Introduction
Ett grundläggande mål för regenerativ medicin är generering av nya, funktionella celler som kan användas för att reparera eller ersätta skadad, urartade vävnader. Omarbeta lätt tillgängliga vuxna celler in i nya, genom att omvandla dem från en celltyp till en annan, är ett särskilt tilltalande tillvägagångssätt, speciellt när den erforderliga cellpopulationen inte är rikligt förekommande eller svåra att komma åt. Emellertid vuxna celler är anmärkningsvärt stabila. De får sin differentierat tillstånd genom en gradvis begränsning i deras alternativ och när de når mogen terminal specialisering, de stabilt behålla det en.
Under de senaste åren har ett antal protokoll har utvecklats, som gör det möjligt för omprogrammering till pluripotens av en somatisk cell (iPS) uppnås genom tvångs uttryck för en uppsättning av transkriptionsfaktorer 2,3. Alternativt kan cell omvandlingen erhållas genom direkt härstamning transdifferentiering, att införa en enda 4 5-7. Denna strategi innebär inte övergången genom en de-differentierade tillstånd men kräver hög expression av specifika transkriptionsfaktorer 8.
Vi har nyligen utvecklat en omvandlingsprotokoll baserat på kortvarig exponering av vuxna celler till demetylering egenskaperna för cytidin-analog 5-azacytidin (5-aza-CR), en välkarakteriserad DNA-metyltransferas-inhibitor. Den demetylering steg följs omedelbart av en specifik differentiering protokoll 9-11 som gör det möjligt att erhålla den erforderliga terminal fenotypen. Denna metod är i stånd att omvandla mogna, differentierade celler i celler av en annan härstamning och har den väsentliga fördelen att undvika både användningen av virala vektorer och transfektion av eventuella exogena transkriptionsfaktorer. Förvärvet av en stabil pluripotent tillstånd och relaterade ökad mottaglighet för cell instabilitet undviks också.
9-13 liksom hos hund (manuskript inlämnat) tyder på en bred effekt och robusthet av tillvägagångssättet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Notera: Alla förfaranden som beskrivs nedan måste utföras under laminärt flöde huva under sterila förhållanden. Se till att alla kulturprocedurer utförs på termostatreglerade stadier och cellerna hölls vid 37 ° C under hela sin hantering.
1. Skin Fibroblast Isolering
- Förbereda Culture Dish bestrykningslösning
- Lös upp 0,1 g av porcint gelatin i 100 ml vatten (slutkoncentration 0,1%). Sterilisera lösningen med autoklav.
- Tillsätt 1,5 ml steril 0,1% svin gelatin till 35 mm petriskålar. Vänta två timmar för att belägga, behålla dem vid rumstemperatur.
Notera: Mänskliga hudbiopsier uppsamlas genom excision under lokalbedövning från ett avaskulärt område av den främre aspekten av underarmen och lagras i Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (PBS) kompletterad med 2% antibiotikum antimykotisk lösning vid 4 ° C före användning.
- Tvätta biopsier med ny PBS kompletterat med 2% antibiotisk antimykotisk lösning.
- Placera biopsier i en 100 mm petriskål och skär i ca 2 mm 3 fragment med sterila skalpeller.
- Ta bestrykningslösningen överskottet omedelbart före plätering fragment.
- Placera 5-6 skalfragment i pre-belagda 35 mm petriskål.
- Förbereda fibroblast-odlingsmedium: 77% Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) med hög glukoshalt, 20% fetalt bovint serum (FBS), 1% L-glutamin-lösning och 2% antibiotikum antimykotisk lösning.
- Lägga en droppe av fibroblast mediet över varje fragment (vanligtvis 100 | j, l per fragment) och kultur dem vid 37 ° C i 5% CO2.
- Efter 24 h, tillsätt 500 | il av fibroblast-odlingsmedium över fragmenten för att hålla dem våt vid 37 ° C i 5% CO2.
- Ändra mediet med en pipett minst en gång per 48 timmar.
- Efter 6 dagars inkubation, ta bort vävnadsfragment noggrant och kasta dem.
Obs: Efter 6 dagar, fibroblasts börjar växa ut ur vävnadsfragment och börja bilda en cell monolager. - Uppdatera medium, tillsätt 2 ml av fibroblast-odlingsmedium och fortsätta cellmonoskiktet odling vid 37 ° C i 5% CO2 inkubator.
