Introduction
再生医療の基本的な目的は、修理または損傷置き換えるために使用することができる新しい機能細胞の生成は、組織を縮退します。別の細胞型からそれらを変換することによって、新しいものに容易に利用可能な成体細胞をリメイク、必要な細胞集団が豊富なまたはアクセスすることは困難ではない場合は特に、特に魅力的なアプローチです。しかし、成体細胞が著しく安定しています。彼らは成熟した端末専門に達すると、彼らは安定して1を保持し 、そのオプションの緩やかな制限を介して自分の分化状態を取得します。
体細胞（IPS）の多能性への再プログラミングを可能にするプロトコルの数が開発されている最後の年では、転写のセットは2,3因子の強制発現によって達成。あるいは、細胞の変換は、単一の4を導入し 、直接系列分化転換することによって得ることができます、5-7因子 。この戦略は、脱分化状態を経て移行を伴うが、特定の転写因子8の高発現を必要としません。
我々は最近、シチジン類似体5-アザシチジン（5-アザCR）、よく特徴付けられたDNAメチル化酵素阻害剤の脱メチル化特性に成体細胞の短時間の暴露に基づいて、変換プロトコルを開発しました。脱メチル化工程は、直ちに必要な端末の表現型を得ることを可能にする特異的な分化プロトコール9-11が続きます。この方法は、異なる系統の細胞への成熟、分化した細胞に変換することができ、ウイルスベクターを使用すると、任意の外因性の転写因子のトランスフェクションの両方を避けるために実質的な利点を有しています。セルの不安定性への安定した多能性状態の取得、及び関連する感受性の増加も避けられます。
9-13ならびに犬で使用されています。
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Protocol
注：以下で説明するすべての手順は、無菌条件下で層流フードの下で実行する必要があります。その取り扱いを通して37℃に維持されているすべての培養手順は、サーモスタット制御ステージと細胞上で行われていることを確認します。
1.皮膚線維芽細胞の単離
- 文化ディッシュ用塗布液を調製
- 水（最終濃度0.1％）100mlにブタゼラチンを0.1gを溶解させます。オートクレーブで溶液を滅菌します。
- 35ミリメートルペトリ皿に無菌0.1％ブタゼラチンの1.5ミリリットルを追加します。室温でそれらを維持し、コートに2時間待ちます。
注：ヒト皮膚生検は、前腕の前面の無血管領域に局所麻酔下で切除することによって回収し、使用前に+4℃で2％抗生物質抗真菌溶液を補充したダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に格納されています。
- 新しいPBSで洗浄生検は2％antibiを補っ耳の抗真菌ソリューション。
- 場所の100ミリメートルペトリ皿の中の生検とは、滅菌メスで約2mm 3の断片に切断します。
- 断片をメッキする直前に塗布液の過剰分を削除します。
- プレコート35ミリメートルペトリ皿に5-6皮膚の断片を配置します。
- 線維芽細胞培養培地を調製：77％ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、高グルコース、20％ウシ胎児血清（FBS）、1％L-グルタミン溶液、2％抗生物質抗真菌溶液。
- 5％CO 2中で37℃で各フラグメント（断片あたり通常100μl）を、文化、それらの上に繊維芽細胞培地の液滴を追加します。
- 24時間後、5％CO 2中37℃で湿ったそれらを保つために断片上で線維芽細胞培養培地500μlを追加します。
- 少なくとも一度は48時間ごとにピペットで培地を変更します。
- インキュベーションの6日後、慎重に組織片を除去し、それらを捨てます。
注：6日後、線維芽細胞sが組織片から成長し、細胞単層を形成するために開始することを開始します。 - 培地を更新し、線維芽細胞培養培地2mlを追加し、5％CO 2インキュベーター中、37℃で細胞単層培養を続けます。
2.線維芽細胞培養
- 37℃での培養線維芽細胞を5％CO 2中で80％コンフルエントになるまで
- 継代のために組織培養皿から吸引線維芽細胞培養培地。 4mlのPBSで細胞を3回洗浄し、1％抗生物質抗真菌ソリューションを補いました。
- トリプシン-EDTA溶液の薄い層（培地体積の10％）（0.8グラム/ Lのブタトリプシンとは0.2g / L EDTA）を添加し、細胞単層は、組織の下から分離し始めるまで37℃でインキュベート培養皿、細胞を解離します。
- トリプシンの作用を中和するために線維芽細胞培養培地の9部を、細胞懸濁液を希釈します。遠心分離は必要ありません。
- 新しい培養皿でプレート細胞（と5％CO 2インキュベーター内で37℃でゼラチンアウト）と文化。成長率に応じて、4：2と1：1の間の通路比を保持します。
- 細胞は約80％のコンフルエンス、通路それら（通常は週2回）に達したとき。
エピジェネティックな変換のための3線維芽めっき
- 細胞培養皿に（1.1で説明したように準備し）0.26ミリリットル/ 0.1％のブタゼラチンのcm 2で追加します。コートに2時間待ちます。
