Introduction
Ein grundlegendes Ziel der regenerativen Medizin ist die Erzeugung von neuen, funktionsfähigen Zellen, die verwendet werden können, zu reparieren oder zu ersetzen beschädigte, entartete Gewebe. leicht verfügbar adulte Zellen in neue remaking, indem sie aus einem Zelltyp in einen anderen umzuwandeln, ist ein besonders attraktiver Ansatz, insbesondere, wenn die erforderliche Zellpopulation Zugang nicht reichlich oder schwierig ist. Allerdings sind adulte Zellen bemerkenswert stabil. Sie erhalten ihre differenzierten Zustand durch eine schrittweise Einschränkung ihrer Möglichkeiten und, sobald sie die reifen Terminal Spezialisierung erreichen, sie es stabil 1 behalten.
In den letzten Jahren haben eine Reihe von Protokollen entwickelt worden, dass die Umprogrammierung zu Pluripotenz einer somatischen Zelle (iPS) ermöglichen erreicht durch die erzwungene Expression einer ganzen Reihe von Transkriptionsfaktoren 2,3. Alternativ kann die Zellumwandlung durch direkte Abstammungslinie transdifferentiation erhalten werden, eine einzige 4 Einführung 5-7. Diese Strategie geht es nicht um den Übergang durch eine de-differenzierten Zustand , sondern erfordert eine hohe Expression des spezifischen Transkriptionsfaktoren 8.
Wir haben kürzlich eine Umwandlungsprotokoll, das auf der kurzen Belichtungs adulter Zellen zu den demethylating Eigenschaften des Cytidinanalogon 5-Azacytidin (5-Aza-CR), einem gut charakterisierten DNA-Methyltransferase-Inhibitor entwickelt. Die Demethylierung Schritt wird sofort durch eine spezifische Differenzierungsprotokoll 9-11 gefolgt, die die erforderliche terminalen Phänotyp zu erhalten ermöglicht. Dieses Verfahren ist in der Lage reife, differenzierte Zellen in Zellen einer anderen Abstammung zu konvertieren und hat den wesentlichen Vorteil, sowohl die Verwendung von viralen Vektoren und die Transfektion einer exogenen Transkriptionsfaktoren zu vermeiden. Der Erwerb eines stabilen pluripotenten Zustand, und die damit verbundene erhöhte Anfälligkeit Instabilität der Zelle wird ebenfalls vermieden.
9-13 sowie in dem Hund (Manuskript eingereicht) was auf eine breite Wirksamkeit und Robustheit des Ansatzes verwendet.
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Protocol
Hinweis: Alle nachfolgend beschriebenen Verfahren müssen unter sterilen Bedingungen unter Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden. Stellen Sie sicher, dass alle Kulturverfahren durchgeführt werden, auf thermostatgesteuerten Bühnen und die Zellen werden bei 37 ° C während ihrer Handhabung beibehalten.
1. Haut Fibroblast Isolation
- Bereiten Kulturschale Beschichtungslösung
- Man löst 0,1 g Schweine-Gelatine in 100 ml Wasser (Endkonzentration 0,1%). Sterilisieren Lösung mit Autoklaven.
- 1,5 ml steriler 0,1% Schweinegelatine bis 35 mm Petrischalen. Warten 2 h zu beschichten, so dass sie bei Raumtemperatur gehalten.
Hinweis: Menschliche Hautbiopsien erhoben werden durch Exzision unter örtlicher Betäubung von einem avaskulären Bereich der anterioren Seite des Unterarms und gespeichert in Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), ergänzt mit 2% Antibiotikum, Antimykotikum-Lösung bei +4 ° C vor der Verwendung.
- Wash Biopsien mit neuen PBS mit 2% antibi ergänztotic Antimykotika-Lösung.
- Platz Biopsien in einer 100 mm Petrischale und Schnitt in etwa 2 mm 3 Fragmente mit sterilem Skalpelle.
- Entfernen Sie die Beschichtungslösung Überschuss unmittelbar vor der Fragmente Plattierung.
