטוף תאים שלוש פעמים עם PBS על מנת להבטיח כי 5-עז-CR הוא שטף משם.
- דגירת fibroblasts מטופלים 5-עז-CR עם מדיום HP עבור 3 שעות (תקופת החלמה) על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2.
- לאחר תקופת ההחלמה, להסיר בינוני, לשטוף שלוש פעמים עם PBS.
- כדי לפקח על היעילות של טיפול 5-עזה-CR, לבדוק ב f שלב זהאו נוכחות של שינויים מורפולוגיים (כמפורט בסעיף תוצאות). תאים מאבדים את המורפולוגיה המוארכת הטיפוסית של פיברובלסטים ולרכוש עגול או צורת אליפסה, הופכים קטן יותר, עם גרעינים מוגדלים.
- המשך עם בידול הלבלב.
5. פרוטוקול בידול הלבלב
- ימים 1-6
- כן לבלב בסל בינוני כמתואר בטבלה 2.
- הכן Activin פתרון המניות: להמיס 5 מיקרוגרם של Activin חלבון אנושי רקומביננטי 166.6 μl של מים סטריליים.
- תרבות 5-עזה-CR מטופלים הפיברובלסטים 0.26 מ"ל / 2 ס"מ של הלבלב בסל בינוני, בתוספת 1 μl / מ"ל Activin פתרון המניות (ראה 5.1.2) במשך 6 ימים ב 37 מעלות צלזיוס חממה 5% CO 2. שינוי יומי בינוני.
- ימים 7-8
- הכן פתרון המניות החומצה הרטינואית ידי הוספת 16.6 מ"ל של sulfoxide דימתיל (DMSO) עד 50 מ"ג של ACI רטינואיתד.
- התרבות תאים ב 0.26 מ"ל / 2 ס"מ של הלבלב בסל בינוני בתוספת 1 μl / מ"ל Activin פתרון המניות (ראה 5.1.2) ו 1 μl / פתרון מניות החומצה הרטינואית מ"ל (ראה 5.2.1) עבור 2 ימים ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2. שינוי יומי בינוני.
- ימים 9-36
- התרבות תאים ב 0.26 מ"ל / 2 ס"מ של הלבלב בסל בינוני בתוספת 1% (v / v) אינסולין-transferrin-סלניום (ITS), 2% (v / v) B27 ו -0.1% (v / v) רקומביננטי אנושי FGF בסיסיים (bFGF) פתרון המניות (ראו טבלה 1) על 37 מעלות צלזיוס באינקובטור 5% CO 2. שינוי המדיום יומי במשך 15 הימים הראשונים.
- מהיום 16 ואילך, לרענן בינוני בכל יום אחר, תחת מיקרוסקופ, מאז ביצירת כדוריות המצרפי יכול לנתק מתחתית מנת התרבות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הקמת התרבות העיקרית ביופסיות עור
ביופסיות עור נחתכו שברים קטנים והניחו במנות ג'לטין מצופים מראש. לאחר 6 ימים, פיברובלסטים התחילו לצמוח מתוך שברי הרקמה ויצרו monolayer תא (איור 1 א). תאים הראו צורה מאורכת טיפוסית, כצפוי, הפגינו חיסונית-חיוביות אחידה vimentin הסמן הספציפי פיברובלסטים (Vim, איור 1B).
שינויים מורפולוגיים מתילציה דפוס של פיברובלסטים העור לאחר 18 שעות חשיפה 5-עזה-CR
כדי להשיג מרת אפיגנטיים מוצלחת של פיברובלסטים לתאי מפרישי אינסולין, הגדלנו הפלסטיות שלהם באמצעות סוכן דה-methylating, 5-עז-CR. פיברובלסטים אדם היו מצופים על מנות מצופות מראש ג'לטין 0.1% בריכוז של 7.8 x 10 4 פיברובלסטים / 2 סנטימטר. עשרים וארבע שעות לאחר זריעה, תאי were מודגרות עם 1 מיקרומטר 5-עזה-CR במשך 18 שעות.