- 線維芽細胞をプレーティングする前に塗布液の過剰10月30日分を削除してください。
- 培養皿から線維芽細胞培養培地を除去します。 PBSで細胞を3回洗浄し、1％抗生物質抗真菌ソリューションを補いました。
- トリプシン-EDTA溶液の薄い層（培地体積の10％）（0.8グラム/ Lのブタトリプシンとは0.2g / L EDTA）を添加し、細胞単層は、組織の下から分離し始めるまで37℃でインキュベート培養皿、細胞を解離します。
- fibroblの9部で細胞懸濁液を希釈トリプシンの作用を中和するAST培地。
- 室温で顕微鏡下で計数チャンバーを用いて細胞を数えます。 7.8×10 4個の線維芽細胞/ cm 2の細胞濃度を得るために、細胞を再懸濁するために線維芽細胞培養培地の必要量を計算します。これは、使用室の特定のタイプに依存します。
細胞/μlの=小グリッド×90（増倍率）×希釈あたりの細胞の平均数 - 室温で5分間150グラムで遠心し細胞懸濁液。上清を除去し、線維芽細胞培養培地の以前に計算された量で細胞を懸濁します。
- 0.1％ゼラチンプレコートディッシュ、5％CO 2インキュベーター中で37℃で24時間培養して上プレート細胞。
脱メチル化剤5-アザCRを使用して4.増加細胞の可塑性
- 0日目
- DMEM高グルコースメディ10ml中5-アザCRの2.44ミリグラムを溶解させることによって、5-アザ - CRストック溶液を調製しますええと。濾過により滅菌します。使用直前に5アザ-CRの株式を準備します。
- 線維芽細胞培地（最終濃度1μM）1ml中、5-アザ - CRストック溶液1μlを希釈します。
- 、細胞プレーティング（小見出し3.8）24時間後の細胞の可塑性を高めるために、播種された線維芽細胞から培地を除去し、5％CO 2インキュベーター内で37℃で18時間、1μM5-アザCR原液と文化を追加します。
- 1日目
- 表1に記載されているように、新鮮なヒト多能性（HP）培地を準備します。
- 1μM5-アザCRとのインキュベーション後、培地を除去し、5-アザCRが洗い流されることを保証するために、PBSで細胞を3回洗浄します。
- 5-アザCR 5％CO 2中で37℃で3時間（回復期間）は、HP培地で線維芽細胞を処理した培養します。
- 回復期間の後、培地除去し、PBSで3回洗浄します。
- 5-アザCR処理の効率を監視するには、このステップfで確認または形態学的変化の存在は、（結果セクションで詳述します）。細胞は、線維芽細胞の典型的な細長い形態を失い、拡大核と、サイズが小さくなって、円形または楕円形の形状を取得します。
- 膵臓分化に進みます。
5.膵臓分化プロトコル
- 日1-6
- 表2に記載されているように膵臓基礎培地を準備します。
- 原液をアクチビン準備：滅菌水の166.6μlの組換えヒトタンパク質をアクチビン5μgのを溶解します。
- 文化5は、アザ- CR 5％CO 2インキュベーター中、37℃で6日間（5.1.2を参照）1μL/ mlのアクチビン原液を補充し、0.26ミリリットル/ cmの膵臓基礎培地の2に線維芽細胞を処理しました。毎日培地に変更します。
- 日7-8
- レチノインACIの50 mgのジメチルスルホキシド（DMSO）16.6 mlで添加することによって、レチノイン酸のストック溶液を調製D。
- 膵臓基礎培地の0.26ミリリットル/ cm 2の中の培養細胞/ mlのアクチビン原液（5.1.2を参照）、37℃で2日間、1μL/ mlのレチノイン酸原液（5.2.1を参照）1μlの補足しました5％のCO 2。毎日培地に変更します。
- 日9-36
- 膵臓基礎培地0.26ミリリットル/ cm 2の中の培養細胞（v / v）のインスリン-トランスフェリン-セレン（ITS）、2％（v / v）のB27および0.1％（v / v）の組換えヒトFGFは、基本1％を補充しました5％CO 2インキュベーター中、37℃で（のbFGF）原液（ 表1参照）。最初の15日間、毎日培地を変更します。
- 以降16日目からは、培養皿の底から切り離すことが集計セルを形成するので、顕微鏡下で、一日おきに培地を更新します。
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Representative Results
皮膚生検からの初代培養の確立
皮膚生検を小片に切断し、ゼラチンプレコート皿に入れました。 6日後、線維芽細胞は組織断片から成長し始め、細胞単層（ 図1A）を形成しました。細胞は、典型的な細長い形状を示したと、期待どおりに、線維芽細胞特異的マーカーであるビメンチン（Vimの、 図1B）のために均一な免疫陽性を示しました。
5-アザ-CRに18時間曝露後の形態学的変化および皮膚線維芽細胞のメチル化パターン
インスリン分泌細胞への線維芽細胞の正常なエピジェネティックな変換を得るために、我々は、5-アザCR、脱メチル化剤を使用して、可塑性を増加させました。ヒト線維芽細胞は、7.8×10 4線維芽細胞/ cm 2の濃度で0.1％ゼラチンを予めコートディッシュ上にプレーティングしました。ワット、細胞を播種した後二十四時間ERE 18時間1μmの5-アザCRと共にインキュベートしました。