2. Fibroblast Kultur
- Kultur fibroblaster vid 37 ° C i 5% CO2 tills 80% konfluens
- För passage, aspirera fibroblast odlingsmedium från vävnadsodlingsskålar. Tvätta cellerna tre gånger med 4 ml PBS kompletterad med 1% antibiotisk antimykotisk lösning.
- Lägga ett tunt lager (10% av odlingsmediet volym) av trypsin-EDTA-lösning (0,5 g / L porcint trypsin och 0,2 g / L EDTA) och inkubera vid 37 ° C tills cellmonoskiktet börjar att lossna från botten av vävnaden odlingsskål och celler avstånd.
- Späd cellsuspensionen med 9 delar fibroblast odlingsmedium för att neutralisera trypsin åtgärder. Centrifugering är inte nödvändigt.
- Plate celler i nya odlingsskålar (medut gelatin) och kulturen vid 37 ° C i 5% CO2 inkubator. Hålla passagen förhållandet mellan 1: 2 och 1: 4, beroende på tillväxthastighet.
- När cellerna når omkring 80% sammanflödet, passage dem (vanligtvis två gånger per vecka).
3. Fibroblast Plätering för Epigenetisk Conversion
- Lägg 0,26 ml / cm2 0,1% svin gelatin (förbereda enligt beskrivningen i 1.1) till cellodlingsskålar. Vänta två timmar att belägga.
- Ta bestrykningslösningen överskott 10-30 min före plätering fibroblaster.
- Ta bort fibroblaster odlingsmedium från odlingsskålar. Tvätta cellerna tre gånger med PBS kompletterad med 1% antibiotika antimykotika lösning.
- Lägga ett tunt lager (10% av odlingsmediet volym) av trypsin-EDTA-lösning (0,5 g / L porcint trypsin och 0,2 g / L EDTA) och inkubera vid 37 ° C tills cellmonoskiktet börjar att lossna från botten av vävnaden odlingsskål och celler avstånd.
- Späd cellsuspensionen med 9 delar fibroblast odlingsmedium för att neutralisera trypsin åtgärder.
- Räkna celler med användning av en räkningskammare under ett mikroskop vid rumstemperatur. Beräkna den erforderliga volymen av fibroblast-odlingsmedium för att resuspendera cellerna, för att erhålla en cellkoncentration av 7,8 x 10 4 fibroblaster / cm 2. Detta kommer att bero på den specifika typ av kammare som används.
Celler / l = Genomsnittligt antal cell per litet rutnät x 90 (multiplikationsfaktor) x utspädning - Centrifugera cellsuspensionen vid 150 g under 5 min vid rumstemperatur. Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna med den tidigare beräknade volymen av fibroblast odlingsmedium.
- Platt celler på 0,1% gelatin förbelagda rätter och kultur dem under 24 h vid 37 ° C i 5% CO2 inkubator.
4. Öka Cell Plasticity Använda De-metylering Agent 5-aza-CR
- dag 0
- Framställa 5-aza-CR förrådslösning genom att lösa upp 2,44 mg av 5-aza-CR i 10 ml DMEM med hög glukoshalt medium. Sterilisera genom filtrering. Förbered 5-aza-CR lager omedelbart före användning.
- Späd 1 l av 5-aza-CR stamlösning i 1 ml av fibroblast-odlingsmedium (slutkoncentration 1 | iM).
- Att öka cell plasticitet, 24 h efter cell plätering (underrubrik 3,8), ta bort odlingsmedium från sådda fibroblaster och tillsätt 1 | iM 5-aza-CR-stamlösning och kultur för 18 h vid 37 ° C i 5% CO2 inkubator.
- Dag 1
- Framställ färsk human pluripotent (HP) medium som beskrivits i Tabell 1.
- Efter inkubation med 1 ^ M 5-aza-CR, avlägsna mediet och tvätta cellerna tre gånger med PBS för att säkerställa att 5-aza-CR sköljs bort.
- Inkubera 5-aza-CR behandlade fibroblaster med HP-medium under 3 h (återhämtningsperiod) vid 37 ° C i 5% CO2.