- Platzieren 5-6 Hautfragmente in die vorbeschichteten 35 mm Petrischale.
- Bereiten Fibroblastenkulturmedium: 77% Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit hohem Glucose, 20% Fetal Bovine Serum (FBS), 1% L-Glutamin-Lösung und 2% Antibiotikum, Antimykotikum-Lösung.
- Hinzufügen , um ein Tröpfchen von Fibroblastenmedium über jedem Fragment (üblicherweise 100 & mgr; l pro Fragment) und Kultur sie bei 37 ° C in 5% CO 2.
- Nach 24 Stunden wurden 500 & mgr; l von Fibroblasten - Kulturmedium über die Fragmente fügen Sie sie in 5% CO 2 bei 37 ° C feucht zu halten.
- Ändern Sie das Medium mit einer Pipette mindestens einmal alle 48 Stunden.
- Nach 6 Tagen Inkubation vorsichtig entfernen Gewebefragmente und sie verwerfen.
Hinweis: Nach 6 Tagen Fibroblastens beginnen aus den Gewebefragmenten zu wachsen und beginnen, eine Zellschicht zu bilden. - Aktualisieren Medium, 2 ml Fibroblasten - Kulturmedium und weiterhin Zellschicht Kultur bei 37 ° C in 5% CO 2 Inkubator.
2. Fibroblast Kultur
- Kultur Fibroblasten bei 37 ° C in 5% CO 2 , bis 80% Konfluenz
- Für Passagierung absaugen Fibroblasten-Kulturmedium aus Gewebekulturschalen. Wasche die Zellen dreimal mit 4 ml PBS, ergänzt mit 1% Antibiotika-Antimykotika-Lösung.
- Hinzufügen, um eine dünne Schicht (10% des Kulturmediums Volumen) von Trypsin-EDTA-Lösung (0,5 g / L Schweine Trypsin und 0,2 g / L EDTA) und inkubiere bei 37 ° C bis zur Zellmonoschicht von der Unterseite des Gewebes zu lösen beginnt, Kulturschale und Zellen distanzieren.
- Verdünnte Zellsuspension mit 9 Teilen Fibroblastenkulturmedium Trypsin Wirkung neutralisieren. Zentrifugation nicht notwendig ist.
- Platten-Zellen in neue Kulturschalen (mitaus Gelatine) und die Kultur bei 37 ° C in 5% CO 2 -Inkubator. Halten Sie das Durchtrittsverhältnis zwischen 1: 2 und 1: 4, je nach Wachstumsrate.
- Wenn die Zellen erreichen rund 80% Konfluenz Passage sie (in der Regel zweimal pro Woche).
3. Fibroblast Plating für epigenetische Conversion
- In 0,26 ml / cm 2 von 0,1% Schweinegelatine (herzustellen , wie in 1.1 beschrieben) auf Zellkulturschalen. Warten Sie 2 Stunden zu beschichten.
- Entfernen Sie die Beschichtungslösung Überschuss 10-30 min vor der Fibroblasten Plattierung.
- Entfernen Fibroblasten-Kulturmedium aus den Kulturschalen. Wasche die Zellen dreimal mit PBS, supplementiert mit 1% Antibiotika-Antimykotika-Lösung.
- Hinzufügen, um eine dünne Schicht (10% des Kulturmediums Volumen) von Trypsin-EDTA-Lösung (0,5 g / L Schweine Trypsin und 0,2 g / L EDTA) und inkubiere bei 37 ° C bis zur Zellmonoschicht von der Unterseite des Gewebes zu lösen beginnt, Kulturschale und Zellen distanzieren.
- Verdünnte Zellsuspension mit 9 Teilen fibroblast Kulturmedium Trypsin Aktion zu neutralisieren.
- Zählen von Zellen unter Verwendung einer Zählkammer unter einem Mikroskop bei Raumtemperatur. Berechnen des erforderlichen Volumens von Fibroblastenkulturmedium Zellen zu resuspendieren, eine Zellkonzentration von 7,8 x 10 4 Fibroblasten / cm 2 zu erhalten. Dies hängt von der speziellen Art der Kammer verwendet wird.