この処理の終了時に、細胞表現型の大規模な変化が（ポスト5-アザCR、 図2A）見えました。未処理の線維芽細胞（T0、 図2A）の典型的な細長い形態は、円形または楕円形で置き換え、細胞サイズがかなり小さくなりました。細胞質は、粒状であった平坦化、及び細胞が培養表面に付着しました。核は大きく登場し、リラックスしたクロマチン構造の結果として、空胞。我々の経験では、これらの形態学的変化の存在が不可欠であり、慎重に5-アザCR処理の効率のマーカーとして監視されなければなりません。
5-アザ-CRに18時間曝露した後、グローバルなDNAメチル化の急激な減少も明らかであり、明らかに（5-メチルシチジン免疫染色の減少強度によって実証されました インスリン分泌細胞への皮膚線維芽細胞のエピジェネティックな変換時の形態学的および機能的変化 最初のステップの間、細胞は、内胚葉のコミットメントを促進するために、アクチビンAで補充膵臓基本培地で7日間培養しました。この区間では、細胞をさらに平坦化し、徐々にクラスター（7日目、 図3A）に整理し始めました。その後、膵臓系列分化は、2日間のレチノイン酸の添加によって促進されました。この処理に応答して、細胞は、格子状に再配置し、明確に識別可能な細胞凝集物（10日目、 図3A）で成長しました。クラスター形成のprocessは時間とともに増加し、さらにB27、bFGFおよびITSへの細胞の曝露から成っ第三段階、によって刺激されました。これは、大規模な3Dコロニーに凝集細胞の増加（20日目、 図3A）の動員につながりました。 36日目の周り、これらのコロニーは、インビトロでの典型的な膵島（36日目、 図3A）を連想させるとして、明確な丸い構造が登場しました。 新しいEpiCC表現型の獲得は、未処理線維芽細胞（5 mCと36日目図3B）で観察されたものに戻ったグローバルなDNAメチル化レベルの緩やかな増加を伴っていました。 膵臓誘導の36日後、エピジェネティックな変換の効率も未処理の線維芽細胞に本来検出されなかった典型的な成熟膵臓マーカーの発現、（T0によって実証されました、 表1：材料ソリューションを提供しています。 表2：材料ソリューションを提供しています。
膵臓の分化を誘導するために、5-アザCR処理した線維芽細胞を直ちに3時間の回復期間の後、膵臓の誘導のための3ステッププロトコルに暴露しました。 
図1：組織片から成長している線維芽細胞のヒト皮膚線維芽細胞の単離とキャラクタリゼーション （A）代表画像。 （B）線維芽細胞は、それらのための均一な免疫陽性を表示しますpecificマーカービメンチン（Vimの）。核はDAPIで染色されています。 （スケールバーは100μm）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 
図2：5-アザCR処理後のヒト皮膚線維芽細胞の形態学およびメチル化の変化細長い形状を示す未処理の線維芽細胞の（A）代表的な画像（T0）、および5-アザ- CRは、円形または楕円形の形態を表示する線維芽細胞を処理し、粒状。細胞質、および拡大して空胞核（ポスト5-アザCR）。 （スケールバーは100μm）。 （B）は、グローバルなDNAメチル化の減少は、5-アザCR処理後（ポスト5-アザCR）検出可能です。 （スケールバーは50μm）。 をクリアしてくださいこの図の拡大版を表示するには、こちらICK。 
図 3： エピジェネティックな変換中の形態学的および機能的変化 （A）内分泌膵臓分化の間に起こる形態学的変化の代表的な写真。誘導の7日後、ヒト細胞が徐々にクラスター（7日目）に整理します。レチノイン酸の添加に応答して、彼らは区別可能な骨材（10日目）で格子状とクラスタ内で再配置します。これらの形成は、細胞を動員し、大規模な3Dコロニー（20日目）に集約し、時間とともに進行します。最後に、コロニーを切り離し、in vitroでの典型的な膵島（36日目）を彷彿とさせる培地に自由に浮遊する傾向がある球状の構造になります。 （スケールバーは100μm）。 （B）膵臓中の36日後ductionは、人間EpiCCのグローバルなDNAメチル化レベルは、未処理の線維芽細胞（5 mCと36日目）で観察されたものに戻ります。 （スケールバーは50μm）。これらの内分泌膵臓のマーカーは、未処理の線維芽細胞（T0）に完全に存在しない一方で、C-PEPとPDX1の共局在は、変換期間（36日目）の終わりに検出可能です。 （スケールバーは100μm）。 20mMのD-グルコースおよび20mMのL-グルコースの曝露に応答した（C）EpiCCインスリン放出。バーは、3つの独立した反復試験の平均±SDを示す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 マテリアル/機器の名前 量（v / v）の コメント/説明 ハムF-10栄養ミックス 40％ DMEM低グルコース 40％ ノックアウト血清代替 10％ FBS 5％ 抗生物質抗真菌ソリューション 1％ L-グルタミン溶液 1％ MEM非必須アミノ酸溶液 1％ 2-メルカプトエタノールの株式 1％ 2-メルカプトエタノールの原料調製：滅菌PBS 5ml中の2-メルカプトエタノールのdiluite 3.5μlの。 