- Efter återhämtningsperioden, ta bort medium, tvätta tre gånger med PBS.
- Att övervaka effektiviteten av 5-aza-CR behandling, kontrollera i detta steg feller närvaron av morfologiska förändringar (som beskrivs i avsnittet Resultat). Celler förlorar typiska långsträckta morfologi av fibroblaster och skaffa en rund eller oval form, blir mindre i storlek, med förstorade kärnor.
- Fortsätt med pankreas differentiering.
5. Pancreatic Differentiering Protocol
- dagar 1-6
- Förbereda Pancreatic Basal Medium, såsom beskrivs i Tabell 2.
- Förbered Aktivin A stamlösning: Lös 5 mikrogram av Aktivin A rekombinant humant protein i 166.6 il sterilt vatten.
- Kultur 5-aza-CR behandlade fibroblaster i 0,26 ml / cm 2 av bukspottkörtel Basal Medium, kompletterat med 1 | j, l / ml aktivin A stamlösning (se 5.1.2) under 6 dagar vid 37 ° C i 5% CO2 inkubator. Ändra mediet dagligen.
- dag 7-8
- Förbereda retinsyra stamlösning genom att tillsätta 16,6 ml dimetylsulfoxid (DMSO) till 50 mg av vitamin A-acid.
- Kulturceller i 0,26 ml / cm 2 av bukspottkörtel Basal Medium kompletterat med 1 | j, l / ml aktivin En stamlösning (se 5.1.2) och 1 pl / ml retinsyra stamlösning (se 5.2.1) under 2 dagar vid 37 ° C i 5% CO2. Ändra mediet dagligen.
- dagarna 9-36
- Kulturceller i 0,26 ml / cm 2 av Pancreatic Basal Medium kompletterat med 1% (vol / vol) Insulin-Transferrin-Selenium (ITS), 2% (vol / vol) B27 och 0,1% (vol / vol) Recombinant Human FGF basic (bFGF) stamlösning (se tabell 1) vid 37 ° C i 5% CO2 inkubator. Ändra mediet dagligen under de första 15 dagarna.
- Från dag 16 och framåt, uppdatera medel varannan dag, under ett mikroskop, eftersom bilda aggregerade celler kan lossna från botten av odlingsskålen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etablering av primära kultur från hudbiopsier
Hudbiopsier skars i små fragment och placerades i gelatin förbelagda rätter. Efter 6 dagar, fibroblaster började växa ut ur vävnadsfragment och bildade en cell monolager (Figur 1A). Celler visade en typisk långsträckt form och, som väntat, uppvisade en enhetlig immun-positivitet för fibroblast specifik markör vimentin (Vim, Figur 1B).
Morfologiska förändringar och metylering mönster av hudfibroblaster efter 18 h exponering för 5-aza-CR
För att få en lyckad epigenetisk omvandling av fibroblaster i insulinfrisättande cellerna, ökade vi deras plasticitet med hjälp av de-metyleringsmedel, 5-aza-CR. Humana fibroblaster ströks ut på 0,1% gelatin förbelagd skålar vid en koncentration av 7,8 x 10 4 fibroblaster / cm 2. Tjugofyra timmar efter sådd, celler were inkuberades med 1 | j, m 5-aza-CR under 18 timmar.
Vid slutet av denna behandling, en omfattande förändring av cellfenotyp var synlig (Post 5-aza-CR, Figur 2A). Den typiska långsträckta morfologi obehandlade fibroblaster (T0, figur 2A), ersattes med en rund eller oval form och cellstorleken blev betydligt mindre. Cytoplasma var granulär, tillplattade, och celler vidhäftande till odlingsytan. Kärnor verkade större och vakuoliserade, som en följd av den avslappnade kromatinstrukturen. I vår erfarenhet, är närvaron av dessa morfologiska förändringar viktigt och måste övervakas noga som en markör för effektiviteten av 5-aza-CR behandling.