Die Zellen / ul = Durchschnittliche Anzahl der Zellen pro kleines Gitter x 90 (Multiplikationsfaktor) x Verdünnung - Zentrifuge Zellsuspension bei 150 g für 5 min bei Raumtemperatur. Überstand entfernen und resuspendieren Zellen mit dem vorher errechneten Volumen der Fibroblasten-Kulturmedium.
- Platten Zellen auf 0,1% Gelatine vorbeschichtet Geschirr und Kultur sie für 24 Stunden bei 37 ° C in 5% CO 2 -Inkubator.
4. Erhöhung der Zellplastizität Mit dem De-Methylierungsmittel 5-Aza-CR
- Tag 0
- Bereiten Sie 5-Aza-CR-Stammlösung von 2,44 mg 5-Aza-CR Auflösen in 10 ml DMEM mit hohem Glucose mediÄh. Sterilisieren durch Filtration. Bereiten Sie 5-Aza-CR Lager unmittelbar vor der Verwendung.
- Verdünne 1 ul von 5-Aza-CR-Stammlösung in 1 ml Fibroblasten-Kulturmedium (Endkonzentration 1 uM).
- Um Zellplastizität erhöhen, 24 Stunden nach der Zellschichten (Hierher 3.8), zu entfernen Kulturmedium aus ausgesät Fibroblasten und fügen 1 & mgr; M 5-Aza-CR - Stammlösung und Kultur für 18 Stunden bei 37 ° C in 5% CO 2 Inkubator.
- Tag 1
- Bereiten frischen humanen pluripotenten (HP) Medium , wie in Tabelle 1 beschrieben.
- Nach Inkubation mit 1 & mgr; M 5-Aza-CR, entfernen Medium und wasche die Zellen dreimal mit PBS, um sicherzustellen, dass 5-aza-CR abgespült wird.
- Inkubiere 5-Aza-CR behandelten Fibroblasten mit HP Medium für 3 Stunden (Erholungsphase) bei 37 ° C in 5% CO 2.
- Nach der Erholungsphase, entfernen Medium, waschen dreimal mit PBS.
- Um die Effizienz der 5-Aza-CR Behandlung zu überwachen, überprüfen Sie in diesem Schritt foder das Vorhandensein von morphologischen Veränderungen (detaillierter in Abschnitt Ergebnisse). Die Zellen verlieren die typische längliche Morphologie von Fibroblasten und eine runde oder ovale Form zu erwerben, in der Größe kleiner zu werden, mit vergrößerten Kernen.
- Fahren Sie mit Pankreas-Differenzierung.
5. Pancreatic Differenzierung Protokoll
- Tage 1-6
- Bereiten Pancreatic Basal Medium , wie in Tabelle 2 beschrieben.
- Bereiten Sie eine Vorrats-Lösung Activin: Man löst 5 ug eines rekombinanten humanen Protein in 166,6 ul sterilem Wasser Activin.
- Kultur 5-Aza-CR - Fibroblasten in 0,26 ml / cm 2 von Bauchspeicheldrüsen Basal Medium, ergänzt mit 1 & mgr; l / ml Activin A - Stammlösung (siehe 5.1.2) für 6 Tage bei 37 ° C in 5% CO 2 Inkubator behandelt. Ändern Medium täglich.
- Tage 7-8
- Bereiten Retinsäure Stammlösung durch Zugabe von 16,6 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) zu 50 mg Retinoesäure acid.
- Kulturzellen in 0,26 ml / cm 2 von Pancreatic Basal - Medium , ergänzt mit 1 & mgr; l / ml Activin A - Stammlösung (siehe 5.1.2) und 1 ul / ml Retinsäure - Stammlösung (siehe 5.2.1) für 2 Tage bei 37 ° C in 5% CO 2. Ändern Medium täglich.
- Tage 9-36
- Kulturzellen in 0,26 ml / cm 2 von Pancreatic Basal - Medium , ergänzt mit 1% (v / v) Insulin-Transferrin- Selen (ITS), 2% (v / v) B27 und 0,1% (v / v) Recombinant Human FGF Grund (bFGF) Stammlösung (siehe Tabelle 1) bei 37 ° C in 5% CO 2 Inkubator. Ändern Sie das Medium täglich für die ersten 15 Tage.