בסוף הטיפול הזה, שינוי נרחב של פנוטיפ התא היה גלוי (פוסט 5-עזה-CR, איור 2 א). המורפולוגיה המוארכת הטיפוסית של פיברובלסטים מטופל (T0, איור 2 א), הוחלפה על ידי סיבוב או צורת אליפסה וגודל תא הפך נמוך באופן משמעותי. הציטופלסמה היה פרטני, בברוטליות, והתאים היו חסידים אל פני שטח התרבות. הגרעינים הופיעו גדולים vacuolated, כפועל יוצא של המבנה הכרומטין הרגוע. מניסיוננו, נוכחות של שינויים מורפולוגיים אלה הוא חיוני שחובה להיות במעקב צמוד כסמן את היעילות של טיפול 5-עזה-CR.
לאחר 18 שעות חשיפה 5-עזה-CR, ירידה חדה של מתילציה DNA העולמי ניכרה גם ו הודגם בבירור מעוצמת פחתה של immunostaining 5 methylcytidine ( שינויים מורפולוגיים ופונקציונליים במהלך ההמרה אפיגנטיים של העור פיברובלסטים לתאים מפרישי אינסולין במהלך השלב הראשון, התאים היו בתרבית למשך 7 ימים הלבלב בסל בינוני השלים עם Activin לקדם מחויבות האנדודרם. ברווח זה, תאים השטוחים נוסף והחל בהדרגה לארגן באשכולות (יום 7, איור 3 א). בהמשך לכך, בידול שושלת לבלב קודם עם התוספת של חומצה רטינואית עבור 2 ימים. בתגובה טיפול זה, התאים מחדש בדפוס רשתי, צמחה וגדלה אגרגטים התא להבחין בבירור (יום 10, איור 3 א). היווצרות אשכולות process גדל עם זמן היה מגורה עוד יותר על ידי השלב השלישי והאחרון, אשר כלל חשיפת תא B27, bFGF ו ITS. זה הוביל הגיוס של מספר גדל והולך של תאים מצטברים במושבות 3D גדולות (יום 20, איור 3 א). בסביבות היום 36, מושבות אלה הופיעו מבנים עגולים ברורים מזכירים איי לבלב טיפוסיים במבחנה (יום 36, איור 3 א). הרכישה של פנוטיפ EpiCC החדש לוותה עלייה הדרגתית של רמות המתילציה של הדנ"א העולמי שהחזירו לאלו שנצפו פיברובלסטים מטופל (5 יום mC 36 איור 3B). לאחר 36 ימים של אינדוקצית לבלב, את היעילות של המרת אפיגנטיים גם הודגמה על ידי הביטוי של סמני לבלב בוגרים טיפוסיים, אשר היו בלתי מורגשים במקור פיברובלסטים מטופל (T0, טבלה 1: פתרונות חומר. טבלה 2: פתרונות חומר.
כדי להשרות התמיינות הלבלב, פיברובלסטים מטופלים 5-עזה-CR נחשפו פרוטוקול שלושה שלבים לזירוז הלבלב, מיד לאחר תקופת ההחלמה 3 שעות. 
איור 1: בידוד ואפיון של פיברובלסטים עור אנושיים (א) תמונת נציג פיברובלסטים צמח מתוך שברי הרקמה.. (ב) Fibroblasts להציג חיסונית-חיוביות אחידה של שלהםvimentin סמן pecific (Vim). גרעיני מגואלות DAPI. (מוטות קנה מידה, 100 מיקרומטר). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. 
איור 2: מורפולוגי מתילציה שינויים של פיברובלסטים עור אנושיים לאחר 5-עז-CR טיפול (א) נציג תמונות של פיברובלסטים מטופל מראים צורה מאורכת (T0), ו -5-עזים-CR פיברובלסטים מטופלים מוצגים עגול או מורפולוגיה סגלגלה, מגורענת. הציטופלסמה, ו מוגדלים vacuolated גרעינים (פוסט 5-עזה-CR). (מוטות קנה מידה, 100 מיקרומטר). (ב) ירידה של מתילציה DNA העולמית ניתן לזהות לאחר טיפול 5-עז-CR (פוסט 5-עז-CR). (מוטות סולם, 50 מיקרומטר). אנא CLאיכס כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. 