Efter 18 timmar exponering för 5-aza-CR, en kraftig minskning av den globala DNA-metylering var också tydlig och tydligt av den minskade intensiteten av 5-metylcytidin immunfärgning ( Morfologiska och funktionella förändringar under epigenetisk omvandling av hudfibroblaster i insulinfrisättande cellerna Under det första steget, odlades cellerna under 7 dagar i pankreatiska Basal Medium kompletterat med aktivin A för att främja endoderm engagemang. I detta intervall, celler ytterligare tillplattade och så småningom började att organisera sig i kluster (Dag 7, figur 3A). Därefter tillsattes pankreatisk härstamning differentiering främjas med tillsats av retinsyra i 2 dagar. Som svar på denna behandling, celler ordnas på en retikulära mönster och växte i klart urskiljbara cellaggregat (Dag 10, figur 3A). Klusterbildning process ökade med tiden och ytterligare stimuleras av tredje och sista steget, som bestod av cell exponering för B27, bFGF och ITS. Detta ledde till rekrytering av ett växande antal celler som aggregeras i stora 3D-kolonier (dag 20, figur 3A). Runt dag 36 verkade dessa kolonier som distinkta runda strukturer som påminner om typiska pankreasöar in vitro (Dag 36, figur 3A). Förvärvet av nya EpiCC fenotypen åtföljdes av en gradvis ökning av den globala DNA metylering nivåer som återvände till dem som observerats i obehandlade fibroblaster (5 MC Dag 36 Figur 3B). Efter 36 dagar av pankreas induktion, var effektiviteten av epigenetiska konvertering också av uttrycket av typiska mogna pankreas markörer, som ursprungligen var odetekterbara i obehandlade fibroblaster (T0, Tabell 1: Material lösningar. Tabell 2: Material lösningar.
För att inducera bukspottskörteln differentiering, var 5-aza-CR behandlade fibroblaster exponerades för en tre-steg-protokoll för pancreatic induktion, omedelbart efter 3 h återhämtningsperioden. 
Figur 1: Isolering och karakterisering av humana hudfibroblaster (A) representant bild av fibroblaster växer ut ur vävnadsfragment.. (B) Fibroblaster visar en enhetlig immun positivitet för deras sÄRSKILD markör vimentin (Vim). Kärnor färgas med DAPI. (Skala barer, 100 pm). Klicka här för att se en större version av denna siffra. 
Figur 2: morfologiska och metylering förändringar i humana hudfibroblaster efter 5-aza-CR behandling (A) Representativa bilder av obehandlade fibroblaster visar avlång form (T0), och 5-aza-CR behandlade fibroblaster visar en rund eller oval morfologi, granulerad. cytoplasma, och förstorade och vakuoliserade kärnor (Post 5-aza-CR). (Skala barer, 100 mikrometer). (B) En minskning av den globala DNA-metylering är detekterbar efter 5-aza-CR-behandling (Post 5-aza-CR). (Skala barer, 50 pm). Vänligen click här för att se en större version av denna siffra. 
Figur 3:. Morfologiska och funktionella förändringar under epigenetiska omvandling (A) Representativa bilder av morfologiska förändringar som äger rum under endokrina pankreas differentiering. Efter 7 dagars induktion, mänskliga celler successivt organisera i kluster (dag 7). Som svar på tillsatsen av retinsyra, de ordna i en retikulära mönstret och kluster i särskiljbara aggregat (dag 10). Dessa formationer framsteg med tiden, rekrytera celler och aggregering i stora 3D-kolonier (dag 20). Slutligen kolonier blir sfäriska strukturer som tenderar att lösgöra och flyta fritt i odlingsmediet, som påminner om typiska pankreasöar in vitro (dag 36). (Skala barer, 100 mikrometer). (B) Efter 36 dagar av bukspottskörteln iproduktion, global DNA metylering nivåer av humant EpiCC återgång till de som observerats i obehandlade fibroblaster (5 MC Dag 36). (Skala bar, 50 pm). Samlokalisering av PDX1 med C-PEP är detekterbar i slutet av omställningsperioden (dag 36), medan dessa endokrina pankreas markörer är helt frånvarande i obehandlade fibroblaster (T0). (Skala barer, 100 mikrometer). (C) EpiCC insulinfrisättning som svar på 20 mM D-glukos och 20 mM L-glukos exponering. Staplar representerar medelvärdet ± SD av tre oberoende replikat. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Namn på Material / Utrustning Kvantitet (volym / volym) Kommentarer / Beskrivning Hams F-10 Nutrient Mix 40% DMEM med låg glukos 40% Knockout Serum Byte 10% FBS 5% Antibiotisk antimykotisk lösning 1% L-glutamin-lösning 1% MEM icke-essentiella aminosyror Lösning 1% 2-merkaptoetanol lager 1% 2-merkaptoetanol mäldberedningen: diluite 3,5 ^ il 2-merkaptoetanol i 5 ml steril PBS. Förvara i mörker vid 4 ° C. Obs! Använd inom 2 veckor Nukleosid mix lager 1% nukleosid mix mäldberedningen: lös 0,042 g guanosin, 0,040 g adenosin, 0,036 g cytidin, 0,036 g Uridin och 0,012 g Timidine i 50 ml sterilt vatten. Smälta vid 50 ° C för upplösning. Sterilisera filtratjon och förvara vid 4 ° C ESGRO (LIF) 0,1% Rekombinant humant FGF grundläggande (bFGF) lager 0,1% bFGF mäldberedningen: tillsätt 5 ml 0,1% bovint serumalbumin (BSA) i PBS vid 25 ^ g av bFGF Namn på Material / Utrustning Kvantitet (volym / volym) Kommentarer / Beskrivning DMEM / F-12 93% B-27 Supplement Minus Vitamin A 2% N-2 supplement 1% MEM icke-essentiella aminosyror Lösning 1% Antibiotikumantimykotisk lösning 1% 2-merkaptoetanol lager 1% 2-merkaptoetanol mäldberedningen: diluite 3,5 ^ il 2-merkaptoetanol i 5 ml steril PBS. Förvara i mörker vid 4 ° C. Obs! Använd inom 2 veckor L-glutamin-lösning 1% BSA lager 1% Framställning av BSA lager: lös 250 mg i 50 ml vatten. Sterilisera genom filtrering och förvara vid 4 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Föreliggande manuskript beskriver en metod som möjliggör omvandling av humana hudfibroblaster i insulinproducerande celler, genom en övergående och kort exponering för 5-aza-CR, följt av en vävnadsspecifik induktionsprotokollet. Detta tillvägagångssätt gör en övergång från mesoderm till endoderm relaterade celler, utan tvångs uttryck av transkriptionsfaktorer eller mikroRNA eller förvärvet av en stabil pluripotent tillstånd, som gör cellerna mer instabila och benägna att misstag 14.
I det första steget, är cell plasticitet ökat tack vare en syntetisk epigenetisk modifierings som framkallar en övergående, reversibel tillåtande tillstånd i terminalt differentierade celler. I synnerhet var 5-aza-CR användas för att orsaka en minskning i den globala metylering av hudfibroblastceller. 5-aza-CR är känd för att direkt hämma metyl-transferas-aktivitet och för att förhindra de novo metylering i nyligen syntetiserat DNA. På grund av dess effekt, denna molekyltidigare har använts för att återaktivera tysta gener, såväl som för att modifiera de differentieringstillstånd eukaryota celler 15,16. I överensstämmelse med detta, posta 5-aza-CR hudfibroblaster visade en global DNA demetylering (figur 2A), vilket indikerar 5-aza-CR förmåga att öka plasticitet i de celler som används för föreliggande experiment. Detta är också i överensstämmelse med observationen att 5-aza-CR underlättar uttryck av den höga plasticitet relaterade markör oktober-4 i neurosfärceller (NSCs) 17. Det är dock intressant att notera att placera 5-aza-CR hudfibroblaster återgå till sin ursprungliga fenotyp efter avlägsnande av 5-aza-CR. Faktiskt, som tidigare visade vi att fibroblaster återvände till sitt ursprungliga odlingsmediet, ned reglerat uttryck av pluripotens relaterade faktorer 9,10, vilket tyder på att den högre plasticitet staten förvärvade, som svar på den epigenetiska modifierare, är övergående, reversibel och inte innebär permanenta modifieringar av than celler.
Markerade förändringar i cellmorfologi åtföljs induktionen av en högre plasticitet tillstånd (Figur 2A). De typiska långsträckt cellkropparna hos de obehandlade fibroblastceller ersattes av runda eller ovala celler som presenterade mindre dimensioner och en ökad kärnor volym, som verkade större än den hos differentierade celler. Niwa korrelerade denna kärn utvidgning till en avslappnad kromatinstrukturen beskrivas som en pluripotens relaterad del 18. Närvaron av vakuoliserade kärnor och granulär cytoplasma, såväl som en ökad Lägg samman morfologi, var uppenbara. Alla de morfologiska förändringar som beskrivs kan praktiskt användas som en markör för framgångsrikt slutförande av den första delen av omvandlings protokollet; i vår erfarenhet när förändringarna är närvarande har fem-aza-CR verkligen hjälpt celler att förvärva en mer tillåtande tillstånd.