4℃の暗所で保管してください。注：2週間以内に使用します ヌクレオシドミックスストック 1％ ヌクレオシドミックス原料調製：0.042グラムグアノシン、0.040グラムのアデノシン、0.036グラムのシチジン、0.036グラムのウリジン、滅菌水50ml中の0.012グラムのTimidineを溶解します。溶解するために50℃で融解します。 filtratによって滅菌します4℃でのイオンと店舗 ESGRO（LIF） 0.1％ 組換えヒトFGF基本（のbFGF）株式 0.1％ bFGFのストック準備：bFGFの25μgのでPBS中の0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）の5ミリリットルを追加します。 マテリアル/機器の名前 量（v / v）の コメント/説明 DMEM / F-12 93％ B-27サプリメントマイナスビタミンA 2％ N-2サプリメント 1％ MEM非必須アミノ酸溶液 1％ 抗生物質抗真菌ソリューション 1％ 2-メルカプトエタノールの株式 1％ 2-メルカプトエタノールの原料調製：滅菌PBS 5ml中の2-メルカプトエタノールのdiluite 3.5μlの。 4℃の暗所で保管してください。注：2週間以内に使用します L-グルタミン溶液 1％ BSAストック 1％ BSAストックの調製：50mlの水に250mgのを溶かします。 4℃でろ過し、ストアによって滅菌します。
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Discussion
本原稿は、組織特異的な誘導プロトコールに続いて5-アザCR、過渡および短時間の曝露を介して、インスリン産生細胞へのヒト皮膚線維芽細胞の変換を可能にする方法を説明します。このアプローチは、転写因子またはマイクロRNAの強制発現や細胞がより不安定とミス14になりやすいなり安定した多能性状態の取得、なし、中胚葉から内胚葉関連細胞への切り替えを可能にします。
第1のステップでは、細胞の可塑性は、最終分化細胞に一過性、可逆的な寛容状態を誘導する合成エピジェネティックな修飾子のおかげで増加します。具体的には、5-アザCRは、皮膚線維芽細胞の全体的なメチル化の減少を引き起こすために使用されました。 5-アザCR直接メチルトランスフェラーゼ活性を阻害し、新たに合成されたDNAに新規メチル化を防ぐことが知られています。理由は、その効果の、この分子以前にサイレント遺伝子を再活性化するだけでなく、真核細胞15,16の分化状態を変更するために使用されています。これと一致して、ポスト5アザ- CRの皮膚線維芽細胞は、本実験に用いられる細胞内で可塑性を増加させる5-アザCR能力を示す、グローバルDNA脱メチル化（ 図2A）を示しました。これは、5-アザCRは、神経球細胞（NSCの）17で高可塑性関連マーカーOct-4の発現を促進するという観察と一致してもです。しかし、そのポスト5-アザCRの皮膚線維芽細胞は、5-アザCRを除去した後、元の表現型に戻す興味深いです。確かに、私たちは以前より高い可塑性の状態を取得したことを示す、線維芽細胞は、多能性関連因子9,10の調節された発現ダウン、元の培養培地に戻されていることを実証し、エピジェネティックな修飾子に応じて、可逆的、一過性であり、関与しませんトンの恒久的な修正彼は細胞。
細胞形態のマークの変更は、より高い可塑性状態（ 図2A）の誘導を伴います。未処理の線維芽細胞の典型的な細長い細胞体は、分化した細胞のそれよりも大きく現れた小さな寸法の増大、核の容積を提示円形又は楕円形の細胞で置換しました。丹羽は、多能性関連機能18として記載リラックスしたクロマチン構造に、この核の拡大を相関していました。空胞化、核や顆粒状細胞質だけでなく、増加した平坦化形態の存在は、明らかでした。記載された全ての形態学的変化は、実質的に、変換プロトコルの最初の部分が正常に完了するためのマーカーとして使用することができます。変更が存在している私たちの経験では、5-アザCRは確かにもっと寛容な状態を取得するための細胞を支援してきました。
この過渡的「高PERMISを活用することが可能です完全に異なる表現型に向かってセルを駆動するsivityタイムウィンドウ」。本プロトコルは、ポスト5-アザCR線維芽細胞は、特定の分化培地に応答して、膵臓のβ細胞様細胞に再アドレスすることができることを示している。使用されるプロトコル細胞は内胚葉系統に属する細胞集団に中胚葉由来の細胞型から切り替えることができます。
未処理の皮膚線維芽細胞にもともと検出不可能であったインスリンは、分化プロトコル（ 図3B）の終わりに陽性でした。その外分泌、内分泌、及び管細胞集団、特定のベータ - 細胞系列の横に - これは、膵臓全体の分化に関与PDX1のような他の因子の同時発現を伴っていました。これは、ベータ細胞への適切な分化が未熟細胞は、パーソナルプラグインで積層した場合にのみ達成されたことを示す、マウス胚性幹細胞に関する以前の仕事（ESC）と一致していますランゲルハンスアーキテクチャの膵島により提供局所微小環境は、強力な機能的役割を有することが示唆R内分泌細胞19。