- Vom 16. Tag an, aktualisieren Sie jeden zweiten Tag Medium, unter einem Mikroskop, da aggregierte Zellen bilden vom Boden der Kulturschale lösen kann.
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Representative Results
Gründung der Primärkultur aus Hautbiopsien
Hautbiopsien wurden in kleine Fragmente geschnitten und platziert in Gelatine vorbeschichtet Gerichte. Nach 6 Tagen begann Fibroblasten aus den Gewebefragmenten und bildeten eine Zellschicht (1A) zu wachsen. Zellen zeigten eine typische längliche Form und, wie erwartet, eine einheitliche immun Positivität für den Fibroblasten - spezifischen Marker Vimentin (Vim, 1B) angezeigt.
Morphologische Veränderungen und Methylierungsmuster von Fibroblasten der Haut nach 18 Stunden Exposition gegenüber 5-Aza-CR
Um eine erfolgreiche epigenetische Umwandlung von Fibroblasten in Insulin-sezernierenden Zellen zu erhalten, erhöht man die Plastizität unter Verwendung der de-Methylierungsmittel, 5-aza-CR. Humane Fibroblasten wurden plattiert auf 0,1% Gelatine vorbeschichtet Geschirr in einer Konzentration von 7,8 x 10 4 Fibroblasten / cm 2. Vierundzwanzig Stunden nach dem Aussäen Zellen were 18 Stunden mit 1 & mgr; m 5-Aza-CR inkubiert.
Am Ende dieser Behandlung wird eine umfassende Änderung des Zellphänotyps sichtbar war (Post 5-Aza-CR, 2A). Die typische längliche Morphologie von unbehandeltem Fibroblasten (T0, 2A) wurde durch ein rundes ersetzt oder ovale Form und Zellgröße wurde deutlich kleiner. Cytoplasma war körnig, abgeflacht, und die Zellen wurden Anhänger der Kulturoberfläche. Nuclei erschien größer und Vakuolen, als Folge der entspannten Chromatinstruktur. Nach unserer Erfahrung ist die Anwesenheit dieser morphologischen Veränderungen wesentlich und müssen sorgfältig als Marker für die Wirksamkeit von 5-Aza-CR Behandlung überwacht werden.
Nach 18 Stunden Exposition gegenüber 5-Aza-CR, war ein starker Rückgang der globalen DNA-Methylierung auch offensichtlich und wurde eindeutig durch die verminderte Intensität von 5-methylcytidine Immunfärbung nachgewiesen werden ( Morphologische und funktionelle Veränderungen bei der epigenetischen Umwandlung von Fibroblasten der Haut in Insulin absondernden Zellen Im ersten Schritt wurden die Zellen für 7 Tage in Pancreatic Basal Medium mit Activin A ergänzt Endoderm Engagement fördern. In diesem Intervall abgeflachten Zellen weiter und allmählich in Cluster (Tag 7, 3A) zu organisieren. Anschließend wurde Bauchspeicheldrüsen lineage Differenzierung durch Zugabe von Retinsäure für 2 Tage gefördert. In Reaktion auf diese Behandlung in einer netzartigen Muster umgeordnet Zellen und wuchsen in deutlich unterscheidbare Zellaggregate (Tag 10, 3A). Die Clusterbildung process stieg mit der Zeit und wurde weiter durch den dritten und letzten Schritt stimuliert, was zu B27 von Zell Exposition bestand, bFGF und ITS. Dies führte zur Einstellung von einer wachsenden Zahl von Zellen , die in großen 3D - Kolonien (Tag 20, 3A) aggregiert. Um Tag 36, erschienen diese Kolonien im Unterschied runde Gebilde erinnert an typische Pankreasinseln in vitro (Tag 36, 3A). Der Erwerb des neuen EpiCC Phänotyp wurde durch eine allmähliche Steigerung der globalen DNA - Methylierungs - Ebenen begleitet, die mit denen in unbehandelten Fibroblasten beobachtet zurück (5 mC Tag 36 3B). Nach 36 Tagen von Bauchspeicheldrüseninduktions wurde die Effizienz der epigenetischen Umwandlung auch durch die Expression von typischen reife Pankreas-Marker gezeigt, die in unbehandelten Fibroblasten ursprünglich nicht nachweisbar waren (T0, Tabelle 1: Materiallösungen. Tabelle 2: Materiallösungen.