איור 3:. שינויים מורפולוגיים ופונקציונליים במהלך ההמרה אפיגנטיים (א) תמונות נציג של שינויים מורפולוגיים המתרחשים במהלך התמיינות הלבלב האנדוקרינית. לאחר 7 ימים של אינדוקציה, תאים אנושיים לארגן בהדרגה באשכולות (יום 7). בתגובה תוספת של חומצה רטינואית, הם לסדר בתבנית רשתי ו מצרר אגרגטים להבחין (יום 10). מערכים אלה להתקדם עם הזמן, גיוס תאים וצבירה במושבות 3D גדול (יום 20). לבסוף, מושבות להפוך מבנים כדוריים כי נוטים לנתק לצוף בחופשיות במדיום התרבות, מזכיר איי לבלב טיפוסיים במבחנה (יום 36). (מוטות קנה מידה, 100 מיקרומטר). (ב) לאחר 36 ימים של הלבלבduction, רמות המתילציה של הדנ"א העולמית שיבת אדם EpiCC לאלו שנצפו פיברובלסטים מטופל (5 mC יום 36). (סרגל קנה מידה, 50 מיקרומטר). שיתוף לוקליזציה של PDX1 עם C-PEP ניתן לזהות בסוף תקופת ההמרה (יום 36), בעוד סמנים הלבלב האנדוקרינית אלה נעדרים לחלוטין פיברובלסטים מטופל (T0). (מוטות קנה מידה, 100 מיקרומטר). (C) EpiCC הפרשת אינסולין בתגובה 20 מ"מ D- גלוקוז ו -20 מ"מ חשיפה L-גלוקוז. ברים מייצגים את הממוצע ± סטיית התקן של שלושה משכפל עצמאי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. שם חומר / ציוד כמות (v / v) תגובות / תיאור מערבבים מזין F-10 של חם 40% DMEM גלוקוז נמוכה 40% נוק סרום החלפה 10% FBS 5% פתרון antimycotic אנטיביוטי 1% פתרון L-Glutamine 1% MEM שאינו חיוני פתרון חומצות אמינו 1% מניית 2-mercaptoethanol 1% 2-mercaptoethanol להכנת מלאי: diluite 3.5 μl של 2-mercaptoethanol ב 5 מ"ל של PBS סטרילית. יש לאחסן בחושך ב +4 מעלות צלזיוס. הערה: יש להשתמש תוך 2 שבועות מניות תמהיל nucleoside 1% nucleoside לערבב להכנת מלאי: להמיס 0.042 גרם guanosine, 0.040 אדנוזין g, 0.036 גרם Cytidine, 0.036 uridine גרם ו 0.012 גרם Timidine ב 50 מ"ל של מים סטריליים. ממיסים ב 50 מעלות צלזיוס לפרק. לעקר ידי filtratיון ולאחסן ב +4 מעלות צלזיוס ESGRO (LIF) 0.1% מניית אדם FGF בסיסית רקומביננטי (bFGF) 0.1% להכנה מלאה bFGF: להוסיף 5 מיליליטר של 0.1% שור הסרום אלבומין (BSA) PBS ב 25 מיקרוגרם של bFGF שם חומר / ציוד כמות (v / v) תגובות / תיאור DMEM / F-12 93% B-27 ויטמין מינוס 2% מוסף N-2 1% MEM שאינו חיוני פתרון חומצות אמינו 1% אַנטִיבִּיוֹטִיפתרון antimycotic 1% מניית 2-mercaptoethanol 1% 2-mercaptoethanol להכנת מלאי: diluite 3.5 μl של 2-mercaptoethanol ב 5 מ"ל של PBS סטרילית. יש לאחסן בחושך ב +4 מעלות צלזיוס. הערה: יש להשתמש תוך 2 שבועות פתרון L-Glutamine 1% מניית BSA 1% הכנת מלאי BSA: להמיס 250 מ"ג ב 50 מ"ל מים. לעקר על ידי סינון ולאחסן ב +4 מעלות צלזיוס.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כתב היד הנוכחי מתארת שיטה מאפשרת המרה של פיברובלסטים עור אנושיים לתוך תאים מייצרי אינסולין, באמצעות חשיפה חולפת וקצרה עד 5-עז-CR, ואחריו פרוטוקול אינדוקצית רקמות ספציפי. גישה זו מאפשרת מעבר מ mesoderm לתאים הקשורים endoderm, ללא ביטוי בכפייה של גורמי שעתוק או מיקרו-רנ"א ולא רכישת מדינה pluripotent יציבה, כי גורם לתאים יותר יציבים ונוטים טעויות 14.