実際、EpiCCは成熟分化した表現型を達成し、20 mMのグルコース曝露（ 図3）に応答する能力を示しました。インスリンは、積極的にインスリン産生のもの（ 図3C）としてEpiCCの真正性を確認し、D-グルコース刺激の1時間後に培養培地中に分泌されました。
成功の手順のための明確な要件は、無菌層流および顕微鏡下での処理を含むすべての工程にて、37℃で細胞を厳密に維持することです。我々の経験では、また非常に培養前におけるそれらの使用、新鮮に試薬を準備するために、プロトコルに応じて厳密に培地を更新することをお勧めします。この操作は、成形集約細胞ので、顕微鏡下で実施しなければなりません培養皿の底から切り離し、培地交換の際に失われることがあります。
エピジェネティックな変換プロトコルは、正常ヒトについて記載したものと同一の細胞数/ cm 2で脱メチル化剤の濃度を用いて、ブタの種、並びにイヌ（原稿提出）に適用されています。
結論として、他の細胞型への皮膚線維芽細胞の変換を可能にするプロトコルがここに提示されています。説明の戦略は、エピジェネティックベースのセル変換の利点があります：がんを引き起こすことができる細胞の後ろに残すことができる多能性状態を回避するために、すなわち可能性を。細胞内での余韻の変化を引き起こす可能性が外因性の遺伝的要因の排除。これらの利点は、翻訳医学アプリケーションのための本発明のアプローチは非常に有望にし、患者の特定の細胞治療を可能にします。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。
Acknowledgments
この作品は、Carraresi財団と欧州糖尿病財団（EFSD）によって賄われていました。 GPは、ミラノの大学のポスドクフェローシップによってサポートされています。著者は、COSTアクションFA1201 Epiconceptのメンバーである：エピジェネティクスとPericonception環境とコストのアクションBM1308共有は大型動物モデル（サラーム）に進みます。 TALBはCOSTアクションCM1406エピジェネティックなケミカルバイオロジー（EPICHEM）のメンバーです。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D5652 | PBS; for cell wash and solution preparation |
| Antibiotic Antimycotic Solution | Sigma | A5955 | Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media |
| 100 mm Petri dish | Sarstedt | 83.3902 | For Fibroblast isolation |
| Porcine Gelatin | Sigma | G1890 | For dish coating |
| Water | Sigma | W3500 | For solution preparation |
| 35 mm Petri dishes | Sarstedt | 83.39 | For Fibroblast isolation |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 41966052 | For Fibroblast culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10500064 | FBS; Component of Fibroblast and HP media |
| L-Glutamine solution | Sigma | G7513 | Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | For Fibroblast dissociation |
| KOVA GLASSTIC SLIDE 10 WITH GRIDS | Hycor Biomedical | 87144 | Cell counting |
| 5-Azacytidine | Sigma | A2385 | 5-aza-CR, for increrase cell plasticity in fibroblasts |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Life Technologies | 31550031 | For HP medium |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Life Technologies | 31885023 | For HP medium |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828028 | Component of HP medium |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Life Technologies | 11140035 | Component of HP and Pancreatic Basal media |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | Component of HP and Pancreatic Basal media |