Zur Induktion wurden Pankreasdifferenzierung, 5-Aza-CR behandelten Fibroblasten zu einer für Pankreas-Induktion Drei-Stufen-Protokoll ausgesetzt, unmittelbar nach der 3 Stunden Erholungszeit. 
Abbildung 1: Isolierung und Charakterisierung von menschlichen Hautfibroblasten (A) repräsentative Bild von Fibroblasten aus den Gewebefragmenten wachsen.. (B) Fibroblasten zeigen eine einheitliche immun Positivität für ihre specific Marker Vimentin (VIM). Nuclei sind mit DAPI gefärbt. (Maßstabsbalken, 100 & mgr; m). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 
Figur 2: Morphologische und Methylierungsänderungen von menschlichen Haut - Fibroblasten nach 5-aza-CR - Behandlung (A) Repräsentative Bilder von unbehandeltem Fibroblasten zeigt längliche Form (T0) und 5-Aza-CR behandelten Fibroblasten eine runde oder ovale Morphologie anzeigt, granuliert. Zytoplasma und vergrößerte und vakuolisiert Kerne (Beitrag 5-Aza-CR). (Maßstabsbalken, 100 & mgr; m). (B) Eine Verringerung der globalen DNA - Methylierung ist nachweisbar nach 5-Aza-CR - Behandlung (Beitrag 5-Aza-CR). (Maßstabsbalken, 50 & mgr; m). Bitte click hier eine größere Version dieser Figur zu sehen. 
Abbildung 3:. Morphologische und funktionelle Veränderungen bei der epigenetischen Umwandlung (A) Repräsentative Bilder der morphologischen Veränderungen , die sich während des endokrinen Pankreas Differenzierung nehmen. Nach 7 Tagen Induktion, organisieren menschlichen Zellen nach und nach in Clustern (Tag 7). In Reaktion auf die Zugabe von Retinsäure, ordnen sie in einer retikulären Muster und Cluster in unterscheidbare Aggregate (Tag 10). Diese Formationen Fortschritt mit der Zeit, die Einstellung von Zellen und Aggregation in großen 3D-Kolonien (Tag 20). Schließlich werden Kolonien kugelförmige Strukturen , die frei in dem Kulturmedium, erinnert an typische pankreatischen Inseln in vitro (Tag 36) zu lösen und Aufschwimmen neigen. (Maßstabsbalken, 100 & mgr; m). (B) Nach 36 Tagen des Pankreas inProduktion, globale DNA-Methylierung Ebenen der menschlichen EpiCC Rückkehr zu den in unbehandelten Fibroblasten beobachtet (5 mC Tag 36). (Maßstabsbalken, 50 & mgr; m). Co-Lokalisation von PDX1 mit C-PEP ist am Ende des Umstellungszeitraums (Tag 36) nachweisbar, während diese endokrinen Pankreas-Marker in unbehandelten Fibroblasten vollständig fehlen (T0). (Maßstabsbalken, 100 & mgr; m). (C) EpiCC Insulinfreisetzung als Reaktion auf 20 mM D-Glucose und 20 mM L-Glucose - Exposition. Die Balken stellen den Mittelwert ± SD von drei unabhängigen Replikaten. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Name des Materials / Ausrüstung Menge (v / v) Kommentare / Beschreibung Hams F-10 Nährstoff-Mix 40% DMEM niedrige Glukose 40% KnockOut Serum Ersatz 10% FBS 5% Antibiotika-Antimykotika-Lösung 1% L-Glutamin-Lösung 1% MEM Nicht-essentielle Aminosäuren Lösung 1% 2-Mercaptoethanol Lager 1% 2-Mercaptoethanol Stoffaufbereitung: diluite 3,5 ul 2-Mercaptoethanol in 5 ml sterilem PBS. Shop in Dunkeln bei 4 ° C. Hinweis: Verwenden Sie innerhalb von 2 Wochen Nukleosid-Mix Lager 1% Nukleosid-Stoffaufbereitungs- mischen: Man