בשלב הראשון, פלסטיות תא הוא גדלו בזכות צירוף סינטטי אפיגנטיים שגורם מדינת מתירנית חולפת, הפיכה בתאי בדיל סופנים. בפרט, 5-העז-CR שמש כדי לגרום לירידת מתילציה העולמי של תאי פיברובלסטים עור. 5-עזה-CR ידוע כמעכב ישירות פעילות מתיל-transferase ולמנוע דה נובו מתילציה בדנ"א מסונתז החדש. בגלל השפעתו, מולקולה זוכבר השתמש בעבר כדי להפעיל מחדש את הגנים שותקים, כמו גם לשנות את מדינות ההתמיינות של תאי איקריוטיים 15,16. בקנה אחד עם זו, לפרסם פיברובלסטים עור 5-עזים-CR הראו demethylation DNA העולמי (איור 2 א), מציין יכולת 5-עזה-CR להגדיל פלסטיות בתאים המשמשים הניסויים הנוכחיים. זהו גם הסכם עם התצפית כי 5-עז-CR מקל ביטוי של הסמן הגבוה הקשורה פלסטיות אוק-4 בתאי neurosphere (NSCs) 17. עם זאת, מעניין לציין כי fibroblasts העור פוסט 5-עזה-CR לחזור פנוטיפ המקורי שלהם לאחר הסרת 5-עזה-CR. ואכן, הראינו בעבר כי פיברובלסטים חזרו בינוני התרבות המקורית שלהם, למטה ביטוי מוסדר של הגורמים הקשורים pluripotency 9,10, המציין כי מדינת הפלסטיות הגבוהה רכש, בתגובה המשתנה 'אפיגנטיים, הוא חולף, הפיך ואינו כרוך שינויים קבועים של tהוא התאים.
שינויים מסומנים במורפולוגיה תא מלווים האינדוקציה של (איור 2 א) מדינת פלסטיות גבוהה. גופי התא מוארך הטיפוסיים של תאי פיברובלסטים המטופל הוחלפו עגול או תאים בצורת אליפסה שהציגו ממדים קטנים נפח גרעינים גדלו, אשר הופיעו גדול יותר מזה של תאים מובחנים. Niwa בקורלציה גדלה גרעינית זה למבנה הכרומטין רגוע תאר כתכונה הקשורה pluripotency 18. הנוכחות של גרעיני vacuolated ו הציטופלסמה פרטנית, וכן מורפולוגיה לשטח גדלה, ניכרה. כל השינויים המורפולוגיים המתוארים יכול לשמש כמעט כסמן סיומו המוצלח של החלק הראשון של פרוטוקול המרה; מניסיוננו כאשר השינויים נוכחים, 5-עזה-CR אכן סייע תאים לרכוש מדינה מתירנית יותר.
אפשר לנצל Permis גבוהה "חולף זההזמן-חלון sivity "לנהוג תאים כלפי פנוטיפ שונה לחלוטין. הפרוטוקול הנוכחי מדגים שהפוסט פיברובלסטים 5-העז-CR ניתן מחדש ממוען תאים דמויי תא בטא בלבלב, בתגובת מדיום בידול מסוים. הפרוטוקול המשמש לאפשר לתאים לעבור לסוג תא נגזר mesoderm לאוכלוסיית חוליה של שושלת האנדודרם.