| Guanosine | Sigma | G6264 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Adenosine | Sigma | A4036 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Cytidine | Sigma | C4654 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Uridine | Sigma | U3003 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Thymidine | Sigma | T1895 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Millex-GS 0,22 µm | Millipore | SLGS033SB | For sterilizing of solution |
| FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Life Technologies | PHG0261 | bFGF; Component of HP and Pancreatic Basal medium |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3311 | BSA; Component of Pancreatic Basal medium |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320074 | For Pancreatic Basal medium |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A | Life Technologies | 12587010 | Component of Pancreatic medium |
| N-2 Supplement | Life Technologies | 17502048 | Component of Pancreatic Basal medium |
| Activin A Recombinant Human Protein | Life Technologies | PHG9014 | For Pancreatic medium |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | For Pancreatic medium |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | DMSO; for Retinoic Acid stock preparation |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Life Technologies | 41400045 | ITS; for Pancreatic Final medium |
| Anti-Vimentin antibody | Abcam | ab8069 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100 |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma | 32670 | DAPI. For immunocytochemical analisys. Working dilution 1 µg/ml |
| 5-Methylcytidine | Eurogentec | MMS-900P-B | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500 |
| Anti-C Peptide antibody | Abcam | ab14181 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100 |
| Anti-PDX1 antibody | Abcam | ab47267 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500 |
| Mercodia Insulin ELISA | Mercodia | 10-1113-10 | For insulin release detection |
References
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