Det är möjligt att dra nytta av denna övergående "höga permissivity tidsfönster "för att driva celler mot en helt annan fenotyp. demonstrerar Föreliggande protokoll som efter 5-aza-CR fibroblaster kan åter riktar sig till betaceller i bukspottkörteln-liknande celler, som svar på en specifik differentieringsmedium. Det protokoll som används tillåta celler att byta från en mesoderm härledd celltyp till en cellpopulation som hör till endoderm härstamning.
Insulin, som ursprungligen var odetekterbar i obehandlade hudfibroblaster, var positiv vid slutet av differentieringsprotokoll (figur 3B). Detta åtföljdes av samtidig expression av andra faktorer, såsom PDX1, involverade i differentieringen av hela bukspottkörteln - dess exokrina, endokrina och duktal cellpopulationer, bredvid den specifika beta-cellinje. Detta överensstämmer med tidigare arbete om mus embryonala stamceller (ESC), som indikerar att en riktig differentiering till ß-celler uppnåddes bara när omogna celler skiktades med other endokrina celler 19, vilket tyder på att den lokala mikromiljön från bukspottkörtelns Langerhanska öarna arkitektur har en stark funktionell roll.
I själva verket, EpiCC uppnått en mogen differentierad fenotyp och visade förmågan att svara på 20 mM glukos exponering (Figur 3). Insulin utsöndras aktivt i odlingsmediet efter 1 timme av D-glukosstimulering, vilket bekräftar den bona fide natur EpiCC som insulinproducerande ettor (Figur 3C).
Ett distinkt krav för en framgångsrik procedur är den rigorösa underhåll av celler vid 37 ° C, vid alla steg, inklusive deras hantering under sterila laminärt flöde och mikroskopet. Enligt vår erfarenhet är det också rekommenderas att förbereda reagenser nytt, innan deras användning i kultur och uppdatera medel strikt enligt protokollet. Denna operation måste utföras under ett mikroskop sedan bildar aggregerade cellerkan lossna från botten av odlingsskålen och förlorade under mediumbyten.
Den epigenetiska konvertering protokoll har också med framgång tillämpas på svin samt hunden (manuskript inlämnat), med hjälp av samma cellantal / cm 2 och de-metyleringsmedel koncentration beskrivits hos människa.
Avslutningsvis, är ett protokoll som tillåter omvandlingen av hudfibroblaster in i en annan celltyp som presenteras här. Strategin som beskrivs har fördelarna med en epigenetiskt baserade cell konvertering: nämligen möjligheten att undvika ett pluripotent tillstånd som kan lämna bakom celler som kan orsaka cancer, eliminering av exogena genetiska faktorer som kan orsaka kvardröjande förändringar i cellerna. Dessa fördelar gör den nuvarande modellen mycket lovande för translationell medicin applikationer och gör det möjligt för patientspecifika cellterapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av Carraresi Foundation och Europeiska fonden för studien av sockersjuka (EFSD). GP stöds av en post-doc stipendium från universitetet i Milano. Författarna är medlemmar i COST Action FA1201 Epiconcept: Epigenetik och Periconception miljön och COST Action BM1308 Sharing förskott på stora djurmodeller (Salaam). TALB är medlem i COST Action CM1406 Epigenetisk Chemical Biology (EPICHEM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D5652 | PBS; for cell wash and solution preparation |
| Antibiotic Antimycotic Solution | Sigma | A5955 | Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media |
| 100 mm Petri dish | Sarstedt | 83.3902 | For Fibroblast isolation |
| Porcine Gelatin | Sigma | G1890 | For dish coating |
| Water | Sigma | W3500 | For solution preparation |
| 35 mm Petri dishes | Sarstedt | 83.39 | For Fibroblast isolation |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 41966052 | For Fibroblast culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10500064 | FBS; Component of Fibroblast and HP media |
| L-Glutamine solution | Sigma | G7513 | Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | For Fibroblast dissociation |
| KOVA GLASSTIC SLIDE 10 WITH GRIDS | Hycor Biomedical | 87144 | Cell counting |
| 5-Azacytidine | Sigma | A2385 | 5-aza-CR, for increrase cell plasticity in fibroblasts |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Life Technologies | 31550031 | For HP medium |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Life Technologies | 31885023 | For HP medium |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828028 | Component of HP medium |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Life Technologies | 11140035 | Component of HP and Pancreatic Basal media |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | Component of HP and Pancreatic Basal media |