אינסולין, שהיה בלתי ניתן לגילוי במקור פיברובלסטים עור מטופל, היה חיובי בסוף פרוטוקול הבידול (איור 3 ב). זו לוותה הביטוי בו הזמני של גורמים אחרים, כגון PDX1, המעורבים הבידול של השלם של הלבלב - אקסוקרינית שלה, האנדוקרינית, ו אוכלוסיות תאי ductal, ליד השושלת בטא תאים הספציפיים. זה עולה בקנה אחד עם מחקרים קודמים על תאי גזע עובריים בעכבר (ESC) המציין כי הבחנה נכונה לתוך תאי בטא הושגה רק כאשר תאים לא בוגרים התגבבו מיני וטיהורתאים r האנדוקרינית 19, דבר המצביע על כך סיפק מיקרו-הסביבה המקומית על ידי לבלב של אדריכלות לנגרהנס יש תפקיד פונקציונלי חזק.
ואכן, EpiCC מושגת פנוטיפ מובחן בוגר והראתה היכולת להגיב עד 20 מ"מ חשיפת גלוקוז (איור 3). אינסולין היה מופרש באופן פעיל במדיום תרבות לאחר 1 שעות של גירוי D- גלוקוז, המאשר את הטבע בתום לב של EpiCC כמו אלה מייצרי אינסולין (איור 3 ג).
דרישה ברורה עבור הליך מוצלח היא האחזקה הקפדנית של תאים ב 37 מעלות צלזיוס, בכלל הצעדים, כוללים הטיפול שלהם תחת הזרימה למינרית סטרילי המיקרוסקופ. מניסיוננו, זה גם מומלץ מאוד להכין ריאגנטים טרי, לפני השימוש בהם בתרבות לרענן בינוני אך ורק על פי הפרוטוקול. פעולה זו חייבת להתבצע תחת מיקרוסקופ מאז התאים ויוצרים המצרפייכול לנתק מתחתית מנת התרבות ואבד במהלך שינויים בינוניים.
פרוטוקול מרת אפיגנטיים גם יושם בהצלחה למין החזירי כמו גם לכלב (הגישה כתב יד), תוך שימוש באותו מספר תאים / 2 סנטימטר וריכוז סוכן דה-methylating תאר עבור בני אדם.
לסיכום, פרוטוקול המאפשר המרה של פיברובלסטים העור לתוך סוג תא אחר מוצג כאן. האסטרטגיה תארה יש את היתרונות של מרת תא epigenetically מבוססת: כלומר את האפשרות להימנע מדינת pluripotent כי הייתה אפשר להשאיר תאים מסוגלים לגרום לסרטן; החיסול של גורמים גנטיים אקסוגניים שיכול לגרום לשינויי התמהמהות התאים. יתרונות אלו הופכים את הגישה הנוכחית מאוד מבטיח עבור יישומים ברפואת translational ומאפשרים טיפול בתאי מטופל ספציפי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי קרן Carraresi והאירופי קרן לחקר הסוכרת (EFSD). GP הוא נתמך על ידי מענק פוסט-דוקטורט מאוניברסיטת מילאנו. הכותבים הם חברי פעולת COST FA1201 Epiconcept: סביבת אפיגנטיקה Periconception ואת פעולת COST BM1308 שיתוף מקדם על מודלים של בעלי חיים גדולים (סלאם). טאלב הוא חבר ביולוגית עלות פעולת CM1406 אפיגנטיים הכימי (EPICHEM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D5652 | PBS; for cell wash and solution preparation |
| Antibiotic Antimycotic Solution | Sigma | A5955 | Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media |
| 100 mm Petri dish | Sarstedt | 83.3902 | For Fibroblast isolation |
| Porcine Gelatin | Sigma | G1890 | For dish coating |
| Water | Sigma | W3500 | For solution preparation |
| 35 mm Petri dishes | Sarstedt | 83.39 | For Fibroblast isolation |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 41966052 | For Fibroblast culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10500064 | FBS; Component of Fibroblast and HP media |
| L-Glutamine solution | Sigma | G7513 | Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | For Fibroblast dissociation |
| KOVA GLASSTIC SLIDE 10 WITH GRIDS | Hycor Biomedical | 87144 | Cell counting |
| 5-Azacytidine | Sigma | A2385 | 5-aza-CR, for increrase cell plasticity in fibroblasts |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Life Technologies | 31550031 | For HP medium |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Life Technologies | 31885023 | For HP medium |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828028 | Component of HP medium |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Life Technologies | 11140035 | Component of HP and Pancreatic Basal media |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | Component of HP and Pancreatic Basal media |
| Guanosine | Sigma | G6264 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Adenosine | Sigma | A4036 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Cytidine | Sigma | C4654 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Uridine | Sigma | U3003 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Thymidine | Sigma | T1895 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Millex-GS 0,22 µm | Millipore | SLGS033SB | For sterilizing of solution |
| FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Life Technologies | PHG0261 | bFGF; Component of HP and Pancreatic Basal medium |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3311 | BSA; Component of Pancreatic Basal medium |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320074 | For Pancreatic Basal medium |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A | Life Technologies | 12587010 | Component of Pancreatic medium |
| N-2 Supplement | Life Technologies | 17502048 | Component of Pancreatic Basal medium |
| Activin A Recombinant Human Protein | Life Technologies | PHG9014 | For Pancreatic medium |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | For Pancreatic medium |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | DMSO; for Retinoic Acid stock preparation |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Life Technologies | 41400045 | ITS; for Pancreatic Final medium |
| Anti-Vimentin antibody | Abcam | ab8069 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100 |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma | 32670 | DAPI. For immunocytochemical analisys. Working dilution 1 µg/ml |
| 5-Methylcytidine | Eurogentec | MMS-900P-B | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500 |
| Anti-C Peptide antibody | Abcam | ab14181 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100 |
| Anti-PDX1 antibody | Abcam | ab47267 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500 |
| Mercodia Insulin ELISA | Mercodia | 10-1113-10 | For insulin release detection |
References
- Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., Melton, D. A. In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells. Nature. 455 (7213), 627-632 (2008).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 51 (6), 987-1000 (1987).
- Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
- Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476, 224-227 (2011).
- Huang, P., et al. Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors. Nature. 475, 386-389 (2011).
- Marro, S., et al. Direct Lineage Conversion of Terminally Differentiated Hepatocytes to Functional Neurons. Cell Stem Cell. 9 (4), 374-382 (2011).
- Pennarossa, G., et al. Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (22), 8948-8953 (2013).
- Pennarossa, G., et al. Reprogramming of Pig Dermal Fibroblast into Insulin Secreting Cells by a Brief Exposure to 5-aza-cytidine. Stem Cell Rev. 10 (1), 31-43 (2014).
- Brevini, T. A., et al. Morphological and Molecular Changes of Human Granulosa Cells Exposed to 5-Azacytidine and Addressed Toward Muscular Differentiation. Stem Cell Rev. 10 (5), 633-642 (2014).
- Thoma, E. C., et al. Chemical conversion of human fibroblasts into functional Schwann cells. Stem Cell Reports. 3 (4), 539-547 (2014).
- Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells. Cell J. 17 (1), 153-158 (2015).
- Plath, K., Lowry, W. E. Progress in understanding reprogramming to the induced pluripotent state. Nat Rev Genet. 12 (4), 253-265 (2011).
- Taylor, S. M., Jones, P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell. 17 (4), 771-779 (1979).
- Glover, T. W., Coyle-Morris, J., Pearce-Birge, L., Berger, C., Gemmill, R. M. DNA demethylation induced by 5-azacytidine does not affect fragile X expression. Am J Hum Genet. 38 (3), 309-318 (1986).
- Do, J. T., Scholer, H. R. Nuclei of embryonic stem cells reprogram somatic cells. Stem Cells. 22 (6), 941-949 (2004).
- Niwa, H. How is pluripotency determined and maintained? Development. 134 (4), 635-646 (2007).
- Kahan, B. W., et al. Pancreatic precursors and differentiated islet cell types from murine embryonic stem cells: an in vitro model to study islet differentiation. Diabetes. 52 (8), 2016-2024 (2003).