löst 0,042 g Guanosin, 0,040 g Adenosine, 0,036 g Cytidin, 0,036 g Uridin und 0,012 g Timidine in 50 ml sterilem Wasser. Schmilzt bei 50 ° C aufzulösen. Sterilisieren von FiltratIon und lagern bei 4 ° C Esgro (LIF) 0,1% Recombinant Human FGF basic (bFGF) stock 0,1% bFGF Stoffaufbereitung: 5 ml 0,1% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS bei 25 ug bFGF Name des Materials / Ausrüstung Menge (v / v) Kommentare / Beschreibung DMEM / F-12 93% B-27 Supplement Minus Vitamin A 2% N-2 Supplement 1% MEM Nicht-essentielle Aminosäuren Lösung 1% AntibiotikumAntimykotika-Lösung 1% 2-Mercaptoethanol Lager 1% 2-Mercaptoethanol Stoffaufbereitung: diluite 3,5 ul 2-Mercaptoethanol in 5 ml sterilem PBS. Shop in Dunkeln bei 4 ° C. Hinweis: Verwenden Sie innerhalb von 2 Wochen L-Glutamin-Lösung 1% BSA-Stamm 1% Herstellung von BSA-Lager: 250 mg in 50 ml Wasser auflösen. Sterilisieren durch Filtration und lagern bei 4 ° C.
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Discussion
Die vorliegende Manuskript beschreibt ein Verfahren, das die Umwandlung von Fibroblasten der menschlichen Haut in Insulin-produzierende Zellen, durch eine transiente und kurze Exposition gegenüber 5-Aza-CR, gefolgt von einem gewebespezifischen Induktionsprotokoll ermöglicht. Dieser Ansatz ermöglicht einen Wechsel von Mesoderm Endoderm verwandten Zellen, ohne die erzwungene Expression von Transkriptionsfaktoren oder microRNAs noch den Erwerb eines stabilen pluripotenten Zustand, die 14 Zellen mehr instabil und anfällig für Fehler macht.
Im ersten Schritt wird der Zellplastizität erhöht dank eines synthetischen epigenetische Modifizierer, in terminal differenzierten Zellen eine vorübergehende, reversible permissive Zustand induziert. Insbesondere wurde 5-Aza-CR verwendet, um eine Verringerung der globalen Methylierung von Hautfibroblastenzellen zu verursachen. 5-Aza-CR ist bekannt , direkt Methyl-Transferase - Aktivität zu hemmen und de novo - Methylierung in neu synthetisierte DNA zu verhindern. Wegen seiner Wirkung, dieses Molekülzuvor verwendet silent Gene zu aktivieren, sowie die Differenzierungszuständen von eukaryotischen Zellen 15,16 modifizieren ist. Übereinstimmend damit Beitrag 5-aza-CR Hautfibroblasten zeigte eine globale DNA Demethylierung (2A), was anzeigt , 5-Aza-CR Fähigkeit Plastizität in den Zellen für die vorliegenden Experimente verwendet zu erhöhen. Dies ist auch in Übereinstimmung mit der Beobachtung , dass 5-Aza-CR Ausdruck der hohen Plastizität in Verbindung stehenden Markers Oct-4 in Neurosphere Zellen (NSCs) 17 erleichtert. Allerdings ist es interessant, dass Post 5-Aza-CR Fibroblasten der Haut kehren auf ihre ursprünglichen Phänotyp nach der Entfernung von 5-Aza-CR zu beachten. Tatsächlich wir bereits gezeigt , dass Fibroblasten in ihre ursprüngliche Kulturmedium zurückgeführt , nach unten regulierten Expression der Pluripotenz bezogenen Faktoren 9,10, was darauf hinweist , dass die höhere Plastizität Zustand erfasst, in Reaktion auf die epigenetische Modifizierungsmittel ist, transient, reversible und nicht verwickeln permanente Modifikationen von ter Zellen.