| Guanosine | Sigma | G6264 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Adenosine | Sigma | A4036 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Cytidine | Sigma | C4654 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Uridine | Sigma | U3003 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Thymidine | Sigma | T1895 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Millex-GS 0,22 µm | Millipore | SLGS033SB | For sterilizing of solution |
| FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Life Technologies | PHG0261 | bFGF; Component of HP and Pancreatic Basal medium |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3311 | BSA; Component of Pancreatic Basal medium |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320074 | For Pancreatic Basal medium |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A | Life Technologies | 12587010 | Component of Pancreatic medium |
| N-2 Supplement | Life Technologies | 17502048 | Component of Pancreatic Basal medium |
| Activin A Recombinant Human Protein | Life Technologies | PHG9014 | For Pancreatic medium |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | For Pancreatic medium |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | DMSO; for Retinoic Acid stock preparation |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Life Technologies | 41400045 | ITS; for Pancreatic Final medium |
| Anti-Vimentin antibody | Abcam | ab8069 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100 |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma | 32670 | DAPI. For immunocytochemical analisys. Working dilution 1 µg/ml |
| 5-Methylcytidine | Eurogentec | MMS-900P-B | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500 |
| Anti-C Peptide antibody | Abcam | ab14181 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100 |
| Anti-PDX1 antibody | Abcam | ab47267 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500 |
| Mercodia Insulin ELISA | Mercodia | 10-1113-10 | For insulin release detection |
References
- Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., Melton, D. A. In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells. Nature. 455 (7213), 627-632 (2008).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 51 (6), 987-1000 (1987).
- Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
- Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476, 224-227 (2011).
- Huang, P., et al. Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors. Nature. 475, 386-389 (2011).
- Marro, S., et al. Direct Lineage Conversion of Terminally Differentiated Hepatocytes to Functional Neurons. Cell Stem Cell. 9 (4), 374-382 (2011).
- Pennarossa, G., et al. Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (22), 8948-8953 (2013).
- Pennarossa, G., et al. Reprogramming of Pig Dermal Fibroblast into Insulin Secreting Cells by a Brief Exposure to 5-aza-cytidine. Stem Cell Rev. 10 (1), 31-43 (2014).
- Brevini, T. A., et al. Morphological and Molecular Changes of Human Granulosa Cells Exposed to 5-Azacytidine and Addressed Toward Muscular Differentiation. Stem Cell Rev. 10 (5), 633-642 (2014).
- Thoma, E. C., et al. Chemical conversion of human fibroblasts into functional Schwann cells. Stem Cell Reports. 3 (4), 539-547 (2014).
- Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells. Cell J. 17 (1), 153-158 (2015).
- Plath, K., Lowry, W. E. Progress in understanding reprogramming to the induced pluripotent state. Nat Rev Genet. 12 (4), 253-265 (2011).
- Taylor, S. M., Jones, P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell. 17 (4), 771-779 (1979).
- Glover, T. W., Coyle-Morris, J., Pearce-Birge, L., Berger, C., Gemmill, R. M. DNA demethylation induced by 5-azacytidine does not affect fragile X expression. Am J Hum Genet. 38 (3), 309-318 (1986).
- Do, J. T., Scholer, H. R. Nuclei of embryonic stem cells reprogram somatic cells. Stem Cells. 22 (6), 941-949 (2004).
- Niwa, H. How is pluripotency determined and maintained? Development. 134 (4), 635-646 (2007).
- Kahan, B. W., et al. Pancreatic precursors and differentiated islet cell types from murine embryonic stem cells: an in vitro model to study islet differentiation. Diabetes. 52 (8), 2016-2024 (2003).