Deutliche Veränderungen in der Zellmorphologie begleitet die Induktion einer höheren Plastizität Zustand (2A). Die typischen länglichen Zellkörper der unbehandelten Fibroblasten-Zellen wurde durch rund oder oval geformte Zellen ersetzt, die kleinere Abmessungen und eine erhöhte Kerne Volumen vorgelegt, die als größere zeigte sich, daß von differenzierten Zellen. Niwa korreliert diese Kern Erweiterung zu einem entspannten Chromatinstruktur beschrieben als Pluripotenz bezogenes Merkmal 18. Die Anwesenheit von vakuolisierten Kerne und Zytoplasma körnige sowie eine erhöhte Flatten Morphologie waren evident. Alle morphologischen Veränderungen beschrieben sind, können praktisch als Marker für den erfolgreichen Abschluss des ersten Teils des Umwandlungs Protokoll verwendet werden; in unserer Erfahrung, wenn die Änderungen vorhanden sind, 5-Aza-CR hat in der Tat Zellen dazu verholfen, ein toleranter Staat zu erwerben.
Es ist möglich, die Vorteile dieser transient "hohe permis zu nehmensivity Zeitfenster ", um Zellen zu einem völlig anderen Phänotyp treiben. Die vorliegende Protokoll zeigt, dass die Pfosten 5-Aza-CR Fibroblasten können pankreatischen Beta-Zell-ähnlichen Zellen erneut adressiert werden, in Reaktion auf eine spezifische Differenzierungsmedium. Das verwendete Protokoll erlauben Zellen aus einem Mesoderm abgeleiteten Zelltyp zu einer Zellpopulation zu wechseln Zugehörigkeit zur endoderm Linie.
Insulin, das ursprünglich nicht nachweisbar in unbehandelter Haut - Fibroblasten war, war positiv am Ende des Differenzierungsprotokoll (3B). Dies wurde durch die gleichzeitige Expression von anderen Faktoren, wie PDX1 begleitet, in der Differenzierung des gesamten Pankreas beteiligt - seine exokrinen, endokrine und duktale Zellpopulationen, neben der spezifischen beta-Zelllinie. Dies steht im Einklang mit früheren Arbeiten an embryonalen Stammzellen der Maus (ESC), das anzeigt, dass eine geeignete Differenzierung in beta-Zellen erreicht wurde, nur, wenn unreife Zellen mit othe geschichtet wurdenr endokrinen Zellen 19, was darauf hindeutet , dass die lokale Mikroumgebung zur Verfügung gestellt von der pankreatischen Langerhans'schen Insel Architektur eine starke funktionelle Rolle hat.
Tatsächlich erreicht EpiCC ein reifes differenzierten Phänotyp und zeigte die Fähigkeit, 20 mM Glucose - Exposition (3) zu reagieren. Insulin wurde aktiv in das Kulturmedium sezerniert nach 1 Stunde von D-Glucose - Stimulation, was bestätigt , die bona fide Natur EpiCC als insulinproduzierenden Einsen (3C).
Eine deutliche Anforderung für ein erfolgreiches Verfahren ist die strenge Aufrechterhaltung der Zellen bei 37 ° C, bei allen Schritten, einschließlich ihrer Handhabung unter sterilen laminaren Strömung und das Mikroskop. Nach unserer Erfahrung ist es auch empfehlenswert Reagenzien frisch herzustellen, vor ihrer Verwendung in der Kultur und Medium streng zu aktualisieren entsprechend dem Protokoll. Dieser Vorgang muss, da die Form aggregierte Zellen unter einem Mikroskop durchgeführt werdenkann von dem Boden der Kulturschale abzulösen und während der Medienwechsel verloren.
Die epigenetische Umwandlung Protokoll wurde auch als auch für den Hund (Manuskript eingereicht), mit der gleichen Anzahl von Zellen / cm 2 und de-Methylierungsmittel - Konzentration beschrieben für den Menschen zu Schweinen erfolgreich angewendet worden.
Abschließend ein Protokoll, das die Umwandlung von Hautfibroblasten in einen anderen Zelltyp ermöglicht wird hier vorgestellt. Die Strategie beschrieben hat die Vorteile einer epigenetisch-basierten Zelle Umwandlung: nämlich die Möglichkeit, einen pluripotenten Zustand zu vermeiden, die hinter Zellen in der Lage, Krebs zu verursachen verlassen könnten; die Eliminierung von exogenem genetischen Faktoren, die verweilenden Veränderungen in den Zellen verursachen. Diese Vorteile machen die vorliegende Ansatz sehr vielversprechend für die translationale Medizin-Anwendungen und ermöglicht eine patientenspezifische Zelltherapie.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von Carraresi Stiftung und Europäische Stiftung für die Erforschung von Diabetes (EFSD) gefördert. GP wird von einem Post-Doc-Stipendium der Universität von Mailand unterstützt. Die Autoren sind Mitglieder der COST-Aktion FA1201 Epiconcept: Epigenetik und Periconception Umwelt und die COST Aktion BM1308 Freigabe Fortschritte auf Großtiermodellen (SALAAM). TALB ist Mitglied der COST Action CM1406 Epigenetische Chemical Biology (Epichem).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D5652 | PBS; for cell wash and solution preparation |
| Antibiotic Antimycotic Solution | Sigma | A5955 | Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media |
| 100 mm Petri dish | Sarstedt | 83.3902 | For Fibroblast isolation |
| Porcine Gelatin | Sigma | G1890 | For dish coating |
| Water | Sigma | W3500 | For solution preparation |
| 35 mm Petri dishes | Sarstedt | 83.39 | For Fibroblast isolation |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 41966052 | For Fibroblast culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10500064 | FBS; Component of Fibroblast and HP media |
| L-Glutamine solution | Sigma | G7513 | Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | For Fibroblast dissociation |
| KOVA GLASSTIC SLIDE 10 WITH GRIDS | Hycor Biomedical | 87144 | Cell counting |
| 5-Azacytidine | Sigma | A2385 | 5-aza-CR, for increrase cell plasticity in fibroblasts |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Life Technologies | 31550031 | For HP medium |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Life Technologies | 31885023 | For HP medium |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828028 | Component of HP medium |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Life Technologies | 11140035 | Component of HP and Pancreatic Basal media |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | Component of HP and Pancreatic Basal media |
| Guanosine | Sigma | G6264 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Adenosine | Sigma | A4036 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Cytidine | Sigma | C4654 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Uridine | Sigma | U3003 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Thymidine | Sigma | T1895 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Millex-GS 0,22 µm | Millipore | SLGS033SB | For sterilizing of solution |
| FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Life Technologies | PHG0261 | bFGF; Component of HP and Pancreatic Basal medium |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3311 | BSA; Component of Pancreatic Basal medium |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320074 | For Pancreatic Basal medium |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A | Life Technologies | 12587010 | Component of Pancreatic medium |
| N-2 Supplement | Life Technologies | 17502048 | Component of Pancreatic Basal medium |
| Activin A Recombinant Human Protein | Life Technologies | PHG9014 | For Pancreatic medium |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | For Pancreatic medium |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | DMSO; for Retinoic Acid stock preparation |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Life Technologies | 41400045 | ITS; for Pancreatic Final medium |
| Anti-Vimentin antibody | Abcam | ab8069 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100 |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma | 32670 | DAPI. For immunocytochemical analisys. Working dilution 1 µg/ml |
| 5-Methylcytidine | Eurogentec | MMS-900P-B | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500 |
| Anti-C Peptide antibody | Abcam | ab14181 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100 |
| Anti-PDX1 antibody | Abcam | ab47267 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500 |
| Mercodia Insulin ELISA | Mercodia | 10-1113-10 | For insulin release detection |
References
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